IPC分类号 : A61K9/107,A61K47/36,A61K47/22,A61K47/10,A61K31/513,A61P35/00,C08G81/00
专利摘要
本发明公开了一种兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束及其制备方法，以具有pH敏感性的两亲性壳聚糖为载药胶束，以聚乙二醇为连接臂，分别在其两端接枝叶酸和荧光染料噻唑橙，从而构建得到一种集靶向性、pH敏感性、隐形性和荧光示踪于一体的多功能壳聚糖载药胶束。本发明的壳聚糖载药胶束具有良好的荧光性能，且其对抗癌药5‑氟尿嘧啶具有良好的载药性能，载药效率可达42.76％；在生理环境pH值(pH＝7.4)条件下，8h内累积释放药量仅为2％，26h累积释药量不足8％，可减少壳聚糖载药胶束在输运抗癌药5‑氟尿嘧啶对正常组织细胞的毒副作用。同时，在肿瘤细胞溶酶体pH值(pH＝4.5)条件下，表现出良好的pH敏感释药性能，5‑氟尿嘧啶的释放量在4h时达到95％。
权利要求
1.一种兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束的制备方法，其特征在于，以具有pH敏感性的两亲性壳聚糖OCCC为载药胶束，以聚乙二醇为连接臂，分别通过缩合反应在其两端接枝叶酸和荧光染料噻唑橙，从而构建得到一种集靶向性、pH敏感性、隐形性和荧光示踪于一体的多功能壳聚糖载药胶束。
2.根据权利要求1所述的兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖的合成
称取1质量份的壳聚糖CTS，并将其置于无水甲醇中，在30℃和机械搅条件下进行溶胀；而后向反应液中缓慢滴加2.07-2.48质量份的辛醛，保温反应5-36h后，分六个批次加入硼氢化钠0.5-1质量份的NaBH4，室温下继续还原12-36h，还原反应完成后调节反应液pH值至6-8；反应液抽滤，并用甲醇和去离子水交替洗涤滤饼，而后滤饼经真空干燥后得到淡黄色的N-辛基壳聚糖OC；
称取1质量份的上述N-辛基壳聚糖OC并将其置于反应瓶中，采用无水二甲基亚砜DMSO进行溶胀，在室温条件下向反应瓶中滴加1-2质量份的六氢苯酐C8H10O3，升温至80℃反应12-36h；反应结束后，将反应液倒入去离子水中并置于冰水浴中，并调节反应液pH值至9-10；反应液进行抽滤，将滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后将透析袋中反应液经冷冻干燥即可得黄白色絮状固体N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖OCCC；
(2)聚乙二醇的叶酸接枝物FA-PEG-NH2及噻唑橙接枝物TO-PEG-NH2的合成
以二甲基亚砜为溶剂，称取1质量份的叶酸FA，并以1.38-1.72质量份的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和0.34-0.68质量份的二环己基碳二亚胺DCC为缩合剂，在室温下避光搅拌4h，而后向反应体系中加入3.45-6.90质量份的端氨基聚乙二醇NH2-PEG-NH2，继续搅拌反应8-12h；反应结束后向体系加入去离子水，抽滤除去不溶物，所得滤液离心后进行冷冻干燥；冷冻干燥所得固体产物在氯仿中溶解并进行抽滤，滤液用乙醚进行重结晶，过滤所得析出物再次溶于去离子水中，并再次经冷冻干燥得橘黄色海绵状产物，即聚乙二醇的叶酸接枝物FA-PEG-NH2；
采用同样的合成方法，将上述叶酸FA换成1.38质量份的荧光染料噻唑橙TO，其它反应条件不变，可得红色海绵状固体，即聚乙二醇的噻唑橙接枝物TO-PEG-NH2；
(3)聚乙二醇的丁二酸酐SA接枝物的合成
称取1质量份的步骤(2)中所制备的FA-PEG-NH2并将其溶于无水二甲基亚砜DMSO中，加入0.2-0.3质量份的丁二酸酐SA，室温下搅拌反应，反应结束后向反应液加入0.75-1.5质量份的氯仿，并将反应液滴入冷乙醚中析出桔色不溶物；反应液抽滤，滤饼采用丙酮进行反复洗涤去除残留溶剂及未反应的丁二酸酐，而后将滤饼溶于水并经冷冻干燥得淡黄色海绵状固体，即SA-PEG-FA；
称取1质量份的步骤(2)中所制备的TO-PEG-NH2并将其溶于无水二甲基亚砜DMSO中，加入0.2-0.3质量份的丁二酸酐SA，室温下搅拌反应，反应结束后，反应液经旋蒸浓缩后逐滴滴入冷乙醚中，析出红色不溶物，过滤除去溶剂，滤饼用去离子水进行洗涤除去未反应的丁二酸酐，而后将滤液置于分子量为2000的透析袋中进行透析，而将透析袋中反应液后经冷冻干燥得浅红色海绵状固体，即SA-PEG-TO；
(4)兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束FA-PEG-OCCC-PEG-TO的合成
称取1质量份的步骤(3)中所制备的SA-PEG-FA和1质量份的步骤(3)中所制备的SA-PEG-TO，并将它们在无水二甲基亚砜DMSO中进行溶胀，而后以0.3-0.6质量份的DCC和0.2-0.4质量份的NHS为缩合剂，室温下避光搅拌3-5h；而后向反应液中加入1-2质量份的步骤(1)中所制备的OCCC反应24h；反应结束后，向体系中加入蒸馏水，过滤除去不溶物，所得滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后透析袋中的反应液经冷冻干燥得橘红色海绵状产物，即兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束FA-PEG-OCCC-PEG-TO。
3.根据权利要求1或2所述的兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束的制备方法，其特征在于，所述荧光染料噻唑橙TO的分子结构式如下所示：
4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束。
说明书
技术领域
本发明属于本发明涉及化学及生物医药交叉领域，具体涉及一种兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束及其制备方法。
背景技术
癌症是一类严重危害人类健康的重大疾病，引起了国内外研究学者的广泛关注。在癌症治疗方法中，采用抗癌药进行化学治疗是对癌症患者手术后彻底杀灭体内癌细胞的最有效方法之一。但抗癌药在杀死癌细胞的同时，也对机体内的某些正常器官细胞同样造成严重伤害，并且对某些组织器官如肝、肾、心、肺等也造成损害，严重影响了癌症患者的治愈效果和生活质量。基于此，如何提高抗癌药输运系统的靶向性一直以来是国内外研究学者关注的热点。
理想的载药系统除了能够缩短药物的体内半衰期，延长体内作用时间，使药物被动靶向富集于病灶周围，还应保证最大程度地被肿瘤细胞摄取并在被摄取后将药物迅速释放，这就要求载药胶束系统能够具有更准确的靶向性和定时定点释放性。研究发现，人体内正常细胞的血液环境pH在7.4左右，而肿瘤组织细胞间质呈弱酸性。利用这一特性，研究者们构建了pH敏感型载药胶束，这一载药胶束可靶向作用于肿瘤组织并通过癌细胞的内化作用，经pH为5.5-6.0的内涵体及pH低至4.5-5.0的溶酶体转运，实现靶向给药和定点释药的目的。
随着对肿瘤研究的不断深入，研究者在实现抗癌药的靶向输运和定点释放后，更多地开始关注抗癌药与肿瘤细胞作用过程的动力学特征及机制研究，以获取更多肿瘤细胞繁殖和控制的关键因素。因此，抗癌药与肿瘤细胞的可视化作用及信息的表达显得越来越重要。在众多的生物体信息传感技术中，荧光技术在核酸标记、人体癌细胞的靶向特异性标记、肿瘤诊断、治疗和药物疗效评价等过程中，表现出灵敏、快速、对机体无损伤检测及原位传感癌细胞状态信息等优异特性。
基于上述两点，抗癌药的靶向输运和其与肿瘤细胞作用过程的可视化及原位信息传感的结合，对抗癌药与癌细胞作用规律的揭示、提高疗效和减少患者机体损伤均具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对抗癌药输运系统的靶向性需求和抗癌药与肿瘤癌细胞作用过程的可视化需求，提供一种兼具靶向性和荧光特性的pH敏感载药壳聚糖胶束的制备方法，从而构建一种集靶向性、pH敏感性、隐形性和荧光示踪等多功能于一体的壳聚糖载药胶束。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种兼具靶向性和荧光的pH敏感壳聚糖载药胶束的制备方法，该载药壳聚糖胶束以壳聚糖为主体，通过还原胺化反应在其上接枝疏水的辛基链，在以酸敏感β-羧酸酰胺键为连接臂接枝亲水的羧基环己甲酰基，从而构建得到两亲性pH敏感壳聚糖；然后，再以聚乙二醇为连接臂，分别在两亲性pH敏感壳聚糖两端接枝叶酸和荧光染料噻唑橙；利用叶酸的靶向性、连接臂聚乙二醇的“隐形效应”和两亲性壳聚糖的pH敏感性，提高壳聚糖载药胶束的靶向性；利用荧光染料噻唑橙的荧光特性，实现壳聚糖载药胶束与肿瘤细胞作用过程可视化。
具体地说，包括以下步骤:
(1)N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖的合成
称取1质量份的壳聚糖(CTS)，并将其置于无水甲醇(MeOH)中，在30℃和机械搅条件下进行溶胀；而后向反应液中缓慢滴加2.07-2.48质量份的辛醛，保温反应5-36h后，分六个批次加入硼氢化钠0.5-1质量份的NaBH4，室温下继续还原12-36h，还原反应完成后调节反应液pH值至6-8；反应液抽滤，并用甲醇和去离子水交替洗涤滤饼，而后滤饼经真空干燥后得到淡黄色的N-辛基壳聚糖(OC)；
称取1质量份的前述N-辛基壳聚糖(OC)并将其置于反应瓶中，采用无水二甲基亚砜(DMSO)进行溶胀，在室温条件下向反应瓶中滴加1-2质量份的六氢苯酐(C8H10O3)，升温至80℃反应12-36h；反应结束后，将反应液倒入去离子水中并置于冰水浴中，并调节反应液pH值至9-10；反应液进行抽滤，将滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后将透析袋中反应液经冷冻干燥即可得黄白色絮状固体N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖(OCCC)；
(2)聚乙二醇的叶酸接枝物(FA-PEG-NH2)及噻唑橙接枝物(TO-PEG-NH2)的合成
以二甲基亚砜为溶剂，称取1质量份的叶酸(FA)，并以1.38-1.72质量份的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.35-0.70质量份的二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，在室温下避光搅拌4h，而后向反应体系中加入3.45-6.90质量份的端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)，继续搅拌反应8-12h。反应结束后向体系加入去离子水，抽滤除去不溶物，所得滤液离心后进行冷冻干燥；冷冻干燥所得固体产物在氯仿中溶解并进行抽滤，滤液用乙醚进行重结晶，过滤所得析出物再次溶于去离子水中，并再次经冷冻干燥得橘黄色海绵状产物，即聚乙二醇的叶酸接枝物(FA-PEG-NH2)；
采用同样的合成方法，将前述叶酸(FA)换成1.38质量份的荧光染料噻唑橙(TO)，其它反应条件不变，可得红色海绵状固体，即聚乙二醇的噻唑橙接枝物(TO-PEG-NH2)；
(3)聚乙二醇的丁二酸酐(SA)接枝物的合成
称取1质量份的步骤(2)中所制备的FA-PEG-NH2并将其溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入0.2-0.3质量份的丁二酸酐(SA)，室温下搅拌反应，反应结束后向反应液加入0.75-1.5质量份的氯仿，并将反应液滴入冷乙醚中析出桔色不溶物；反应液抽滤，滤饼采用丙酮进行反复洗涤去除残留溶剂及未反应的丁二酸酐，而后将滤饼溶于水并经冷冻干燥得淡黄色海绵状固体，即SA-PEG-FA；
采用上述同样的合成方法，将前述步骤(2)中所制备的FA-PEG-NH2更换为1质量份的步骤(2)中所制备的TO-PEG-NH2，反应步骤及其他原料用量同上；不同在于，反应结束后，反应液经旋蒸浓缩后逐滴滴入冷乙醚中，析出红色不溶物，过滤除去溶剂，滤饼用去离子水进行洗涤除去未反应的丁二酸酐，而后将滤液置于分子量为2000的透析袋中进行透析，而将透析袋中反应液后经冷冻干燥得浅红色海绵状固体，即SA-PEG-TO。
(4)兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束(FA-PEG-OCCC-PEG-TO)的合成
称取1质量份的步骤(3)中所制备的SA-PEG-FA和1质量份的步骤(3)中所制备的SA-PEG-TO，并将它们在无水二甲基亚砜(DMSO)中进行溶胀，而后以0.3-0.6质量份的DCC和0.2-0.4质量份的NHS为缩合剂，室温下避光搅拌3-5h；而后向反应液中加入1-2质量份的步骤(1)中所制备的OCCC反应24h；反应结束后，向体系中加入蒸馏水，过滤除去不溶物，所得滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后透析袋中的反应液经冷冻干燥得橘红色海绵状产物，即兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束(FA-PEG-OCCC-PEG-TO)。
所述荧光染料噻唑橙(TO)的分子结构式如下所示：
本发明的有益效果是：
(1)本发明的壳聚糖载药胶束具有良好的荧光性能，浓度为1mg/mL壳聚糖载药胶束溶液，在480nm的激发波长下，其荧光强度值达到175a.u.。
(2)本发明的壳聚糖载药胶束对抗癌药5-氟尿嘧啶具有良好的载药性能，在浓度为10mg/mL的壳聚糖胶束溶液对5-氟尿嘧啶的载药效率可达42.76％。此外，本发明的壳聚糖载药胶束的pH敏感范围为4.0-4.5，与肿瘤癌细胞溶酶体pH值相近。载药胶束在生理环境pH值(pH＝7.4)条件下，其在8h内累积释放药量仅为2％，26h累积释药量不足8％，从而可减少壳聚糖载药胶束在输运抗癌药5-氟尿嘧啶对正常组织细胞的毒副作用。同时，在肿瘤细胞溶酶体pH(pH＝4.5)条件下，所制备壳聚糖载药胶束表现出良好的pH敏感释药性能，5-氟尿嘧啶的释放量在4h时达到95％。
附图说明
图1为本发明壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC)-PEG-TO的合成路线图。
图2为TO-PEG-(OCCC-2)-PEG-FA在不同pH缓冲溶液中的粒径与透过率图。
图3为生理环境pH(pH＝7.4)条件下TO-PEG-(OCCC-2)-PEG-FA胶束中5-氟尿嘧啶的缓释效果图。
图4为在肿瘤细胞溶酶体pH值(pH＝4.0)条件下TO-PEG-(OCCC-2)-PEG-FA胶束中5-氟尿嘧啶的释放效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的兼具靶向性和荧光的pH敏感壳聚糖载药胶束的构建思想是，以具有pH敏感性的两亲性N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖(OCCC)为载药胶束，以聚乙二醇为连接臂，分别在其两端接枝叶酸和荧光染料噻唑橙，从而构建得到一种集靶向性、pH敏感性、隐形性和荧光示踪于一体的多功能壳聚糖载药胶束。在该壳聚糖载药胶束的制备过程中，先以壳聚糖为主体，通过还原胺化反应在其上接枝疏水的辛基链，在以酸敏感β-羧酸酰胺键为连接臂接枝亲水的羧基环己甲酰基，从而构建得到具有pH敏感特性的两亲性壳聚糖；然后，在端氨基聚乙二醇(H2N-PEG-NH2)分别通过缩合反应接枝叶酸(FA)和荧光染料噻唑橙(TO)制备得到FA-PEG-NH2和TO-PEG-NH2；再者，通过—反应在所制备的FA-PEG-NH2和TO-PEG-NH2的氨基端分别接枝丁二酸酐(SA)而制备得到FA-PEG-SA和TO-PEG-SA；最后，在缩合剂作用下，通过FA-PEG-SA和TO-PEG-SA中的酸酐与两亲性pH敏感壳聚糖上氨基之间的缩合反应，制备得到兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束(FA-PEG-OCCC-PEG-TO)，具体合成路线图如图1所示，其具体制备方法主要包括以下几个步骤：
(1)N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖的合成
称取1质量份的壳聚糖(CTS)，并将其置于无水甲醇(MeOH)中，在30℃和机械搅条件下进行溶胀；而后向反应液中缓慢滴加2.07-2.48质量份的辛醛，保温反应5-36h后，分六个批次加入硼氢化钠0.5-1质量份的NaBH4，室温下继续还原12-36h，还原反应完成后调节反应液pH值至6-8；反应液抽滤，并用甲醇和去离子水交替洗涤滤饼，而后滤饼经真空干燥后得到淡黄色的N-辛基壳聚糖(OC)；
称取1质量份的前述N-辛基壳聚糖(OC)并将其置于反应瓶中，采用无水二甲基亚砜(DMSO)进行溶胀，在室温条件下向反应瓶中滴加1-2质量份的六氢苯酐(C8H10O3)，升温至80℃反应12-36h；反应结束后，将反应液倒入去离子水中并置于冰水浴中，并调节反应液pH值至9-10；反应液进行抽滤，将滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后将透析袋中反应液经冷冻干燥即可得黄白色絮状固体N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖(OCCC)；
(2)聚乙二醇的叶酸接枝物(FA-PEG-NH2)及噻唑橙接枝物(TO-PEG-NH2)的合成
以二甲基亚砜为溶剂，称取1质量份的叶酸(FA)，并以1.38-1.72质量份的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.35-0.70质量份的二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，在室温下避光搅拌4h，而后向反应体系中加入3.45-6.90质量份的端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)，继续搅拌反应8-12h。反应结束后向体系加入去离子水，抽滤除去不溶物，所得滤液离心后进行冷冻干燥；冷冻干燥所得固体产物在氯仿中溶解并进行抽滤，滤液用乙醚进行重结晶，过滤所得析出物再次溶于去离子水中，并再次经冷冻干燥得橘黄色海绵状产物，即聚乙二醇的叶酸接枝物(FA-PEG-NH2)；
采用同样的合成方法，将前述叶酸(FA)换成1.38质量份的荧光染料噻唑橙(TO)，其它反应条件不变，可得红色海绵状固体，即聚乙二醇的噻唑橙接枝物(TO-PEG-NH2)；
(3)聚乙二醇的丁二酸酐(SA)接枝物的合成
称取1质量份的步骤(2)中所制备的FA-PEG-NH2并将其溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入0.2-0.3质量份的丁二酸酐(SA)，室温下搅拌反应，反应结束后向反应液加入0.75-1.5质量份的氯仿，并将反应液滴入冷乙醚中析出桔色不溶物；反应液抽滤，滤饼采用丙酮进行反复洗涤去除残留溶剂及未反应的丁二酸酐，而后将滤饼溶于水并经冷冻干燥得淡黄色海绵状固体，即SA-PEG-FA；
采用上述同样的合成方法，将前述步骤(2)中所制备的FA-PEG-NH2更换为1质量份的步骤(2)中所制备的TO-PEG-NH2，反应步骤及其他原料用量同上；不同在于，反应结束后，反应液经旋蒸浓缩后逐滴滴入冷乙醚中，析出红色不溶物，过滤除去溶剂，滤饼用去离子水进行洗涤除去未反应的丁二酸酐，而后将滤液置于分子量为2000的透析袋中进行透析，而将透析袋中反应液后经冷冻干燥得浅红色海绵状固体，即SA-PEG-TO。
(4)兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束(FA-PEG-OCCC-PEG-TO)的合成
称取1质量份的步骤(3)中所制备的SA-PEG-FA和1质量份的步骤(3)中所制备的SA-PEG-TO，并将它们在无水二甲基亚砜(DMSO)中进行溶胀，而后以0.3-0.6质量份的DCC和0.2-0.4质量份的NHS为缩合剂，室温下避光搅拌3-5h；而后向反应液中加入1-2质量份的步骤(1)中所制备的OCCC反应24h；反应结束后，向体系中加入蒸馏水，过滤除去不溶物，所得滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后透析袋中的反应液经冷冻干燥得橘红色海绵状产物，即兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束(FA-PEG-OCCC-PEG-TO)。
实施例1
以制备OC过程中保温时间为5h所制备的OC-1为壳聚糖为主体所制备的壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-1)-PEG-TO为例
称取4g壳聚糖(CTS)，并将其置于无水甲醇(MeOH)中，在30℃和机械搅条件下进行溶胀；而后向反应液中缓慢滴加10mL的辛醛，保温反应5h后，分六个批次加入硼氢化钠2g NaBH4，室温下继续还原12h，还原反应完成后调节反应液pH值至6-8；反应液抽滤，并用甲醇和去离子水交替洗涤滤饼，而后滤饼经真空干燥后得到淡黄色的N-辛基壳聚糖(OC)；称取1g前述N-辛基壳聚糖(OC)并将其置于反应瓶中，采用无水二甲基亚砜(DMSO)进行溶胀，在室温条件下向反应瓶中滴加1g六氢苯酐，升温至80℃反应12h；反应结束后，将反应液倒入去离子水中并置于冰水浴中，并调节反应液pH值至9-10；反应液进行抽滤，将滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后将透析袋中反应液经冷冻干燥即可得黄白色絮状固体N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖(OCCC)；
以二甲基亚砜为溶剂，称取0.58g叶酸(FA)，并以0.8g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.2g二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，在室温下避光搅拌4h，而后向反应体系中加入2g端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)，继续搅拌反应8h。反应结束后向体系加入去离子水，抽滤除去不溶物，所得滤液离心后进行冷冻干燥；冷冻干燥所得固体产物在氯仿中溶解并进行抽滤，滤液用乙醚进行重结晶，过滤所得析出物再次溶于去离子水中，并再次经冷冻干燥得橘黄色海绵状产物，即聚乙二醇的叶酸接枝物(FA-PEG-NH2)；采用同样的合成方法，将前述叶酸(FA)换成0.8g荧光染料噻唑橙(TO)，其它反应条件不变，可得红色海绵状固体，即聚乙二醇的噻唑橙接枝物(TO-PEG-NH2)；
称取2g所制备的FA-PEG-NH2并将其溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入0.4g丁二酸酐(SA)，室温下搅拌反应，反应结束后向反应液加入1mL氯仿，并将反应液滴入冷乙醚中析出桔色不溶物；反应液抽滤，滤饼采用丙酮进行反复洗涤去除残留溶剂及未反应的丁二酸酐，而后将滤饼溶于水并经冷冻干燥得淡黄色海绵状固体，即SA-PEG-FA；采用上述同样的合成方法，将前述FA-PEG-NH2更换为2g所制备的TO-PEG-NH2，反应步骤及其他原料用量同上；不同在于，反应结束后，反应液经旋蒸浓缩后逐滴滴入冷乙醚中，析出红色不溶物，过滤除去溶剂，滤饼用去离子水进行洗涤除去未反应的丁二酸酐，而后将滤液置于分子量为2000的透析袋中进行透析，而将透析袋中反应液后经冷冻干燥得浅红色海绵状固体，即SA-PEG-TO。
称取1.2g所制备的SA-PEG-FA和1.2g SA-PEG-TO，并将它们在无水二甲基亚砜(DMSO)中进行溶胀，而后以0.36g DCC和0.24g NHS为缩合剂，室温下避光搅拌3h；而后向反应液中加入1.2g之前所制备的OCCC反应24h；反应结束后，向体系中加入蒸馏水，过滤除去不溶物，所得滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后透析袋中的反应液经冷冻干燥得橘红色海绵状产物，即兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-1)-PEG-TO。
实施例2
以制备OC过程中保温时间为8h所制备的OC-2为壳聚糖为主体所制备的壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO为例
称取4g壳聚糖(CTS)，并将其置于无水甲醇(MeOH)中，在30℃和机械搅条件下进行溶胀；而后向反应液中缓慢滴加11.5mL的辛醛，保温反应8h后，分六个批次加入硼氢化钠2g NaBH4，室温下继续还原20h，还原反应完成后调节反应液pH值至6-8；反应液抽滤，并用甲醇和去离子水交替洗涤滤饼，而后滤饼经真空干燥后得到淡黄色的N-辛基壳聚糖(OC)；称取1g前述N-辛基壳聚糖(OC)并将其置于反应瓶中，采用无水二甲基亚砜(DMSO)进行溶胀，在室温条件下向反应瓶中滴加1.2g六氢苯酐，升温至80℃反应20h；反应结束后，将反应液倒入去离子水中并置于冰水浴中，并调节反应液pH值至9-10；反应液进行抽滤，将滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后将透析袋中反应液经冷冻干燥即可得黄白色絮状固体N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖(OCCC)；
以二甲基亚砜为溶剂，称取0.58g叶酸(FA)，并以0.85gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.36g二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，在室温下避光搅拌4h，而后向反应体系中加入3g端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)，继续搅拌反应10h。反应结束后向体系加入去离子水，抽滤除去不溶物，所得滤液离心后进行冷冻干燥；冷冻干燥所得固体产物在氯仿中溶解并进行抽滤，滤液用乙醚进行重结晶，过滤所得析出物再次溶于去离子水中，并再次经冷冻干燥得橘黄色海绵状产物，即聚乙二醇的叶酸接枝物(FA-PEG-NH2)；采用同样的合成方法，将前述叶酸(FA)换成0.8g荧光染料噻唑橙(TO)，其它反应条件不变，可得红色海绵状固体，即聚乙二醇的噻唑橙接枝物(TO-PEG-NH2)；
称取2g所制备的FA-PEG-NH2并将其溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入0.5g丁二酸酐(SA)，室温下搅拌反应，反应结束后向反应液加入1.5mL氯仿，并将反应液滴入冷乙醚中析出桔色不溶物；反应液抽滤，滤饼采用丙酮进行反复洗涤去除残留溶剂及未反应的丁二酸酐，而后将滤饼溶于水并经冷冻干燥得淡黄色海绵状固体，即SA-PEG-FA；采用上述同样的合成方法，将前述FA-PEG-NH2更换为2g所制备的TO-PEG-NH2，反应步骤及其他原料用量同上；不同在于，反应结束后，反应液经旋蒸浓缩后逐滴滴入冷乙醚中，析出红色不溶物，过滤除去溶剂，滤饼用去离子水进行洗涤除去未反应的丁二酸酐，而后将滤液置于分子量为2000的透析袋中进行透析，而将透析袋中反应液后经冷冻干燥得浅红色海绵状固体，即SA-PEG-TO。
称取1.2g所制备的SA-PEG-FA和1.2g SA-PEG-TO，并将它们在无水二甲基亚砜(DMSO)中进行溶胀，而后以0.48g DCC和0.32g NHS为缩合剂，室温下避光搅拌4h；而后向反应液中加入2g之前所制备的OCCC反应24h；反应结束后，向体系中加入蒸馏水，过滤除去不溶物，所得滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后透析袋中的反应液经冷冻干燥得橘红色海绵状产物，即兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO。
实施例3
以制备OC过程中保温时间为36h所制备的OC-3为壳聚糖为主体所制备的壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-3)-PEG-TO为例
称取4g壳聚糖(CTS)，并将其置于无水甲醇(MeOH)中，在30℃和机械搅条件下进行溶胀；而后向反应液中缓慢滴加12mL的辛醛，保温反应36h后，分六个批次加入硼氢化钠4g NaBH4，室温下继续还原36h，还原反应完成后调节反应液pH值至6-8；反应液抽滤，并用甲醇和去离子水交替洗涤滤饼，而后滤饼经真空干燥后得到淡黄色的N-辛基壳聚糖(OC)；称取1g前述N-辛基壳聚糖(OC)并将其置于反应瓶中，采用无水二甲基亚砜(DMSO)进行溶胀，在室温条件下向反应瓶中滴加2g六氢苯酐，升温至80℃反应36h；反应结束后，将反应液倒入去离子水中并置于冰水浴中，并调节反应液pH值至9-10；反应液进行抽滤，将滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后将透析袋中反应液经冷冻干燥即可得黄白色絮状固体N-辛基-N’-(2-羧基环己甲酰基)壳聚糖(OCCC)；
以二甲基亚砜为溶剂，称取0.58g叶酸(FA)，并以1g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.4g二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，在室温下避光搅拌4h，而后向反应体系中加入4g端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)，继续搅拌反应12h。反应结束后向体系加入去离子水，抽滤除去不溶物，所得滤液离心后进行冷冻干燥；冷冻干燥所得固体产物在氯仿中溶解并进行抽滤，滤液用乙醚进行重结晶，过滤所得析出物再次溶于去离子水中，并再次经冷冻干燥得橘黄色海绵状产物，即聚乙二醇的叶酸接枝物(FA-PEG-NH2)；采用同样的合成方法，将前述叶酸(FA)换成0.8g荧光染料噻唑橙(TO)，其它反应条件不变，可得红色海绵状固体，即聚乙二醇的噻唑橙接枝物(TO-PEG-NH2)；
称取2g所制备的FA-PEG-NH2并将其溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入0.6g丁二酸酐(SA)，室温下搅拌反应，反应结束后向反应液加入2mL氯仿，并将反应液滴入冷乙醚中析出桔色不溶物；反应液抽滤，滤饼采用丙酮进行反复洗涤去除残留溶剂及未反应的丁二酸酐，而后将滤饼溶于水并经冷冻干燥得淡黄色海绵状固体，即SA-PEG-FA；采用上述同样的合成方法，将前述FA-PEG-NH2更换为2g所制备的TO-PEG-NH2，反应步骤及其他原料用量同上；不同在于，反应结束后，反应液经旋蒸浓缩后逐滴滴入冷乙醚中，析出红色不溶物，过滤除去溶剂，滤饼用去离子水进行洗涤除去未反应的丁二酸酐，而后将滤液置于分子量为2000的透析袋中进行透析，而将透析袋中反应液后经冷冻干燥得浅红色海绵状固体，即SA-PEG-TO。
称取1.2g所制备的SA-PEG-FA和1.2g SA-PEG-TO，并将它们在无水二甲基亚砜(DMSO)中进行溶胀，而后以0.72g DCC和0.48g NHS为缩合剂，室温下避光搅拌5h；而后向反应液中加入2.4g之前所制备的OCCC反应24h；反应结束后，向体系中加入蒸馏水，过滤除去不溶物，所得滤液置于分子量为3500的透析袋中进行透析，而后透析袋中的反应液经冷冻干燥得橘红色海绵状产物，即兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-3)-PEG-TO。
实施例4
以实施例2中所制备的壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO为例测定其荧光性能和pH敏感特性。
将实施例2中所制备的壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO配置成浓度为1mg/mL的溶液，取溶液10mL并将其超声分散后采用荧光分光光度计测定其荧光谱，激发波长为480nm；测试结果发现，所制备壳聚糖载药胶束的荧光发射波长为539nm，其荧光强度为175a.u.。
为测定壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO的pH敏感特性，将其配制浓度为10mg/mL的溶液，取1ml溶液分别滴加至8mL pH＝7.4，7.0，6.5，6.0，5.5，5.0，4.5，4.0的磷酸盐缓冲溶液中，而后通过紫外-可见分光光度计测定溶液在500nm处的透过率，并用Nano Zeta Sizer电位粒径仪测定空白胶束的粒径，以溶液透过率和胶束粒径大小来对胶束pH敏感特性进行测定，结果如图2所示。可以发现，当缓冲溶液的pH值降低至4-4.5时，溶液透过率出现骤然降低的现象，下降至10％左右，且胶束粒径也出现突然增大的现象，由500nm左右直接增加到4000nm，说明所制备的壳聚糖载药胶束在溶液pH值为4-4.5时，其胶束结构遭到破坏，开始从水溶液中析出并凝聚成絮状物。上述实验结果说明所制备的壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO的pH响应范围为4-4.5。
实施实例5
以实施例2中所制备的壳聚糖载药胶束FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO为例测定其载药和pH敏感释药特性。
采用pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，分别配制浓度为1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL的三组FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO溶液各10mL，并分别向其中加入10mg 5-氟尿嘧啶，超声分散5h后分别移入透析袋(Mw＝3500)置于200mL磷酸盐缓冲溶液里室温下透析40h除去游离5-氟尿嘧啶，每10h换透析液一次，并分别于20h，30h，40h取样透析介质，通过紫外分光光度计测定溶液在265nm处的吸光度A，按回归方程计算溶液中5-氟尿嘧啶浓度，直至不再透析出游离5-氟尿嘧啶，取出透析袋内液体得到载药胶束溶液。测定所得载药胶束溶液在265nm处的吸光度A，计算载药量。结果发现，1mg/mL、5mg/mL和10mg/mL的三组FA-PEG-(OCCC-2)-PEG-TO溶液对抗癌药5-氟尿嘧啶的载药效率依次为8.67％，17.56％和42.76％。
取4mL制得的浓度为10mg/mL的载药胶束溶液两份移入两个透析袋(Mw＝3500)分别置于20mL的pH＝7.4和pH＝4.5的磷酸盐缓冲溶液中，恒温37±0.5℃透析48h，并分别于2h，4h，8h，12h，16h，20h，26h，40h，48h抽取透析袋外液体3mL，并立即补充等温等pH磷酸盐缓冲液3mL。紫外分光光度计测定抽取溶液在265nm处的吸光度，根据线性回归方程计算释药量，并对时间t作图，测试结果如图3和图4所示。
从图3中可以看出，所制备的壳聚糖载药胶束在生理环境pH值(pH＝7.4)条件下，其在8h内累积释放药量仅为2％，26h累积释药量不足8％；对比图4可以看出，在肿瘤细胞溶酶体pH值(pH＝4.5)条件下，所制备壳聚糖载药胶束表现出良好的pH敏感释药性能，其累积药物释放量在1.5h已达到85％，4h的累积药物释放量最终达到95％，表现出良好pH敏感释药性能。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
一种兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束及其制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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