专利摘要

本发明公开了一种骨肉瘤细胞抑制剂及制备方法，其将Co(NO3)2•6H2O、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷（bims）、5-硝基间苯二甲酸（nipa）按照摩尔比为2~4:1~2:1的配比称量好；将水放入容器中，在空气中搅拌15~20min；然后将搅拌后的原料液放入反应釜中，封盖，升温至150~170℃后进行保温反应110~130h；再采用梯度降温法将其降至室温，得到红色块状晶体配合物[Co2(nipa)(bims)2]n，即得到骨肉瘤细胞抑制剂。本发明的骨肉瘤细胞抑制剂具有稳定性好，抑制能力强的特点，为抗骨肉瘤药物的研发提供了指导。

权利要求

1.一种骨肉瘤细胞抑制剂，其特征在于：所述骨肉瘤细胞抑制剂结构式为：

所述骨肉瘤细胞抑制剂的晶体结构属于单斜晶系，C2/c空间群，其晶胞参数为：a为b为c为α为90°，β为129～130°，γ为90°。

2.根据权利要求1所述的骨肉瘤细胞抑制剂，其特征在于：所述骨肉瘤细胞抑制剂分子量为910～912，熔点为290～295℃，粘度为1.01～1.03mm–1，密度为1.54～1.56g cm–3。

3.根据权利要求1所述的骨肉瘤细胞抑制剂，其特征在于：所述骨肉瘤细胞抑制剂为红色块状晶体。

4.一种制备权利要求1至3任一所述的骨肉瘤细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：它的制备方法包括如下步骤：

(1)将原料Co(NO3)2·6H2O、1,3-双(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷、5-硝基间苯二甲酸按照摩尔比为2～4:1～2:1的配比称量好；

(2)将称量好的原料投入容器中，加入水搅拌15～20min，搅拌速度为200～600r/min，形成均匀的原料液；水与原料总体积的体积比为10～20:1；

(3)将搅拌均匀的原料液转入反应釜中，封盖，升温至160～165℃后进行保温反应120～125h；

(4)反应完成之后，采用梯度降温法将其降至室温，得到红色块状晶体的配合物，即骨肉瘤细胞抑制剂。

5.根据权利要求4所述的骨肉瘤细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述梯度降温法为：先降低10℃，保持20～30min；然后再降低10℃，保持20～30min；依此循环降至室温。

6.根据权利要求4所述的骨肉瘤细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述1,3-双(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷的制备方法为先按2,2′-硫代二乙酸与邻苯二胺摩尔比为1:2分别称取2,2′-硫代二乙酸和邻苯二胺，再加入多聚磷酸，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统中，在功率为200～250w，温度为80～110℃下反应10～15min；然后在功率为300～350w，温度为100～120℃下反应10～15min，反应完毕后，得到深蓝色溶液，再用氢氧化钠调溶液pH至13～14，产生白色沉淀，再加入活性碳，白色沉淀变浅黄色沉淀，溶液变成黄色，经过抽滤，洗涤2～3次，然后在80～100℃干燥箱中干燥20～30min，得到粗产品，再用DMF重结晶，得到浅黄色粉状的1,3-双(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷。

7.权利要求1所述的骨肉瘤细胞抑制剂在制备抗骨肉瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物，尤其涉及一种骨肉瘤细胞抑制剂及制备方法。

背景技术

骨肉瘤是原发性恶性骨肿瘤中最多见的恶性度极高的肿瘤，多见于青少年，起源于原始间充质细胞的成骨细胞类，故又称之为成骨肉瘤。80％发生于股骨远端及胫骨近端，即膝关节周围，多位于干骺端，偶见于骨干。病因学研究显示，一些理化因素(如放射)、病毒及遗传因素(如染色体畸形、P53、RB基因异常改变)等均与骨肉瘤的发生有密切关系。

骨肉瘤的主要表现是患肢疼痛、关节功能障碍。肿瘤局部皮肤发热，静脉怒张，可触及局部肿块。骨肉瘤生长迅速，病程进展极快。当有溶骨发生时，可引起病理性骨折。骨肉瘤破坏骨组织，并向骨外侵犯。

目前常用治疗方案为手术治疗+新辅助化疗，新辅助化疗的产生促进了保肢手术，可减少复发率，但根治效果并不十分理想，转移发生率高。其原因首先在于骨肉瘤极易出现远处转移，如果在仅行手术切除治疗，骨肉瘤的远处转移率可达80％，大多发生在术后3~6个月之内；其次在于骨肉瘤对化疗的耐药性，近年来骨肉瘤的化疗总体有效率仍然徘徊在60％左右，而制约骨肉瘤化疗疗效的一个主要原因就是骨肉瘤细胞对化疗的耐药性。而在临床上，化疗已成为骨肉瘤综合治疗中不可缺少的一种手段。骨肉瘤对化疗药物的耐药性分为内在耐药和获得性耐药两类。前者是肿瘤细胞在治疗的初始阶段即对多种抗肿瘤药物无明显反应；后者在化疗初期效果较好，但经过若干疗程后，肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生了耐药性。与其他肿瘤不同，骨肉瘤对化疗的耐药主要表现为内在性耐药，其主要原因可能是骨肉瘤细胞其DNA损伤修复功能增强。这无疑进一步加大了临床上治疗的难度。以上问题的解决都需要研究人员对骨肉瘤的发病机制做出更加深入的探索，从而阐明相关分子机制，为骨肉瘤的治疗提供有效的靶点。因此寻找能够抑制骨肉瘤细胞的生长扩散，甚至使其死亡的药物或抑制剂是一种研究趋势，同时对人体的毒副作用小。

发明内容

本发明的目的就是提供一种骨肉瘤细胞抑制剂及制备方法。该抑制剂具有稳定性好，抑制能力强的特点，能为抗骨肉瘤药物的研发提供理论指导。

本发明的技术方案：

一种骨肉瘤细胞抑制剂，其结构式为： 其分子量为910~912，熔点为290~295℃，粘度为1.01~1.03mm-1，密度为1.54~1.56g cm-3。

所述骨肉瘤细胞抑制剂为红色块状晶体，其晶体结构属于单斜晶系C2/c空间群，其晶胞参数为：a为26.0~27.0 b为9.8~10.0 c为19.3~19.5 α为90°，β为129~130°，γ为90°。

本发明原料中的1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的制备方法为先按2,2′-硫代二乙酸与邻苯二胺摩尔比为1:2分别称取2,2′-硫代二乙酸和邻苯二胺，再加入多聚磷酸，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统中，在功率为200~250w，温度为80~110℃下反应10~15min；然后在功率为300~350w，温度为100~120℃下反应10~15min，反应完毕后，得到深蓝色溶液，再用氢氧化钠调溶液pH至13~14，产生白色沉淀，再加入活性碳，白色沉淀变浅黄色沉淀，溶液变成黄色，经过抽滤，洗涤2~3次，然后在80~100℃干燥箱中干燥20~30min，得到粗产品，再用DMF重结晶，得到浅黄色粉状的1,3-双(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷。

1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷合成反应原理如下：

原料中的1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷，分子式为C16H14N4S，分子量为294.38，熔点：285~305℃，浅黄色粉末，化学结构式：

原料中的5-硝基间苯二甲酸，中文别名：5-硝基异酞酸，5-硝基-1,3-苯二甲酸；分子式：C8H5NO6，分子量211.13，熔点：260~264℃，用途：用作诊断用药新泛影(X光造影剂)中间体及用作分散染料的中间体。其结构式为：

本发明骨肉瘤细胞抑制剂的制备方法，它的制备方法包括如下步骤：

（1）将原料Co(NO3)2·6H2O、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷（bims）、5-硝基间苯二甲酸（nipa）按照摩尔比为2~4:1~2:1的配比称量好；

（2）将称量好的原料投入容器中，加入水搅拌15~20min，搅拌速度为200~600r/min，形成均匀的原料液；水与原料总体积的体积比为10~20:1；

（3）将搅拌均匀的原料液转入反应釜中，封盖，升温至160~165℃后进行保温反应120~125h；

（4）反应完成之后，采用梯度降温法将其降至室温，得到红色块状晶体的配合物[Co2(nipa)(bims)2]n，即骨肉瘤细胞抑制剂。其红外光谱(KBr压片,cm-1)见图1。

所述梯度降温法为：先降低10℃，保持20~30min,然后再降低10℃，保持20~30min；依此循环降至室温。

本发明的抑制剂的制备中的化学反应式：

反应过程中，Co2+分别与一个来自5-硝基间苯二甲酸配体的羧基氧原子、三个来自1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷配体的氮原子和一个来自1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷配体的硫原子配位。

本发明抑制剂及其各组分在骨肉瘤细胞抑制中的作用：

抑制剂的作用：可能与DNA上附近鸟嘌呤结合，或可能通过结合蛋白质的琉基位点抑制DNA合成。

Co2+的作用：与DNA上的磷酸氧位点或碱基氮、氧位点直接螯合，引起癌细胞的DNA损伤，可以阻碍细胞分裂并通过裂解DNA而诱导癌细胞凋亡。

1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的作用：（1）它的苯并咪唑环易与DNA表面形成π-π堆积作用而使抑制剂的抑制能力增强；（2）配体的受体效应增加了金属离了的有效价态，使其水解速率下降；（3）增加了与DNA的疏水或嵌入相互作用，使共价结合变得更容易;(3)配体的几何效应可能引起(或阻碍)蛋白质与核酸的结合。

5-硝基间苯二甲酸基的作用：它的桥联单齿的羧酸根上未配位的氧原子(O4)与1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷中的未配位的咪唑氮原子(N4)形成的氢键[N4-H4…O4(2.670 )]堆垛成有趣的二维网状超分子结构，使抑制剂的抑制能力增强。

本发明的骨肉瘤细胞抑制剂在制备抗骨肉瘤药物及抗骨肉瘤药物分析中的应用，为抗骨肉瘤药物的研发提供了技术指导。

本发明的有益效果：

（1）本发明制备骨肉瘤细胞抑制剂的方法简单易行。

（2）本发明的骨肉瘤细胞抑制剂具有稳定性好的特点。该抑制剂进入人体以后，可稳定地输送一定距离，接近肿瘤部位时穿过细胞膜进入细胞；因其稳定性小于过渡金属，解离为金属离子和配体，与细胞DNA中的配位原子作用，破坏癌细胞DNA的复制能力、阻断癌细胞分裂。

（3）本发明的骨肉瘤细胞抑制剂能够有效抑制骨肉瘤细胞的生长，为抗骨肉瘤药物的研发提供技术指导。

附图说明

图1为本发明的骨肉瘤细胞抑制剂的红外光谱图。从图1中可知：配合物在3087cm-1附近的宽吸收峰可指认为ν(O-H)的伸缩振动。配合物的ν(C-N)位于1364cm-1处，其苯环的骨架伸缩振动位于1628cm-1处，而它在1077cm-1和1264cm-1的吸收峰可分别指认为ν(C-O-C)的对称和不对称伸缩振动。

图2为本发明的骨肉瘤细胞抑制剂中的1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的红外光谱图。从图2中可知：1,3-二(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷的ν(C-N)在1332cm-1和1273cm-1处，而1675和1606cm-1处的吸收峰可指认为它的苯环的骨架伸缩振动。

图3为本发明的骨肉瘤细胞抑制剂的金属离子配位环境图，在图3中，Co2+分别与一个来自5-硝基间苯二甲酸配体的羧基氧原子、三个来自1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷配体的氮原子和一个来自1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷配体的硫原子配位；

图4为本发明的骨肉瘤细胞抑制剂的一维链图，在图4中，每个1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷配体采用螯合三齿及桥联单齿配位模式连接两个Co(II)离子形成双核Co2N6S2；5-硝基间苯二甲酸配体采用双单齿桥联配位模式连接双核Co2N6S2形成一维波浪形链结构，每个1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷配体几乎垂直于该链；

图5为本发明骨肉瘤细胞抑制剂的二维图，在图5中，邻近的链通过Co-N形成平行于ab平面且含有32圆环（A环）的二维波浪形层结构。

图6为本发明骨肉瘤细胞抑制剂、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷和5-硝基间苯二甲酸配体对四种人肿瘤细胞MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela(宫颈癌细胞)和MG-63(骨肉瘤细胞)的抑制率图。

图7为本发明骨肉瘤细胞抑制剂、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷和5-硝基间苯二甲酸配体对四种人肿瘤细胞MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela(宫颈癌细胞)和MG-63(骨肉瘤细胞)的IC50图。

图8为本发明骨肉瘤细胞抑制剂-DNA复合体系的紫外吸收光谱图（抑制剂的浓度为2.0×10-5mol/L，[DNA]/[抑制剂]=0to 10）。

图9为在0.1mol/L缓冲溶液(pH=7.35)下，抑制剂-DNA复合体系的荧光光谱图（λex=312nm，λem=363nm）。

图10为本发明骨肉瘤细胞抑制剂-DNA复合体系的粘度图（t=30℃）。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

一、本发明的制备方法：

（1）1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的制备：

分别称取2,2′-硫代二乙酸10mmol和邻苯二胺20mmol，再加入10ml多聚磷酸，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统中，在功率为200w，温度为100℃下反应10min；然后在功率为300w，温度为100℃下反应10min，反应完毕后，得到深蓝色溶液，再用氢氧化钠调溶液pH至13~14，产生白色沉淀，再加入活性碳，白色沉淀变浅黄色，溶液变成黄色，经过抽滤，用蒸馏水洗涤2~3次，然后在80℃干燥箱中干燥30min，得到粗产品，再用DMF重结晶，得到浅黄色粉状的1,3-双(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷，将其采用红外光谱测定，得到的红外光谱图如图2所示。

（2）将Co(NO3)2·6H2O（0.5mmol）、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷（0.25mmol）、5-硝基间苯二甲酸（0.25mmol）和15mL水放在烧杯中，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为20min，搅拌速度为300r/min。

（3）将搅拌后的原料液放入体积为23mL带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到160℃并保持120小时。

（4）用梯度降温法先降低至150℃，保持30min,然后再降低至140℃，保持30min；依此循环降至室温，得到红色块状晶体，即得到骨肉瘤细胞抑制剂。，将其采用红外光谱测定，得到的红外光谱图如图1所示。

二、产品检验：

将得到的骨肉瘤细胞抑制剂采用X-射线单晶衍射检测，得到图3~5和表1。

表1配合物（抑制剂）的晶体数据

三、产品性能检测方法：

（1）用二甲基亚砜（DMSO）分别将红色块状晶体配合物（骨肉瘤细胞抑制剂）、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷和5-硝基间苯二甲酸配成2.0×10-3mol/L的储备液，缓冲溶液(pH=7.35)为0.1mol·L-1的三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl），MTT试剂（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）的浓度为5mg/mL。

（2）MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela（宫颈癌细胞）和MG-63（骨肉瘤细胞）细胞株均置于37℃、5%CO2充分湿化条件下的培养箱中，接种于含10%灭活新生牛血清的PPMI1640培养液中培养。

（3）将所有化合物配制成10μg/mL，助溶剂DMSO终浓度不超过1%，测试该浓度下各化合物对癌细胞的抑制率。

（4）取处于对数生长期的细胞，每孔180μL(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5%CO2充分湿化条件下培养24h。

（5）待细胞贴壁后，按每孔20μL的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。

（6）继续培养48h后，每孔加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μLDMSO，轻微震荡反应5-8min，使结晶颗粒充分溶解。（7）空白对照组调零，用酶标仪以490nm波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值( 值)，计算细胞增殖抑制率。可根据公式计算化合物的抑制率：抑制率=（1-加药组OD值/对照组OD值）×100%。

（8）所有实验均重复3次后取平均值。得到本发明的抑制剂和其配体对四种人肿瘤细胞的抑制率如图6和表2所示。

由图6和表2可见，本发明的抑制剂对骨肉瘤细胞具有较好的细胞毒活性，其抑制率为68.45%，大于50%，且比其相应的1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷和5-硝基间苯二甲酸的抑制率大。说明配体在形成配合物（抑制剂）以后，其对癌细胞的抑制作用增强。

表2抑制剂和其配体（10μM，48小时）对四种人癌细胞株的抑制率（%）

实施例2

一、本发明的制备方法：

（1）1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的制备：

分别称取2,2′-硫代二乙酸20mmol和邻苯二胺40mmol，再加入30ml多聚磷酸，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统中，在功率为250w，温度为110℃下反应12min；然后在功率为350w，温度为120℃下反应12min，反应完毕后，得到深蓝色溶液，再用氢氧化钠调溶液pH至13~14，产生白色沉淀，再加入活性碳，白色沉淀变浅黄色，溶液变成黄色，经过抽滤，用蒸馏水洗涤3次，然后在90℃干燥箱中干燥20min，得到粗产品，再用DMF重结晶，得到浅黄色粉状的1,3-双(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷，将其采用红外光谱测定。

（2）将Co(NO3)2·6H2O（1.0mmol）、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷（0.5mmol）、5-硝基间苯二甲酸（0.25mmol）和20mL水放在烧杯中，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为15min，搅拌速度为600r/min。

（3）将搅拌后的原料液放入带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到165℃并保持120小时。

（4）用梯度降温法先降低至155℃，保持30min,然后再降低至145℃，保持30min；依此循环降至室温，得到红色块状晶体，即得到骨肉瘤细胞抑制剂。

二、产品检验

检验方法同实施例1，其晶体参数测定如表3所示

表1配合物（抑制剂）的晶体数据

三、产品性能检测方法：

（1）用二甲基亚砜（DMSO）分别将红色块状晶体配合物骨肉瘤细胞抑制剂、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷和5-硝基间苯二甲酸配成2.0×10-3mol/L的储备液，缓冲溶液(pH=7.35)为0.1mol·L-1的三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl），MTT试剂（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）的浓度为5mg/mL。

（2）MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（肺癌细胞）、Hela（宫颈癌细胞）和MG-63（骨肉瘤细胞）细胞株均置于37℃、5%CO2充分湿化条件下的培养箱中，接种于含10%灭活新生牛血清的PPMI1640培养液中培养。

（3）将所有化合物配制成10μg/mL，助溶剂DMSO终浓度不超过1%，测试该浓度下各化合物对癌细胞的抑制率。

（4）取处于对数生长期的细胞，每孔180μL(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5%CO2充分湿化条件下培养24h。

（5）待细胞贴壁后，按每孔20μL的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。

（6）继续培养48h后，每孔加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μL DMSO，轻微震荡反应5-8min，使结晶颗粒充分溶解。

（7）所有实验均重复3次后取平均值。对初筛抗肿瘤效果好的受试化合物，继续用5个浓度梯度做相应细胞株的IC50值，得到本发明的骨肉瘤细胞抑制剂和其配体对四种人肿瘤细胞的IC50值如图7和表3所示。

由图7和表4可见，该抑制剂能够较好地抑制宫颈癌细胞的生长，其中对MG-63（骨肉瘤细胞）有较小的IC50值（9.31±1.40）。

表4抑制剂和其配体对四种人癌细胞株的IC50(μM).

实施例3

一、本发明的制备方法：

（1）1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的制备：

分别称取2,2′-硫代二乙酸15mmol和邻苯二胺30mmol，再加入20ml多聚磷酸，充分混合均匀后，放入微波快速反应系统中，在功率为220w，温度为80℃下反应15min；然后在功率为320w，温度为110℃下反应15min，反应完毕后，得到深蓝色溶液，再用氢氧化钠调溶液pH至13~14，产生白色沉淀，再加入活性碳，白色沉淀变浅黄色，溶液变成黄色，经过抽滤，洗涤2次，然后在85℃干燥箱中干燥25min，得到粗产品，再用DMF重结晶，得到浅黄色粉状的1,3-双(2-苯并咪唑基)-2-硫代丙烷。

（2）将Co(NO3)2·6H2O（0.5mmol）、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷（0.5mmol）、5-硝基间苯二甲酸（0.25mmol）和20mL水放在烧杯中，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为20min，搅拌速度为400r/min。

（3）将搅拌后的原料液放入体积为23mL带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到160℃并保持120小时。

（4）用梯度降温法先降低至150℃，保持30min,然后再降低至140℃，保持30min；依此循环降至室温，得到红色块状晶体，即得到骨肉瘤细胞抑制剂。

二、产品检验：

检验方法同实施例1。

三、产品性能检测方法：

（1）用10%二甲基亚砜（DMSO）将红色块状晶体配合物骨肉瘤细胞抑制剂配成2.0×10-3mol/L的溶液。

（2）用三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl）缓冲溶液将DNA配成2.0×10-4mol/L的溶液。

（3）在比色皿中加入3mL，2.0×10-5mol/L的配合物溶液，逐次加入1μL，2.0×10-4mol/L的ct-DNA(即小牛胸腺DNA)溶液。

（4）每个混合液摇匀放置5min后，将其置于紫外-可见吸收光谱仪上扫描，结果如图8所示。

由图8可知，随着DNA浓度的增大，抑制剂-DNA复合体系的紫外吸收增加，在285nm处有16nm的红移，增色率为270%。

抑制剂与DNA的键合强度Kb可以通过下列方程式确定：

[DNA]/(εa-εf)＝[DNA]∕(εb-εf)﹢1/[Kb(εb-εf)]

此处，εa,εf和εb分别是DNA的已知浓度，未与抑制剂键合及已与抑制剂键合的相关系数，Kb是抑制剂与DNA的键合常数，[DNA]是DNA在0.1mol/L缓冲溶液(pH=7.35)中的浓度。将[DNA]/(εa-εf)比[DNA]作图，可以得到斜率1∕(εb-εf)和截距1/[Kb(εb-εf)]，斜率和截距之比就可以得到键合常数Kb，该抑制剂的键合常数为1.03×103。由此可见，该抑制剂较强地插入到DNA的碱基对之中。

由上述实施例可知，本发明的骨肉瘤细胞抑制剂具有稳定性好，与癌细胞DNA作用较强的特点，是一种优质的骨肉瘤细胞抑制剂。

实施例4

一、本发明的制备方法：

（1）1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的制备方法同实施例1；

（2）将Co(NO3)2·6H2O（0.5mmol）、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷（0.25mmol）、5-硝基间苯二甲酸（0.25mmol）和15mL水放在烧杯中，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为20min，搅拌速度为300r/min。

（3）将搅拌后的原料液放入体积为23mL带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到160℃并保持120小时。

（4）用梯度降温法先降低至150℃，保持30min,然后再降低至140℃，保持30min；依此循环降至室温，得到红色块状晶体，即得到骨肉瘤细胞抑制剂。

二、产品检验

检验方法同实施例1

三、产品性能检测方法：

（1）用10%二甲基亚砜（DMSO）将红色块状晶体配合物骨肉瘤细胞抑制剂配成2.0×10-3mol/L的溶液。

（2）在比色皿中加入1mL，2.0×10-5mol/L的配合物溶液，1.0mL三羟甲基氨基甲烷—盐酸（Tris-HCl）缓冲溶液（pH=7.35）中，逐次加入1mL的ct-DNA(即小牛胸腺DNA)溶液，使DNA对配合物的浓度逐渐提高。

（3）将上述每个混合液用二次亚沸蒸馏水稀释至5mL后摇匀。摇匀放置5min后，将其置于荧光光谱仪上扫描（λex=312nm，λem=363nm），结果如图9所示。

由图9可见，随着DNA浓度的增加，抑制剂-DNA复合体系的荧光强度增加，当抑制剂/[DNA]=10时，荧光强度最强，分别是无DNA存在时的0.65倍。说明探针是以插入模式与DNA结合的。

实施例5

一、本发明的制备方法：

（1）1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷的制备方法同实施例1；

（2）将Co(NO3)2·6H2O（0.5mmol）、1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷（0.25mmol）、5-硝基间苯二甲酸（0.25mmol）和15mL水放在烧杯中，搅拌均匀形成原料液，搅拌时间为20min，搅拌速度为300r/min。

（3）将搅拌后的原料液放入体积为23mL带聚四氟乙烯内胆的不锈钢反应釜中，封好后放入烘箱，加热到160℃并保持120小时。

（4）用梯度降温法先降低至150℃，保持30min,然后再降低至140℃，保持30min；依此循环降至室温，得到红色块状晶体，即得到骨肉瘤细胞抑制剂。

二、产品检验

检验方法同实施例1

三、产品性能检测方法：

（1）用10%二甲基亚砜（DMSO）将红色块状晶体配合物骨肉瘤细胞抑制剂配成2.0×10-3mol/L的溶液。

（2）测定时溶液体系温度恒定在30℃。

（3）选择相对合适的转速（30RPM）和扭矩。

（4）用微量进样器将定量体积的待测物储液滴加至ct-DNA缓冲液中，按照[抑制剂]/[DNA]=0、0.02、0.04、0.06、0.09、0.12、0.16、0.20的累加比例逐渐滴加。

（5）每次滴加完反应10min待数值稳定记录数据。

（6）以不同化合物的(η/η0)1/3对[抑制剂]/[DNA]的比值作图，结果如图10所示。

由图10可见，随着抑制剂浓度的增大，体系中DNA的粘度逐步增加，当[抑制剂]/[DNA]达到0.014时，相对粘度比值(η/η0)1/3=1.0143，粘度明显增大，这进一步充分证明，抑制剂是通过1,3-双（2-苯并咪唑基）-2-硫代丙烷中的苯并咪唑与DNA碱基对间产生经典插入作用的，只有这种经典而有力的插入作用才能使DNA溶液粘度增大。

一种骨肉瘤细胞抑制剂及制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。