专利摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合酶制备的壳寡糖及其制备方法。本发明提供的复合酶制备的壳寡糖，制备方法包括以下步骤：将壳聚糖溶于醋酸‑醋酸钠缓冲溶液中，然后在壳聚糖溶液中加入复合酶酶液酶解，酶解完成后，将所得到的酶解液过滤后采用透析法透析滤液，最后将所得透析液进行浓缩干燥，即得。该壳寡糖分子量小，聚合度集中，产量高，更加适用于医药，食品，化妆品等领域，并且制备方法操作简便，原料成本低，具有良好的工业推广性和实用性。

权利要求

1.一种复合酶制备的壳寡糖，其特征在于，所述壳寡糖的制备方法包括以下步骤：

S1、将壳聚糖溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成壳聚糖溶液；

S2、向步骤S1所得的壳聚糖溶液中加入复合酶，在45℃~55℃水浴中酶解1 h~3 h，酶解完成后置于沸水浴中，10 min灭活，冷却至室温后用质量浓度为5％的NaOH溶液调整pH=7~9，过滤，弃去滤渣，取滤液；

S3、将S2所得滤液用再生纤维素透析袋透析24 h，每8小时换一次透析液，收集透析液，将收集的透析液加热浓缩后进行喷雾干燥，即得；

所述步骤S1中醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH值为4.5，浓度为0.2 mol/L；

所述步骤S1中配制成的壳聚糖溶液质量浓度为0.5~1.5%；

所述步骤S2中复合酶的质量与壳聚糖的质量比为8~15%，其中复合酶由果胶酶和胃蛋白酶按1:（0.1~1）的重量比组成；

所述步骤S2在50℃水浴环境中酶解2 h；

所述步骤S3中再生纤维素透析袋的截留分子量为3000 Da；

所述步骤S3中喷雾干燥的工艺条件为：进风温度180℃，进料速度700 mL/h。

2.如权利要求1所述的一种复合酶制备的壳寡糖，其特征在于，所述步骤S1中配制成的壳聚糖溶液质量浓度为1%。

3.如权利要求1所述的一种复合酶制备的壳寡糖，其特征在于，所述步骤S2中复合酶的质量与壳聚糖的质量比为10%，其中复合酶由果胶酶和胃蛋白酶按1：0.6的重量比组成。

4.如权利要求1~3任一所述壳寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

I、将壳聚糖溶于pH值为4.5，浓度为0.2 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.5~1.5%壳聚糖溶液；

II、向步骤I所得的壳聚糖溶液中加入果胶酶和胃蛋白酶按1：（0.1~1）的重量比组成的复合酶，复合酶的质量与壳聚糖的质量比为8~15%，在45℃~55℃水浴中酶解1 h~3 h，酶解完成后置于沸水浴中，10 min灭活，冷却至室温后用质量浓度为5％的NaOH溶液调整pH=7~9，过滤，弃去滤渣，取滤液；

III、将步骤II所得滤液用截留分子量为3000 Da的再生纤维素透析袋透析24 h，每8小时换一次透析液，收集透析液，将收集的透析液加热浓缩后，在工艺条件为进风温度180℃，进料速度700 mL/h下进行喷雾干燥，即得。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合酶制备的壳寡糖及其制备方法。

背景技术

壳寡糖是壳聚糖降解至一定程度后的产物，与壳聚糖相比，壳寡糖具有更好的水溶性，且在生理条件下粘度较低，这是由于壳寡糖的糖链更短以及有大量游离的氨基基团。壳寡糖的糖苷残基重复单元中含有一个氨基基团和两个羟基基团，是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖。壳寡糖的这些特性引起了越来越多研究者的关注。已经有很多文献报道了壳寡糖的生物活性，如抗氧化、消炎、拮抗微生物、降低胆固醇和增强免疫活性、抗肿瘤的活性等。

目前生产壳寡糖的方法主要有三种：化学法、物理法及酶解法。酶法降解壳聚糖是使用专一性酶或非专一性酶来降解壳聚糖的方法。专一性酶虽降解效率好，但大部分来源于真菌细胞或人工合成，如全基因合成方法合成的强烈炽热球菌几丁质酶。如果用于工业化大规模生产必将增加其提取成本且不易获取。因此高活性、价格低廉的非专一性酶值得深入研究。

如中国专利申请CN101818181A提供了一种酶解制备壳寡糖的方法，在壳聚糖溶液中加入果胶酶，木聚糖酶，纤维素酶，淀粉酶的混合酶，酶解3～6个小时制得壳寡糖溶液。公开号CN107739418A的中国专利公开了一种采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法，该方法缩短了酶解壳聚糖的时间。中国专利申请CN1320124C发明了一种将中性蛋白酶用交联法固定在N-琥珀酰壳聚糖上水凝胶球上，然后用固定化酶降解壳聚糖制备壳寡糖的方法。但是这些方法得到的壳寡糖分子量分布不均匀，聚合度不集中。研究表明，不同分子量和聚合度的壳寡糖分子对生物的活性中发挥的作用不同，如聚合度为6～8的壳寡糖具有良好的抗菌、增强免疫力、抗肿瘤活性作用，而壳寡糖分子聚合度混杂会严重限制对生物活性作用的发挥。

因此，迫切需要一种复合酶制备的壳寡糖，该壳寡糖分子量和聚合度集中，产量高，并且制备方法操作简便，原料成本低，具有良好的工业推广性和实用性，更加适用于医药，食品，化妆品等领域。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种复合酶制备的壳寡糖，该壳寡糖分子量和聚合度集中，产量高，并且制备方法操作简便，原料成本低，具有良好的工业推广性和实用性，更加适用于医药，食品，化妆品等领域。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种复合酶制备的壳寡糖，所述壳寡糖的制备方法包括以下步骤：

S1、将壳聚糖溶于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成壳聚糖溶液；

S2、向步骤S1所得的壳聚糖溶液中加入复合酶，在45℃～55℃水浴中酶解1h～3h，酶解完成后置于沸水浴中，10min灭活，冷却至室温后用质量浓度为5％的NaOH溶液调整pH＝7～9，过滤，弃去滤渣，取滤液；

S3、将S2所得滤液用再生纤维素透析袋透析24h，每8小时换一次透析液，收集透析液，将收集的透析液加热浓缩后进行喷雾干燥，即得。

进一步地，所述步骤S1中醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH值为4.5，浓度为0.2mol/L。

更进一步地，所述步骤S1中配制成的壳聚糖溶液质量浓度为0.5～1.5％。

进一步地，所述步骤S2中复合酶的质量与壳聚糖的质量比为8～15％，其中复合酶由果胶酶和胃蛋白酶按1:(0.1～1)的重量比组成。

更进一步地，所述步骤S2中复合酶的质量与壳聚糖的质量比为10％，其中复合酶由果胶酶和胃蛋白酶按1：0.6的重量比组成。

进一步地，所述步骤S2在50℃水浴环境中酶解2h。

更进一步地，所述步骤S3中再生纤维素透析袋的截留分子量为3000Da。

进一步地，所述步骤S3中喷雾干燥的工艺条件为：进风温度180℃，进料速度700mL/h。

另外的，本发明还提供了所述壳寡糖的制备方法，包括以下步骤：

I、将壳聚糖溶于pH值为4.5，浓度为0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.5～1.5％壳聚糖溶液；

II、向步骤I所得的壳聚糖溶液中加入果胶酶和胃蛋白酶按1：(0.1～1)的重量比组成的复合酶，复合酶的质量与壳聚糖的质量比为8～15％，在45℃～55℃水浴中酶解1h～3h，酶解完成后置于沸水浴中，10min灭活，冷却至室温后用质量浓度为5％的NaOH溶液调整pH＝7～9，过滤，弃去滤渣，取滤液；

III、将步骤II所得滤液用截留分子量为3000Da的再生纤维素透析袋透析24h，每8小时换一次透析液，收集透析液，将收集的透析液加热浓缩后，在工艺条件为进风温度180℃，进料速度700mL/h下进行喷雾干燥，即得。

本发明中创造性的将果胶酶和胃蛋白酶进行结合降解壳聚糖能够在较短的时间内，酶解得到较多分子量在3000Da，平均聚合度集中在6～8的壳寡糖，平均产率可达到56.43％，并且该方法操作简单。而当单独采用果胶酶或胃蛋白酶，亦或是其他复合酶时均无法取得与上述相同或类似的效果。

因此与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明一种复合酶制备的壳寡糖，创造性的将果胶酶和胃蛋白酶进行结合降解壳聚糖，提高酶解效率，缩短酶解时间，并且制备得到的产品分子量小，聚合度集中，产量高。

(2)本发明的一种复合酶制备壳寡糖的制备方法，工艺简单，操作方便，原料来源简单，有利于实现工业化。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

壳聚糖(批号：171112A，DD85％，山东奥康生物科技有限公司)；果胶酶(上海麦克林生化科技有限公司)；胃蛋白酶(河南希禾化工有限公司)；壳寡糖(青岛祥昇海洋科技有限公司)；再生纤维素透析袋(截留分子量3000Da，上海安谱实验科技股份有限公司)。

实施例1、一种复合酶制备的壳寡糖

制备方法包括以下步骤：

S1、将壳聚糖溶于pH值为4.5，浓度为0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成质量浓度为1％壳聚糖溶液；

S2、向步骤S1所得的壳聚糖溶液中加入果胶酶和胃蛋白酶按1：0.6的重量比组成的复合酶，复合酶的质量与壳聚糖的质量比为10％，在50℃水浴中酶解2h，酶解完成后置于沸水浴中，10min灭活，冷却至室温后用质量浓度为5％的NaOH溶液调整pH＝8，过滤，弃去滤渣，取滤液；

S3、将S2所得滤液用截留分子量为3000Da的再生纤维素透析袋透析24h，每8小时换一次透析液，收集透析液，将收集的透析液加热浓缩后，在工艺条件为进风温度180℃，进料速度700mL/h下进行喷雾干燥，即得。

实施例2、一种复合酶制备的壳寡糖

实施例2与实施例1的区别在于，步骤S1中，壳聚糖溶液的质量浓度为0.5％，S2步骤中复合酶的质量与壳聚糖的质量比为8％，复合酶由果胶酶和胃蛋白酶按1：0.1的重量比组成，其余参数及操作参考实施例1。

实施例3、一种复合酶制备的壳寡糖

实施例3与实施例1的区别在于，步骤S1中，壳聚糖溶液的质量浓度为1.5％，S2步骤中复合酶的质量与壳聚糖的质量比为15％，复合酶由果胶酶和胃蛋白酶按1：1的重量比组成，其余参数及操作参考实施例1。

对比例1、一种壳寡糖

与实施例1相比本对比例区别在于：将复合酶替换为果胶酶，其余参数及操作参考实施例1。

对比例2、一种壳寡糖

与实施例1相比本对比例区别在于：将复合酶替换为胃蛋白酶，其余参数及操作参考实施例1。

对比例3、一种壳寡糖

与实施例1相比本对比例区别在于：将胃蛋白酶替换为木蛋白酶，其余参数及操作参考实施例1。

试验例1、性能测定

1、试验材料：实施例1～3、对比例1～3制备的壳聚糖。

2、试验方法：

对实施例1～3以及对比例1～3制备得到的壳寡糖样品的还原糖含量、5％水溶液粘度、水分含量3000Da壳寡糖的得率进行检测，并以相应的壳寡糖原料药作为对照组，具体的:

DNS试剂(3,5－二硝基水杨酸试剂)：称取3,5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH21.0g充分溶解于500mL的蒸馏水中，加入酒石酸钾钠182.0g，苯酚5.0g(在50℃水中融化)，偏重亚硫酸钠5.0g，搅拌至全溶，定容至1000mL。充分溶解后盛于棕色瓶中，放置稳定后方可使用。(此试剂有效期为1个月)

(1)DNS法测定还原糖含量

氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线的制作

分别加入0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL质量浓度为0.1％氨基葡萄糖盐酸盐溶液于10mL比色管中，再分别加入1.00mL、0.80mL、0.60mL、0.20mL、0.00mL的蒸馏水，随后加入1.0mL的DNS试剂，沸水浴5min显色，取出后冷却至室温，定容到10mL，先采用紫外光度计进行光谱扫描得到最大的吸收峰在480nm处，再在480nm波长进行吸光度的测定。并以吸光度值为纵坐标，氨基葡萄糖盐酸盐体积为横坐标，绘制标准曲线。

取0.5mL待测液于10mL比色管中，加蒸馏水至1mL，再加入1.0mL DNS试剂，沸水浴5min显色，取出后流动水冷却至室温，定容至10mL。以空白管为参比，于波长480nm处测定吸光度值。再将吸光度代入氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线中，计算出还原糖含量的值。

(2)动态粘度的测定

25℃条件下，酶降解壳聚糖过程中，利用旋转粘度计直接读出待测溶液的动态粘度。本发明采用NDJ-8S数字粘度计，L0转子以数示粘度计测定酶解前后壳聚糖的粘度值，测定中保持溶液温度恒定。随着酶解反应的进行，溶液的粘度也逐渐降低，为了保证读数准确性，应通过更换转子，使刻度盘上读数保持在30～80之间。

(3)壳寡糖水分的测定

收集喷雾干燥粉末于平皿中，在温度50℃的烘箱中烘2h，正在干燥器中冷却30min，再复烘30min，冷却后称重，如此反复烘称，直至2次称量相差小于0.003g，壳寡糖粉末水分的计算公式为：

其中：ω1为计算所得壳寡糖水分；g为供测定的壳寡糖质量；g'为烘干后壳寡糖的质量。

(4)壳寡糖聚合度的计算

操作方法：取0.5mL壳寡糖试液按上述还原性糖测定方法，测得吸光度A0。另取相同试液0.5mL，加入6mol/L盐酸溶液1.5mL，置于沸水浴2h，用适量NaOH溶液中和水解液后，用蒸馏水稀释至10mL。取稀释后的水解液1mL，按上述还原性糖测定方法测定，并经计算所得吸光度为A1，壳寡糖的平均聚合度为：n＝10A1/A0。

(5)喷雾干燥壳寡糖得率的计算

壳寡糖得率的计算公式为：

其中：m1是喷雾干燥得到壳寡糖粉的质量；m2是原料样品的质量；ω1是喷雾干燥所得壳寡糖粉水分；ω2是原料样品水分。

3、试验结果：：检测结果参见表1。

表1性能测定结果

由表1可知，实施例1～3制备的壳寡糖，水分含量较低，还原糖含量达到87.95％以上，5％水溶液粘度也低于1.35，聚合度分布在6～8之间，且标准差较小，说明聚合度分布为集中，从3000Da壳寡糖的得率来看，实施例制备的壳寡糖产量大于55.54％。其中，实施例1各指标均较好，为最佳实施例。而对比例1～2与实施例相比，其区别仅在于将复合酶替换为二者的单一酶，但不管是水分，还原糖含量，5％水溶液粘度，检测效果都远不如实施例，并且聚合度较大且标准差较大，说明制备的壳寡糖聚合度分布较宽，比较混杂，3000Da壳寡糖的得率也远不如实施例。此外，对比例3和实施例相比，虽然两者都使用复合酶酶解壳聚糖，但对比例3所用果胶酶和木瓜蛋白复合酶的酶解性能不如实施例1～3所述果胶酶及胃蛋白酶复合酶。综上说明本发明取得了意想不到的效果。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

一种复合酶制备的壳寡糖及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。