专利摘要

基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器的制备方法，涉及电化学传感器技术领域，以姜黄素为模板分子、N‑（N′‑戊烯酰‑谷氨酰胺酰）‑壳寡糖为功能单体低聚物、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，先在玻碳电极表面热聚合形成姜黄素分子印迹膜，然后在含N,N‑亚甲基双丙烯酰胺及过硫酸铵的溶液中电解二次聚合，由于经洗脱液洗脱后在电极表面留下识别位点，再以二茂铁甲醇为电活性探针，通过测定其电荷传递反应在识别过程中的电流变化，实现对姜黄素的间接检测。

权利要求

1.基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将姜黄素和N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖加入由体积比为1/2～2/1的DMF和H₂O组成的混合溶剂中，室温超声溶解，然后再加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈，静置5～24h后，用氮气除去溶解氧，取得混合液；

2）将混合液滴到洁净的玻碳电极表面，然后再覆盖干净的盖玻片，置于55～75℃烘箱中加热5～20h，除去盖玻片后在玻碳电极表面形成一层透明的聚合物膜；

3）将N,N-亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵溶于pH值为6.5、浓度为0.1～1.5M的 NaAc/HAc溶液中，取得混合溶液；将聚合膜电极置于混合溶液中，在-1 .4 V～0 .5 V范围内循环伏安扫描10～40圈，扫速20～150 mV/s，制得二次聚合的姜黄素分子印迹膜修饰的玻碳电极；

4）将上述二次聚合的姜黄素分子印迹膜修饰的玻碳电极用含醋酸质量百分数为10～50%的甲醇溶液作为洗脱液洗脱分子印迹膜中的印迹分子姜黄素，即得基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器。

2.根据权利要求1所述基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器的制备方法，其特征在于所述步骤1）中姜黄素、N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈的混合质量比为3～5︰5～10︰20～50︰1～5。

3.根据权利要求1所述基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器的制备方法，其特征在于所述步骤2）中N,N-亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵的混合质量比为5～25︰1～5。

说明书

技术领域

本发明涉及电化学传感器技术领域。

背景技术

姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学物质，是植物界很稀少的具有二酮结构的酚类化合物。姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水，主要用作食品工业中的色素。现代医学研究表明，姜黄素不仅具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用，而且对许多疾病，如糖尿病、耐药结核病等都具有一定的疗效及预防效果。因此，测定具有生物活性的保健品和食品香料中的姜黄素含量是药理学研究和食品工业的一项重要分析任务。

目前对于姜黄素的检测方法主要以高效液相色谱法(HPLC)结合紫外(UV)的检测方法为主。但这些方法中因为姜黄素类似物具有相同的发色基团，往往特异性不高，在一些研究中对于其代谢产物及本身的稳定性的无法给出准确的判断，因此开发一些特异性好、灵敏度高的检测方法十分必要。

电化学分析方法因其操作方便、仪器简单、灵敏度高、准确度高而被广泛研究和应用。分子印迹技术是指将模板分子与一定的功能单体通过分子之间的作用形成主-客体复合物，然后加入一定量的交联剂和功能单体共同聚合成高分子聚合物。除去模板分子后，刚性聚合物中的空穴记录有模板分子的构型，且功能基团在空穴中的精确排列与模板分子互补，从而对特定的模板分子具有较高的识别能力。由于其制作简单、稳定性好、可重复使用、成本低，已成为电化学传感器中理想的分子识别装置。构建传感器时，通常将分子印迹聚合物以适当形式固定在电化学传感器电极的表面，其中以构建分子印迹膜的形式较为常见。

中国专利申请201911326503.7公开了一种壳寡糖衍生物分子印迹功能单体的制备方法。

发明内容

本发明目的是提出一种可获得用于姜黄素浓度测定时，具有特异性、灵敏性和稳定性的电极基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器的制备方法。

本发明包括以下步骤：

1）将姜黄素和N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖加入由体积比为1/2～2/1的DMF和H₂O组成的混合溶剂中，室温超声溶解，然后再加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈，静置5～24h后，用氮气除去溶解氧，取得混合液；

2）将混合液滴到洁净的玻碳电极表面，然后再覆盖干净的盖玻片，置于55～75℃烘箱中加热5～20h，除去盖玻片后在玻碳电极表面形成一层透明的聚合物膜；

3）将N,N-亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵溶于pH值为6.5、浓度为0.1～1.5M的 NaAc/HAc溶液中，取得混合溶液；将聚合膜电极置于混合溶液中，在-1 .4 V～0 .5 V范围内循环伏安扫描10～40圈，扫速20～150 mV/s，制得二次聚合的姜黄素分子印迹膜修饰的玻碳电极；

4）将上述二次聚合的姜黄素分子印迹膜修饰的玻碳电极用含醋酸质量百分数为10～50%的甲醇溶液作为洗脱液洗脱分子印迹膜中的印迹分子姜黄素，即得基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器。

本发明为该功能单体用于分子印迹检测姜黄素的具体应用，即以姜黄素为模板分子、N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖为功能单体低聚物、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，首先在玻碳电极表面热聚合形成姜黄素分子印迹膜，然后在含N,N-亚甲基双丙烯酰胺及过硫酸铵的溶液中电解二次聚合，由于经洗脱液洗脱后在电极表面留下识别位点，再以二茂铁甲醇为电活性探针，通过测定其电荷传递反应在识别过程中的电流变化，实现对姜黄素的间接检测。

本发明利用分子印迹膜对姜黄素的特异性结合作用，将分子印迹膜修饰电极作为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对姜黄素的高灵敏检，该电极用于姜黄素浓度测定时，特异性、灵敏度和稳定性俱佳。

本发明制备的传感器可用于姜黄素的识别与检测，检测时可以一些电活性物质，如铁氰化钾、二茂铁甲醇等为电活性探针，通过测定其电荷传递反应在分子印迹膜电极识别姜黄素过程中的电流变化，而实现对姜黄素的间接检测。

本发明的工作原理是：在洁净的玻碳电极的表面，首先通过热聚合覆盖一层以姜黄素为模板分子、N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖为功能单体低聚物、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂的分子印迹膜，此时由于壳寡糖衍生物功能单体低聚物的刚性结构，在聚合过程中因溶剂挥发而形成纳米尺寸结构（由于同时发生交联反应，可以使得析出的壳寡糖结构不会发生聚集），因而将在电极表面形成比表面积非常大的膜结构，使得测定的灵敏度得以极大地提升。另外，在壳寡糖低聚物在分子印迹膜中形成较大的网格结构，这种分子印迹膜用于电化学测定时，将造成较大的背景电流，使得检测的信噪比过小，测定灵敏度不够，故将此热聚合修饰电极进行二次电化学引发聚合，因热聚合所形成的分子印迹膜及其模板分子不导电、且模板分子不溶于电解液中，因此二次聚合时电引发聚合物只在热聚合所形成的分子印迹膜中空隙中沉积，因此极大降低了传感器的背景电流，同时使得模板分子与印迹膜所处的空间进一步匹配，因而分子印迹膜脱去模板分子后，可在电极表面获得一种对姜黄素分子具有特异性、灵敏性俱佳的分子印迹膜。测试时利用二茂铁甲醇作为电化学探针，测其在电解液中的差分脉冲伏安的信号变化，而电化学分析中差分脉冲伏安法本身属于高灵敏的检测方法，因可获得一种高灵敏度检测姜黄素的分子印迹传感器。

本发明以能形成大网格结构的、对姜黄素分子有较强作用的N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖为功能单体低聚物，通过两次聚合的方法在玻碳电极表面制备分子印迹传感器。由于功能单体低聚物对姜黄素分子较强的作用以及分子印迹本身空间结构的匹配性，二次聚合有效地降低了传感器测定时的信噪比。结果表明分子印迹传感器测定姜黄素的线性范围为1.0×10^-8～2.0×10^-6 mol/L，检测限为0 .5×10^-8 mol/L。利用同一根玻碳电极制备五次分子印迹传感器，测定其对姜黄素的响应电流，其相对标准偏差为2.9%，利用3根玻碳电极平行制备的分子印迹传感器对姜黄素测定的相对标准偏差为3.5%，说明该电极具有良好的重现性。该传感器置于4℃的环境中考察其稳定性，一周后，仍保留响应电流值的90%以上，表明该电极具有良好的稳定性。因此本发明提供了一种稳定、特异性和灵敏均好的检测姜黄素的分子印迹传感器方法，同时对于类似于姜黄素的不溶于的化合物提供了一种分子印迹传感器通用的制备方法，同时在有机反应、有机合成和电化学等领域也具有广泛的应用前景。

进一步地，本发明所述步骤1）中姜黄素、N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈的混合质量比为3～5︰5～10︰20～50︰1～5。其中姜黄素为模板分子，N-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖为模板分子，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，偶氮二异丁腈为反应引发剂。其中交联剂的比例用量最多，作为分子印迹膜的主体材料，功能单体低聚物的量的比例稍小，以形成最佳的分子印迹空间为宜，模板分子的比例最小，以便能更多地进出到聚合膜中。引发剂微量即可。

所述步骤2）中N,N-亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵的混合质量比为5～25︰1～5。其中N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，过硫酸铵为引发剂。此时不需要模板分子，只需形成体型结构的聚合物即可。

附图说明

图1 为本发明分子印迹传感器制备流程框图。

图2为姜黄素分子印迹膜电解聚合的循环伏安曲线图。

图3为姜黄素分子印迹膜修饰电极脱模板后的扫描电镜图。

图4为姜黄素分子印迹膜修饰电极不同状态下循环伏安曲线图。

图5为非分子印迹膜修饰电极洗脱前后循环伏安曲线图。

图6为分子印迹聚合膜修饰的玻碳电极对不同浓度的姜黄素的差分脉冲伏安峰电流响应图。

图7为分子印迹传感器的电流响应对姜黄素浓度的校准曲线。

图8为分子印迹聚合膜修饰的玻碳电极与非分子印迹膜修饰电极对2μM的姜黄素及其类似物的差分脉冲伏安峰电流响应图。

具体实施方式

一、制备分子印迹传感器。

本实施例分子印迹传感器制备方法如图1所示。

1、热聚合：

将3mg 姜黄素和6mgN-（N′-戊烯酰-谷氨酰胺酰）-壳寡糖加入5mL由等体积比的DMF和H₂O组成的混合溶剂中，室温超声溶解，再加入50mg交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA），1.5mg引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）。静置12h后，用氮气进行至少10分钟的净化，除去溶解氧，取得混合液。移取5μl混合液滴到洁净的玻碳电极表面，覆盖一块干净的盖玻片。然后置于65℃烘箱中加热12h，除去盖玻片后在玻碳电极表面形成一层透明的聚合物膜。

2、制备分子印迹传感器：

将20mgN,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）及1.5mg过硫酸铵（APS）溶于3mL、浓度为0.5M、pH值为6.5的醋酸缓冲液中，将上述聚合膜电极置于此溶液中，在-1 .4 V~0 .2 V范围内循环伏安扫描10圈，扫速40 mV/s，制得二次聚合的姜黄素分子印迹膜修饰的玻碳电极。

该二次聚合的姜黄素分子印迹膜修饰的玻碳电极的循环伏安线见图2所示。

用含醋酸30%的甲醇溶液作为洗脱液洗脱分子印迹膜中的印迹分子姜黄素，得到分子印迹聚合膜修饰的玻碳电极，该修饰电极即为测定姜黄素的分子印迹传感器。

二、得到的修饰的玻碳电极进行扫描电镜表征：

修饰的玻碳电极的扫描电镜表征见图3，从图3可以修饰膜电极表面具有许多较为微小的表面凹陷，明显增加了膜的表面积，有利于分子印迹膜对模板分子姜黄素的吸附。

三、将实施例2得到的分子印迹传感器用于电化学测试。

（1）不同修饰分子印迹电极的循环伏安测试：

分别将裸玻碳电极、热聚合分子印迹膜修饰的玻碳电极、电化学引发聚合分子印迹膜修饰的玻碳电极、洗脱姜黄素后分子印迹膜修饰玻碳电极、重新吸附为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极；电解液为含1.0 mmol/L 二茂铁甲醇的0.25M醋酸缓冲液（pH=6.5）；扫描电位范围-0.1～0.5V。

循环伏安图见图4所示。

洁净玻碳电极（对照）、姜黄素洗脱前的分子印迹电极、姜黄素洗脱后的分子印迹电极和重新吸附姜黄素后的分子印迹电极分别在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M 醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

其中曲线a为洁净玻碳电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL0.25M醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

曲线b为热聚合后姜黄素分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

曲线c为电化学引发聚合后姜黄素的分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

曲线d为洗脱姜黄素后的分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

曲线e为重新吸附姜黄素后的分子印迹电极在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

另，取得重新吸附姜黄素后的分子印迹电极的方法：将姜黄素洗脱后的分子印迹电极浸泡在浓度为0.2M的姜黄素乙醇溶液中吸附姜黄素至饱和。

从图4可见，裸玻碳电极的峰电流最大（曲线a），热聚合后在玻碳电极表面形成分子印迹膜致使峰电流有较明显的下降，但依然较大（曲线b），这说明电极表面的膜中有较多的空隙导电；在电化学引发聚合后，伏安曲线的峰电流变得很小，几乎看不出峰形（曲线c），当分子印迹膜修饰电极脱除模板分子后，伏安曲线峰电流明显增加（曲线d），当传感器再次吸附模板分子后，伏安曲线峰电流又有所下降（曲线e）。

（2）非分子印迹电极的循环伏安测试：

非分子印迹是在制备分子印迹时不加入模板分子，其他步骤与制备分子印迹一致。

非分子印迹膜修饰电极的循环伏安测试曲线见图5所示。

曲线f为非分子印迹电极洗脱前在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

曲线g为非分子印迹电极洗脱后在含1.0 mM二茂铁甲醇的10mL 0.25M醋酸缓冲液（pH6.5）溶液中的循环伏安曲线图。

图6分子印迹聚合膜修饰的玻碳电极对不同浓度的姜黄素的差分脉冲伏安峰电流响应图。

从图5可见，二次聚合后非分子印迹膜修饰电极的循环伏安曲线与分子印迹膜修饰电极相似，但经洗脱处理后，两者相差较大，非分子印迹膜循环伏安峰电流增加不太大，这说明模板分子的脱除对分子印迹膜的性能有较大的影响，而非分子印迹膜因不含模板分子，洗脱处理影响不大。

四、分子印迹传感器对姜黄素的差分脉冲伏安测试：

将分子印迹传感器为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极；电解液为1 .0 mmol/L 二茂铁甲醇的0.25M的醋酸缓冲液（pH= 6.5）；扫描电位范围-0.5～0.4V；将分子印迹传感器置于电解液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，结果见图6。由图5可知，传感器对不同浓度的苏丹红-I具有不同的DPV响应。

空白电解液扫描DPV的峰电流I _p0 ，然后再将分子印迹传感器置于一定浓度的苏丹红-I溶液中孵育后，再扫描得到峰电流I_p ，则传感器的响应电流为ΔI_p = I _p0- I_p ，结果见图7。

由图7可知，在测定范围内ΔI_p值与苏丹红-I的浓度响应呈线性关系。测定姜黄素的线性范围为1.0×10^-7～2.0×10^-6 mol/L。该传感器置于4℃的环境中，两周后，仍保留响应电流值的90%以上。

由图8可知，姜黄素电化学分子印迹传感器对姜黄素的峰电流下降值远高于其他类似物（四氢姜黄素、阿魏酸、胡萝卜素、槲皮素）的峰电流下降值，因而本法制备的姜黄素分子印迹传感器具有较高的选择性。

非分子印迹修饰膜电极对姜黄素及其类似物的差分脉冲伏安峰电流响应均较分子印迹膜修饰电极小得多，但很显然，非分子印迹膜对姜黄素的响应较大，说明功能单体低聚物对姜黄素分子具有较高的结合能力。

基于壳寡糖衍生物为功能单体的电化学分子印迹传感器的制备方法专利购买费用说明

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2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

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