专利摘要

本发明公开了一种用于提高类胡萝卜素萃取效率的万寿菊鲜花处理剂，由如下原料按重量份组成：乳杆菌菌粉2份、维素酶45份、果胶酶45份、蛋白酶6份、抗氧化剂2份。其中，乳杆菌菌粉包括干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种。酶制剂包括纤维素酶、果胶酶、蛋白酶中的一种或多种。抗氧化剂包括天然维生素E、dl‑α‑生育酚、dl‑α‑生育酚乙酸酯中的一种或多种。本发明提供的万寿菊鲜花处理剂可提高从万寿菊花中萃取类胡萝卜素类化合物(主要为叶黄素酯和玉米黄质酯)的萃取效率。

权利要求

1.一种用于提高类胡萝卜素萃取效率的万寿菊鲜花处理剂，其特征在于，由如下原料按重量份组成：乳杆菌菌粉2份、纤维素酶45份、果胶酶45份、蛋白酶6份、抗氧化剂2份；

所述乳杆菌菌粉包括干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或以任何比例的多种组合；

其中，干酪乳杆菌的细菌菌落总数为109-1013cfu/g、发酵乳杆菌的细菌菌落总数为109-1013cfu/g、瑞士乳杆菌的细菌菌落总数为109-1013cfu/g、副干酪乳杆菌的细菌菌落总数为109-1013cfu/g、植物乳杆菌的细菌菌落总数为109-1013cfu/g；

所述纤维素酶为黑曲霉来源的纤维素酶、李氏木霉来源的纤维素酶、绿色木霉来源的纤维素酶中的一种或以任何比例的多种组合；

其中，黑曲霉来源的纤维素酶的活性为104-106U/g、李氏木霉来源的纤维素酶的活性为104-106U/g、绿色木霉来源的纤维素酶的活性为104-106U/g；

所述果胶酶为黑曲霉来源的果胶酶、米根霉来源的果胶酶中的一种或以任何比例的两种组合；

其中，黑曲霉来源的果胶酶的活性为104-106U/g、米根霉来源的果胶酶的活性为104-106U/g；

所述蛋白酶为木瓜来源的蛋白酶、地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶、黑曲霉来源的蛋白酶、枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶、米曲霉来源的蛋白酶中的一种或以任何比例的多种组合；

其中，木瓜来源的蛋白酶的活性为104-106U/g、地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶的活性为104-106U/g、黑曲霉来源的蛋白酶的活性为104-106U/g、枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶的活性为104-106U/g、米曲霉来源的蛋白酶的活性为104-106U/g；

所述抗氧化剂包括天然维生素E、dl-α-生育酚、dl-α-生育酚乙酸酯中的一种或以任何比例的多种组合。

2.一种万寿菊鲜花中类胡萝卜素萃取的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将如权利要求1所述的万寿菊鲜花处理剂溶于3w/w%浓度的蔗糖水中，室温放置3小时，其中万寿菊鲜花处理剂与蔗糖水的用量比为1g:0.3L；

2）按照6mL/kg的用量将万寿菊鲜花处理剂均匀喷洒于万寿菊鲜花表面，压实，密封，造成厌氧环境，发酵12天，控制温度15-45℃；

3）测定发酵产物pH值，当pH≤3.2后，挤压脱水，60℃热风干燥30分钟至含水量≤16%，得到经处理的万寿菊干花；

4）将万寿菊干花按照1kg加入正己烷3-5L的量加入正己烷，室温下静态萃取30分钟，收集萃取液；

5）用真空旋转干燥仪，在45℃、-0.06MPa、30rpm条件下浓缩萃取液至无馏出物。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可提高类胡萝卜素萃取效率的食品安全级万寿菊鲜花处理剂及使用该万寿菊鲜花处理剂提取万寿菊中类胡萝卜素的方法。

背景技术

万寿菊(Tagetes erecta L)为菊科万寿菊属一年生草本植物。头状花序单生；舌状花黄色或暗橙色；管状花花冠黄色。花期7-9月。

万寿菊花中含有丰富的叶黄素酯(1.5-2.9‰，W/DW)。叶黄素酯经萃取和皂化后可形成游离态叶黄素。从万寿菊花中制备叶黄素的关键技术是叶黄素酯萃取。万寿菊花中叶黄素酯存在于花瓣细胞内的细胞器内。细胞壁和细胞器的膜阻碍了萃取溶媒与叶黄素酯的接触，导致萃取效率的低下。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于提高类胡萝卜素萃取效率的万寿菊鲜花处理剂，该万寿菊鲜花处理剂可以用于提高万寿菊中类胡萝卜素的萃取效率。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于提高类胡萝卜素萃取效率的万寿菊鲜花处理剂，由如下原料按重量份组成：乳杆菌菌粉2份、维素酶45份、果胶酶45份、蛋白酶6份、抗氧化剂2份。

其中，所述乳杆菌菌粉包括干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或以任何比例的多种组合；其中，其中，干酪乳杆菌的细菌菌落总数为10⁹-10¹³cfu/g、发酵乳杆菌的细菌菌落总数为10⁹-10¹³cfu/g、瑞士乳杆菌的细菌菌落总数为10⁹-10¹³cfu/g、副干酪乳杆菌的细菌菌落总数为10⁹-10¹³cfu/g、植物乳杆菌的细菌菌落总数为10⁹-10¹³cfu/g。

其中，所述纤维素酶为黑曲霉来源的纤维素酶、李氏木霉来源的纤维素酶、绿色木霉来源的纤维素酶中的一种或以任何比例的多种组合；其中，黑曲霉来源的纤维素酶的活性为10⁴-10⁶U/g、李氏木霉来源的纤维素酶的活性为10⁴-10⁶U/g、绿色木霉来源的纤维素酶的活性为10⁴-10⁶U/g。

其中，所述果胶酶为黑曲霉来源的果胶酶、米根霉来源的果胶酶中的一种或以任何比例的两种组合；其中，黑曲霉来源的果胶酶的活性为10⁴-10⁶U/g、米根霉来源的果胶酶的活性为10⁴-10⁶U/g。

其中，所述蛋白酶为木瓜来源的蛋白酶、地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶、黑曲霉来源的蛋白酶、枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶、米曲霉来源的蛋白酶中的一种或以任何比例的多种组合；其中，木瓜来源的蛋白酶的活性为10⁴-10⁶U/g、地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶的活性为10⁴-10⁶U/g、黑曲霉来源的蛋白酶的活性为10⁴-10⁶U/g、枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶的活性为10⁴-10⁶U/g、米曲霉来源的蛋白酶的活性为10⁴-10⁶U/g。

其中，所述抗氧化剂包括天然维生素E、dl-α-生育酚、dl-α-生育酚乙酸酯中的一种或以任何比例的多种组合。

本发明还提供一种类胡萝卜素萃取的方法，包括如下步骤：

1)将上述的万寿菊鲜花处理剂溶于3w/w％浓度的蔗糖水中，室温放置3小时，其中万寿菊鲜花处理剂与蔗糖水的用量比为1g:0.3L；

2)按照6mL/kg的用量将万寿菊鲜花处理剂均匀喷洒于万寿菊鲜花表面，压实，密封，造成厌氧环境，发酵12天，控制温度15-45℃；

3)测定发酵产物pH值，在pH≤3.2后，挤压脱水，60℃热风干燥30分钟至含水量≤16％，得到经处理的万寿菊干花；

发酵过程中，微生物产酸，发酵产物pH上限为3.2。

4)将万寿菊干花按照1kg加入正己烷3-5L的量加入正己烷，室温下静态萃取30分钟，收集萃取液；

5)用真空旋转干燥仪，在45℃、-0.06MPa、30rpm条件下浓缩萃取液至无馏出物。

本发明提供的万寿菊鲜花处理剂属于一种用于处理万寿菊鲜花的专用产品，由(1)微生物、(2)酶制剂和(3)抗氧化剂三部分组成。使用的主要目的是提高从万寿菊花中萃取类胡萝卜素类化合物(主要为叶黄素酯和玉米黄质酯)的萃取效率，采用本发明提供的万寿菊鲜花处理剂，可使万寿菊花中萃取类胡萝卜素类化合物萃取效率提高了40％。

其作用机理包括：

(1)应用组合酶(包括纤维素酶、果胶酶和蛋白酶)最大限度地降解花瓣组织细胞壁、细胞膜和细胞内的类胡萝卜素-蛋白质复合体，使类胡萝卜素分子与萃取溶媒分子之间达到最大限度的接触，从而提高萃取效率。

(2)同时，利用酶解产物，进行产酸微生物的发酵，降低体系的pH值。在细胞结构破坏后，有效抑制其它微生物的生长。

(3)在上述过程中，使用以淬灭自由基为作用机理的抗氧化剂，最大限度地减少类胡萝卜素的损失。

本发明的优点和有益效果为：

(1)采用本发明中提供的万寿菊鲜花处理剂使得万寿菊花中类胡萝卜素类化合物(主要为叶黄素酯和玉米黄质酯)的萃取效率有效提高了40％。

(2)所有组成原料均为食品安全级产品。

附图说明

图1A为本发明实施例1中经万寿菊鲜花处理剂处理的处理剂组的UV-VIS光谱图。

图1B为本发明实施例1中未经万寿菊鲜花处理剂处理的对照组的UV-VIS光谱图。

图2A为本发明实施1中使用万寿菊鲜花处理剂处理的处理剂组萃取物总类胡萝卜素含量结果图。

图2B为本发明实施例1中未经万寿菊鲜花处理剂处理的对照组萃取物总类胡萝卜素含量结果图。

图3A为本发明实施例1中经万寿菊鲜花处理剂处理的处理剂组的UV-VIS光谱图。

图3B为本发明实施例1中未经万寿菊鲜花处理剂处理的对照组的UV-VIS光谱图。

图4A为本发明实施1中使用万寿菊鲜花处理剂处理的处理剂组萃取物总类胡萝卜素含量结果图。

图4B为本发明实施例1中未经万寿菊鲜花处理剂处理的对照组萃取物总类胡萝卜素含量结果图。

具体实施方式

本发明所提供菌、酶、抗氧化剂的使用标准如下：

(1)乳杆菌属(Lactobacillus)产酸微生物菌粉。菌种详见下表：

(2)酶制剂：

(3)抗氧化剂

上述原料均为商品化原料，只要符合上述标准均可用于本发明。

实施例1

选叶黄素酯含量为0.23‰(W/FW)的万寿菊(Tagetes erecta L)鲜花为测试样品。实施步骤如下：

(1)采摘万寿菊鲜花100公斤，平均分成2份，每份50公斤，一份为处理剂组，另一份为对照样品组。

(2)处理剂配制

按表1配方配制处理剂

表1处理剂配方

将上述材料按照配方量混合即可。

(3)取1g处理剂溶于300mL 3％(W/W)的蔗糖水中，在室温下放置3小时。

(4)将处理剂溶液均匀喷洒于处理剂组的50公斤万寿菊鲜花表面。

(5)压实，密封，造成厌氧条件。

(6)发酵12天，发酵期间控制温度42℃。

(7)在发酵产物pH≤3.2后；

(8)挤压脱水。

(9)60℃热风干燥30分钟至含水量≤16％。

(10)测量得到5.4公斤处理过的干花。

(11)在20升正己烷中在室温下静态萃取30分钟。

(12)收集萃取液I。

(13)用10L真空旋转干燥仪，在45℃、-0.06MPa、30rpm条件下浓缩萃取液至无馏出物。

(14)测量浓缩物的重量。

(15)浓缩萃取物中总类胡萝卜素含量分析

取一定量的浓缩物，配制浓缩物的正己烷溶液，使溶液在最大吸收波长的吸光值在0.2至0.3之间。

在紫外-可见光分光光度计上测定浓缩物正己烷溶液的吸收光谱，在最大吸收波长(445nm)处测定其吸光值，根据朗伯-比尔定律，按下列公式计算其中总类胡萝卜素的浓度：

x＝(A×y)/(A1％1cm×100) (1)

其中：

x＝样品中所含的总类胡萝卜素数量(克)

y＝样品溶液的体积(毫升)

A＝样品的吸光值

A1％1cm＝吸光系数，为在1厘米光程长的比色杯中1％(W/V)浓度溶质的理论吸收值。在此，采用值为2200。

(16)收集残渣。重复步骤(11)至(15)，测定萃取液II、III中的总类胡萝卜素含量，直至萃取液的吸光值为0，达到完全萃取，经计算使用萃取溶剂正己烷60L。

(17)按步骤(2)至(16)，对对照样品进行发酵处理。用300mL蒸馏水代替步骤(2)至(3)所得的处理剂溶液。测定萃取液I、II、III、IV和V中的总类胡萝卜素含量，直至萃取液的吸光值为0，做到完全萃取，经计算使用萃取溶剂正己烷100L。

(18)处理剂与对照萃取物的UV-VIS光谱见图1A(处理剂组)和图1B(对照组)所示。

(19)处理剂与对照萃取物中总类胡萝卜素含量比较，详见图2A(处理剂组)和图2B(对照组)所示。其中，I、II、III和I、II、III、IV、V分别代表处理剂组第一遍、第二遍、第三遍萃取和对照样品组第一遍、第二遍、第三遍、第四遍、第五遍萃取的萃取液。

(20)总类胡萝卜素总得率比较

处理剂萃取物(I+II+III)总类胡萝卜素总得率：11.43克/50公斤。

对照萃取物(I+II+III+IV+V)总类胡萝卜素总得率：11.07克/50公斤。

从图2A中可以看出，在获得相同总类胡萝卜素总得率的前提下，使用了本发明提供的万寿菊鲜花处理剂的组别中，经过两遍萃取就基本将万寿菊鲜花中的类胡萝卜素完全提取出来，第三遍则是确保其中的类胡萝卜素确实完全提取出来。而图2B中可以看出，以水代替万寿菊鲜花处理剂的组别中，则需要经过四遍才能基本将万寿菊鲜花中的类胡萝卜素完全提取出来，第五遍则是确保其中的类胡萝卜素确实完全提取出来。也就是说，使用了本发明提供的万寿菊鲜花处理剂的组别中最多三遍即可将寿菊鲜花中的类胡萝卜素完全提取出来，比不使用的对照样品组减少了提取溶剂的使用量达40％，减少了提取总时间，提升了提取效率，相应也降低了提取的成本。

实施例2

选玉米黄素酯含量为0.16‰(W/W)的万寿菊(Tagetes erecta L)鲜花为测试样品。实施步骤如下：

(1)采摘万寿菊鲜花100公斤。分成2份。每份50公斤。一份做为处理剂组，另一份做为对照样品组。

(2)处理剂配制

按表1配方配制处理剂

表1处理剂配方

将上述材料按照配方量混合即可。

(3)取1g处理剂溶于300mL3％(W/W)的蔗糖水中。在室温下放置3小时。

(4)将处理剂溶液均匀喷洒于处理剂组的50公斤万寿菊鲜花表面。

(5)压实，密封，造成厌氧条件。

(6)发酵12天。发酵期间控制温度42℃。

(7)在发酵产物pH≤3.2后；

(8)挤压脱水。

(9)60℃热风干燥30分钟至含水量≤16％。

(10)得到5.2公斤处理过的干花

(11)在20升正己烷中在室温下静态萃取30分钟。

(12)收集萃取液I。

(13)用10L真空旋转干燥仪，在45℃、-0.06MPa、30rpm条件下浓缩萃取液至无馏出物。

(14)测量浓缩物的重量。

(15)浓缩萃取物中总类胡萝卜素含量分析

取一定量的浓缩物，配制浓缩物的正己烷溶液，使溶液在最大吸收波长的吸光值在0.2至0.3之间。

在紫外-可见光分光光度计上测定浓缩物正己烷溶液的吸收光谱，在最大吸收波长(445nm)处测定其吸光值，根据朗伯-比尔定律，按下列公式计算其中总类胡萝卜素的浓度：

x＝(A×y)/(A1％1cm×100) (1)

其中：

x＝样品中所含的总类胡萝卜素数量(克)

y＝样品溶液的体积(毫升)

A＝样品的吸光值

A1％1cm＝吸光系数，为在1厘米光程长的比色杯中1％(W/V)浓度溶质的理论吸收值。在此，采用值为2200。

(16)收集残渣。重复步骤(11)至(15)。获得萃取液II、III中的总类胡萝卜素含量。直至萃取液的吸光值为0，达到完全萃取，经计算使用萃取溶剂正己烷60L。

(17)按步骤(2)至(16)，对对照样品进行发酵处理。用300mL蒸馏水代替步骤(2)至(3)所得的处理剂溶液。测定萃取液I、II、III、IV和V中的总类胡萝卜素含量，直至萃取液的吸光值为0，做到完全萃取。经计算使用萃取溶剂正己烷100L。提高萃取效率40％。

(18)处理剂与对照萃取物的UV-VIS光谱见图3A(处理剂组)和图3B(对照组)所示。

(19)处理剂与对照萃取物总类胡萝卜素含量比较，详见图4A(处理剂组)和图4B(对照组)所示。其中，I、II、III和I、II、III、IV、V分别代表处理剂组第一遍、第二遍、第三遍萃取和对照样品组第一遍、第二遍、第三遍、第四遍、第五遍萃取的萃取液。

(20)总类胡萝卜素总得率比较

处理剂萃取物(I+II+III)总类胡萝卜素总得率：7.12克/50公斤。

对照萃取物(I+II+III+IV+V)总类胡萝卜素总得率：7.04克/50公斤。

(19)和(20)节所示内容显示：在获得相同总类胡萝卜素总得率的前提下，使用处理剂可减少40％的萃取溶剂用量。即：萃取效率提高40％。

从图4A中可以看出，在获得相同总类胡萝卜素总得率的前提下，使用了本发明提供的万寿菊鲜花处理剂的组别中，经过两遍萃取就基本将万寿菊鲜花中的类胡萝卜素完全提取出来，第三遍则是确保其中的类胡萝卜素确实完全提取出来。而图4B中可以看出，以水代替万寿菊鲜花处理剂的组别中，则需要经过四遍才能基本将万寿菊鲜花中的类胡萝卜素完全提取出来，第五遍则是确保其中的类胡萝卜素确实完全提取出来。也就是说，使用了本发明提供的万寿菊鲜花处理剂的组别中最多三遍即可将寿菊鲜花中的类胡萝卜素完全提取出来，比不使用的对照样品组减少了提取溶剂的使用量达40％，减少了提取总时间，提升了提取效率，相应也降低了提取的成本。

从上述实施例可以看出，本发明提供一种用于提高类胡萝卜素萃取效率的万寿菊鲜花处理剂，以及使用该万寿菊鲜花处理剂提取万寿菊中类胡萝卜素的方法，可以有效减少萃取溶剂的用量达40％，减少萃取时间，提升萃取效率，降低生产成本。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的专业人员，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

一种用于提高类胡萝卜素萃取效率的万寿菊鲜花处理剂专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。