专利摘要

本发明公开了一种利用微生物发酵制备式II和/或式III所示的化合物的方法及其专用菌株。该菌株为非洲黑蛋巢（Cyathusafricanus）L38，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.6259。本发明的方法，包括以下步骤：1）将发酵非洲黑蛋巢L38接种到固体培养基上进行固体发酵培养；2）在发酵后的体系中加入有机溶剂浸泡提取得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到含有式II所示化合物和式III所示化合物的粗提物。本发明利用非洲黑蛋巢L38发酵制备化合物式II和式III所示化合物，并且对该菌采用多种条件进行培养，检测了该化合物的最佳获取时期，均可得到较高的产率。(式Ⅱ）(式Ⅲ） CGMCCNO.6259 2012.07.04

权利要求

1.非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.6259。

2.非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38 CGMCC NO.6259在制备式II所示化合物和/或式III所示化合物中的应用；

(式Ⅱ）                        (式Ⅲ）

3.一种制备式II所示化合物和式III所示化合物的方法，包括以下步骤：

1）将发酵非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38 CGMCC NO.6259接种到固体培养基上进行固体发酵培养；

2）在步骤1）发酵后的体系中加入有机溶剂浸泡提取得到含有式II所示化合物和式III所示化合物的提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到含有式II所示化合物和式III所示化合物的粗提物；

其中，步骤1）中，所述固体培养基由基材和水混合得到，所述基材选自小麦、粳米、玉米、糯米、芡实、籼米和薏米中的一种或两种以上任意组合；所述固体培养基的含水量是所述的基材总重量的100-150%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述固体发酵培养的培养条件是18-28℃，避光静止培养20-60天。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述固体发酵培养的培养条件是25℃，避光静止培养30天。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述有机溶剂是乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、异丙醇和正丁醇中的任意一种。

7.根据权利要求3-6中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将步骤2获得的粗提物用硅胶柱层析分离，以氯仿和丙酮的混合液为溶剂，按照溶剂中氯仿和丙酮的比例依次是100:0、100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1的洗脱梯度进行梯度洗脱，每个梯度洗脱溶剂1500毫升，每350毫升收集为一个流份；将氯仿和丙酮的比例为10:1的洗脱溶剂洗脱的第二个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置，析出无色结晶，得到式Ⅱ所示的化合物；将氯仿和丙酮的比例为10:1的洗脱溶剂洗脱的第三个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置过夜，析出无色结晶，得到式Ⅲ所示的化合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，还包括在固体发酵之前将非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38 CGMCC NO.6259在PDA固体培养基上进行预培养，取预培养后的菌丝体转接到液体培养基中进行培养；预培养的条件为：25-28℃，避光培养5-7天；液体培养的条件为：25-28℃，避光培养7-10天；

所述PDA培养基的组成为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，水定容至1L；所述液体培养基的组成为：葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，酵母4.0g/L，水定容至1L。

说明书

技术领域

本发明涉及cyathane类二萜化合物11-氧乙酰鸟巢烷三醇（11-O-acetylcyathatriol）和15-氧乙酰鸟巢烷三醇（15-O-acetylcyathatriol）的生产的方法及其专用菌株。

背景技术

过去几个世纪，来源于微生物的药物在治疗肿瘤和病原微生物感染等严重威胁人类健康的疾病方面发挥了巨大的作用。真菌是微生物的重要类群之一，其代谢产物种类丰富、结构类型独特，使其成为天然有机活性小分子的主要来源；真菌来源的活性物质占微生物来源的50%以上（Journal of Antibiotics 2005,58,1–26）。来源于真菌的抗生素（如青霉素等）、抗病原真菌制剂、免疫抑制剂以及降胆固醇制剂在过去几十年已经用于临床，为人类抵抗疾病、延年益寿作出了巨大的贡献。上世纪六十年代H.J.Brodie发现的一株被命名为Cyathus helenae Brodie的鸟巢菌新种，能够很好的抑制细菌的生长（Masters Thesis.University of Alberta,Sept.1967）；于是W．A.Ayer等人对其进一步研究，发现该菌菌丝体的粗提物具有较好的抗生素活性，并从中分离得到几个命名为“cyathin”的抗生素（该类化合物具有5/6/7三环骨架），均具有很好的抗菌活性，能够抑制细菌、放线菌、一些真菌和人类病原菌等生长（Canadian Journal of Chemistry 1971,17,1401-1407）。之后，W.A.Ayer等人利用生物活性跟踪的方法又在其他Cyathus sp.中分离得到该类群的二萜，使该类型的化合物数量不断扩增。Kawagishi等在上世纪九十年代从Hericium ernaceum中分离得到erinacine；从Sarcodon scabrosus中分离得到scabronine和sarcodonin（Canadian Journal of Chemistry 1973,51,3842-3854；Tetrahedron Lett.1971,13,1917-1920.），这三类化合物同caythin具有相同5/6/7三环骨架，使该类二萜的分布范围扩大，对研究该类二萜的生物合成及其活性研究均具有重要意义。

化合物11-氧乙酰鸟巢烷三醇（11-O-acetylcyathatriol）（式Ⅱ）和15-氧乙酰鸟巢烷三醇（15-O-acetylcyathatriol）(式Ⅲ）最初是在Cyathus earlei Lloyd中被发现的（Canadian Journal of Chemistry 1979,57(24),3332-3337），但纯化合物产率较低（即纯化合物与粗提物质量比，7.7g粗提物中分离得到132mg 11-O-acetylcyathatriol和310mg 15-O-acetylcyathatriol）。之后又在Hericium ernaceum发现也具有11-O-acetylcyathatriol（Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry 2004,68(8),1786-1789.），与Cyathus earlei Lloyd一样纯化合物产率较低（约0.6%，从461mg粗提物分离得到2.8mg该化合物）。

在文献“Metabolites of bird’s nest fungi.Part 11.Diterpenoid metabolites of Cyathusearlei.，Can.J.Chem.,1979,57,3332-3337.”中，作者通过核磁共振等方法确定了活性化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol的结构，并测试了它们对Staphyloccocus aureus的抗菌活性，结果表明，这两个化合物对所测试菌株有一定的抑制活性。

肿瘤是众所周知的严重危害人类健康的疾病之一（CA-Cancer J.Clin.2011,61,69-90）。在目前众多的治疗方法中，由于化疗药物可以随血液循环到达全身各部，故而化学疗法（包括免疫疗法）在原发癌、继发转移癌和白血病的治疗中发挥着不可代替的作用(Nat.Rev.Cancer 2005,5,65-72)。理想的化疗药物应具有作用靶点专一，体内特异性靶向肿瘤组织，作用机制明确，对正常组织毒副作用小等特点（Science 2001,293,58-59）。由于传统化疗药物的毒性、副作用和耐药性的不断出现，使得抗肿瘤化疗疗效降低或疗效失效，因此，寻找新型抗肿瘤药物，已经迫在眉睫。目前抗肿瘤药物研发的焦点主要从传统的细胞毒类药物转移到针对肿瘤信号转导通路的新型抗肿瘤药物。

在国内外专利文献报道中，均未涉及11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol化合物的抗肿瘤活性报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微生物发酵制备式II（11-O-acetylcyathatriol）和/或式III（15-O-acetylcyathatriol）所示的化合物的方法及其专用菌株。

(式Ⅱ）                (式Ⅲ）

本发明所提供的专用菌株为非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38，该菌株分离来自山西五台山，L38菌株的担子果为倒锥形，高6-8mm，口部宽9-11*6.5-8μm；包被无明显纵条纹；小包具单层皮层和膜，扁圆，1.9-2.5*1.8-2.0mm；担孢子卵形具有一小尖，9-12.0*6.5-8.0。

非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38已于2012年07月04日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO.6259。

发酵非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38 CGMCC NO.6259在制备式II所示化合物（11-O-acetylcyathatriol）和/或式III所示化合物（15-O-acetylcyathatriol）中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供利用发酵非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38 CGMCC NO.6259制备式II所示化合物（11-O-acetylcyathatriol）和式III所示化合物（15-O-acetylcyathatriol）的方法。

所述制备式II所示化合物（11-O-acetylcyathatriol）和式III所示化合物（15-O-acetylcyathatriol）的方法，包括以下步骤：

1）将发酵非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38 CGMCC NO.6259接种到固体培养基上进行固体发酵培养；

2）在步骤1）的固体发酵后，向培养基加入有机溶剂提取，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物；

其中，步骤1）中，固体培养基由基材和水混合得到；所述基材可选自小麦、粳米、玉米、糯米、籼米和薏米中的一种或两种以上任意组合；所述固体培养基的含水量是所述的基材总重量的100-150%。

所述步骤1）中，所述固体发酵培养的条件是18-28℃，避光静止培养20-60天。所述固体发酵培养的条件优选为25℃，静止培养30天。

所述步骤2）中，所述有机溶剂是乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、异丙醇和正丁醇中的任意一种。

所述方法中，还包括将所述粗提物进行常压硅胶层析或凝胶色谱分离得到式II所示化合物（11-O-acetylcyathatriol）和/或式III所示化合物（15-O-acetylcyathatriol）。

其中，常压硅胶层析的方法，以氯仿和丙酮的混合液为溶剂，按照溶剂中氯仿和丙酮的比例依次是100:0、100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1的洗脱梯度进行梯度洗脱，每个梯度洗脱溶剂1500毫升，每350毫升收集为一个流份；将氯仿和丙酮的比例为10:1的洗脱溶剂洗脱的第二个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置，析出无色结晶，得到式Ⅱ所示的化合物；将氯仿和丙酮的比例为10:1的洗脱溶剂洗脱的第三个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置过夜，析出无色结晶，得到式Ⅲ所示的化合物。所述常压硅胶层析（硅胶柱层析分离）所用的填料为200-300目的硅胶颗粒，填料为150g，硅胶柱规格为Φ4.5×80cm。

所述步骤1）中，还包括在固体发酵之前将非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38CGMCC NO.6259在PDA固体培养基上进行预培养，取预培养后的菌丝体转接到液体培养基中进行培养；预培养的条件为：25-28℃，避光培养5-7天；液体培养的条件为：25-28℃，避光培养7-10天。

所述PDA培养基的组成为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，水定容至1L；所述液体培养基的组成为：葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物10.0g/L，酵母4.0g/L，水定容至1L。

本发明利用高产菌株非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38发酵制备化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol，并且对该菌采用多种条件进行培养，检测了该化合物的最佳获取时期，均可得到较高的纯化合物产率（即纯化合物与粗提物质量比，其中化合物11-O-acetylcyathatriol一般在12%以上）。可实现化合物的最佳收率，进而具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、生产cyathane类二萜化合物11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol的菌株非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38的获得

一、非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38的分离

本发明人在微生物次生代谢产物活性化合物的高通量筛选基础上，从山西五台山Cyathus africanus子实体中分离得到的一株非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）的固体发酵的提取物具有较好的抗肿瘤活性；通过活性跟踪指导下的进一步分离纯化，得到产量较高而且易纯化到化合物的菌株，并将该菌株命名为L38。

具体分离方法是，首先，用消毒酒精对采集的子实体进行表面消毒，再用无菌水清洗，然后，将子实体中小包切成小块，最后，接种在PDA培养基上，分离纯化得到菌株。

二、非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38的鉴定。

1、形态和生理生化鉴定

L38菌株的担子果为倒锥形，高6-8mm，口部宽5-8mm，基部的菌丝垫明显，直径5.5mm；包被外侧浅色，内侧浅褐色，无明显纵条纹，口缘平整无流苏；小包具单层皮层和膜，扁圆，1.9-2.5*1.8-2.0mm；担孢子，卵形，具有一小尖，9-12.0*6.5-8.0μm。

该L38菌株符合下述非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）模式DAOM200370描述的特征：

非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）属黑蛋巢菌属（Cyathus），其主要形态特征是担子果呈杯形、倒圆锥形或漏斗形，高5-8mm，口部宽5-8mm，直径可达6mm，基部具菌丝垫；包被有三层（中间为拟薄壁组织），外侧沙土色、污棕黄色、橄榄色、浅褐色至褐色，被有粉黄、淡黄、沙土色、棕黄色的细绵毛，常紧贴于包被壁，有时也结成小簇，平滑无条纹；内侧一般比外侧稍浅些，多数平滑，口缘平整。顶部盖有一白色薄盖膜，成熟时一般消失。小包扁，宽椭圆形，2-2.5*1.8-2.3mm，灰色或黑色，具单层皮层，一层浅黄至浅褐色的膜。担孢子卵形，多数一端具小尖，8.5-11.0(-14.0)*(5.5-)6.5-8.0(-9.0)μm壁较薄，无色，非淀粉质，一般壁厚；菌丝无色，具有明显的锁状联合；地生、腐木生、粪生或生于枯枝落叶层上。

对L38菌株的分子鉴定表明，其18Sr DNA的序列如序列表中序列1所示，与美国国家生物技术信息中心（NCBI）中登录号为DQ463342.1非洲黑蛋巢的序列相似度，达到100%，根据以上形态学、生理生化特征以及18Sr DNA，将菌株L38鉴定为非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）。

非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38已于2012年07月04日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC NO.6259。

实施例2、利用非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38生产11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol

一、菌株活化、发酵培养

1、种子液的获得：

将非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38接种到PDA试管琼脂培养基斜面上，进行预培养；预培养的条件为：25℃，避光培养7天（PDA培养基组成：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，纯净水定容至1L(pH自然)）。待菌丝长满整个斜面后，在无菌条件下将菌丝体转接到液体培养基中进行培养，得到种子培养液；液体培养的条件为：25℃，避光培养7天。液体培养基：葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物（Malt Extract）10.0g/L，酵母（Yeast Extract）4.0g/L，水定容至1L；酵母提取物（Yeast Extract）购自Oxoid Ltd.，批号为1074139。

2、固体发酵培养：

取10毫升种子培养液分别接种到经过灭菌的装有固体培养基（固体培养基由80g籼米和120ml水组成）的500毫升三角瓶中，接种10瓶，25℃，避光发酵培养30天。（每个三角瓶发酵后的菌丝体干重为75.5g）。

二、化合物的提取分离

1、有机溶剂提取

固体发酵结束后，将300毫升乙酸乙酯分别加到各个三角瓶中，常温浸泡提取一周，重复提取3次，合并乙酸乙酯提取液减压蒸馏干燥，得浸膏，即12.5g乙酸乙酯提取物（提取率为12.5/755=1.66%）。

2、化合物的分离纯化

将乙酸乙酯提取物经过硅胶开放柱色谱（青岛海洋化工有限公司200-300目,柱层析硅胶150g；Φ4.5×80cm）分离，氯仿-丙酮混合溶剂梯度洗（100:0,100:1,50:1,30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,2:1;体积比），每个梯度洗脱溶剂1500毫升，每350毫升收集为一个流份。将氯仿-丙酮10:1洗脱的第二个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置过夜，析出无色结晶，得到式Ⅱ所示化合物(11-O-acetylcyathatriol,2.1g（纯化合物产率为2.1/12.5=16.8%）)。将氯仿-丙酮10:1洗脱的第三个流份减压浓缩干燥后溶解于10毫升甲醇溶液中，室温静置过夜，析出无色结晶，得到式Ⅲ所示的化合物（15-O-acetylcyathatriol，0.32g，纯化合物产率为0.32/12.5=2.56%）。

3、化合物结构确证

式Ⅱ化合物：无色晶体；比旋光度值 HRESIMS m／z385.2357[M+Na]⁺；氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）见表1。依据化合物的理化性质、氢谱、碳谱数据，并与参考文献数值比对（Can.J.Chem.,1979,57(24),3332-3337；Biosci.Biotechnol.Biochem.,2004,68(8),1786-1789.），确定该化合物的结构与11-O-acetylcyathatriol相同。

式Ⅲ化合物：无色油状；比旋光度值 HRESIMS m／z385.2340[M+Na]⁺；氢谱（¹H-NMR）见表1。依据化合物的理化性质、氢谱数据，并与参考文献数值比对（Can.J.Chem.,1979,57(24),3332-3337），确定该化合物的结构与15-O-acetylcyathatriol相同。

表1.化合物的NMR数据

^a 1H NMR at 500Hz,¹³C NMR at 125Hz in CD₃OD.

^b 1H NMR at 500Hz in CDCl₃.

实施例3、利用非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38生产11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol

实施例3方法同实施例2，不同之处：一，固体培养基配方，其配方为：80g薏米，120ml蒸馏水；二，培养时间也不同，为40天；三，每个三角瓶发酵后的菌丝体干重为74.3g；四，有机溶剂提取中所用溶剂为丙酮，得到13.2g提取物（提取率为13.2/743=1.77%）。按照实施例2的步骤二的方法分离得到式Ⅱ所示化合物(11-O-acetylcyathatriol,1.7g（纯化合物产率为12.9%）)，式Ⅲ所示的化合物（15-O-acetylcyathatriol，0.31g，纯化合物产率为2.35%）

实施例4、利用非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38生产11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol

实施例4方法同实施例2，不同之处：一，固体培养基配方，其配方为：玉米40g，小麦40g，120ml蒸馏水；二，每个三角瓶发酵后的菌丝体干重为75.7g；三，有机溶剂提取中所用溶剂为甲醇，得到15.0g提取物（提取率为15.0/757=1.98%）。式Ⅱ所示化合物(11-O-acetylcyathatriol,1.83g（纯化合物产率为12.2%）)，式Ⅲ所示的化合物（15-O-acetylcyathatriol，0.28g，纯化合物产率为1.87%）

实施例5、利用非洲黑蛋巢（Cyathus africanus）L38生产11-O-acetylcyathatriol和15-O-acetylcyathatriol

实施例5方法同实施例2，不同之处：一，固体培养基配方，其配方为：玉米80g，100ml蒸馏水；二，培养时间也不同，为40天；三，每个三角瓶发酵后的菌丝体干重为76.4g；四，有机溶剂提取中所用溶剂为乙醇，得到17.7g提取物（提取率为17.7/764=2.32%）。式Ⅱ所示化合物(11-O-acetylcyathatriol,2.2g（纯化合物产率为12.4%）)，式Ⅲ所示的化合物（15-O-acetylcyathatriol，0.44g，纯化合物产率为2.45%）

11-氧乙酰鸟巢烷三醇和15-氧乙酰鸟巢烷三醇的生产方法及其专用菌株专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。