专利摘要

本发明涉及能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(I)及其应用。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(HT琥珀酸酯)及其应用，采用HT标记的探针能够有效的甄别DPYD*9A位点野生型和突变型模板，可用于检测消化系统肿瘤，具有重要应用前景。

权利要求

1.一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物，所述化合物结构如式(I)所示：

2.如权利要求1所述标记化合物在提高寡核苷酸链Tm值中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用方法如下：

(1)将所述标记化合物与带有氨基的寡核苷酸按照摩尔比1～30：1溶于pH 7～10的碳酸氢钠水溶液中，在20～60℃下进行反应1～48小时，得到带有标记化合物的寡核苷酸粗产物；

(2)将步骤(1)得到的粗产物采用沉淀、PAGE或者高效液相方法进行纯化，得到纯化后的带有标记化合物的寡核苷酸，即Tm值提高后的寡核苷酸链。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述Tm值提高后的寡核苷酸链用于检测消化系统肿瘤。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物及其应用。

(二)背景技术

实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。

目前有下面几种常用的荧光定量方法：TaqMan探针、Beacon探针、FRET技术等。MGB探针是在TaqMan探针基础上研发的一种探针修饰方法，该探针是指带有一个小沟结合物基团的DNA探针，它可与单链的靶DNA形成极为稳定的异源双链，同时这种探针相对于通常的探针序列更短一些。

研究表明，一般情况下，同MGB-寡核苷酸形成的错配异源双链其熔点温度比没有MGB的寡核苷酸形成的双链熔点温度高，而且由于ΔTm(完全匹配的Tm值与错配的Tm值之差)由错配的位置和类型决定，在小沟结合区内形成的错配特别不稳定。比起通常的寡核苷酸探针，MGB寡核苷酸探针更容易辨认在MGB结合区形成的错配。同时分子分析表明，与寡核苷酸探针3′连接的MGB可向探针的5′－末端滑行1-2bp，以便有更好的小沟结合位。MGB结构连接到12-18mer的寡核苷酸时，能显著增加异源双链的稳定性。据报道，Tm值在66-70℃之间，而没有MGB的相同序列Tm值在44～56℃。探针越短，整体异源双链的稳定性越大。有研究表明，一个没有MGB的27mer寡核苷酸探针形成的异源双链的稳定性(Tm＝65℃)与有MGB的12mer寡核苷酸探针(Tm＝66℃)相同，从这12mer的寡核苷酸探针的序列中可以看出，富含A/T的3′－末端附近的MGB配体对稳定性的作用等于在序列的5′－末端另加15个mer。

目前的MGB探针是MGB结构连接在3’端的淬灭基团上，而且结构单一的使用了DPI3，因次，目前的MGB探针不适合做多重荧光定量检测，另外针对不同基因设计的灵活性不够高，造成很多地方应用的局限性。

但是MGB探针虽然可以提高探针的Tm值，但是大部分情况下会抑制PCR的扩增，因此，需要寻找一种新的方法，对PCR扩增不产生影响且可以提高探针的Tm值。

(三)发明内容

本发明目的即是提供一种提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物，及其在提高寡核苷酸链Tm值中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(Hoechst 33258-琥珀酸酯，以下简称HT琥珀酸酯)，所述化合物结构如式(I)所示：

该标记化合物能直接嵌入DNA双螺旋结构或者能够与DNA双螺旋结构中的小沟结合从而形成稳定DNA的双螺旋，从而提高被修饰的寡核苷酸链的Tm值。

本发明还涉及所述标记化合物在提高寡核苷酸链Tm值中的应用。

具体的，所述应用方法如下：

(1)将所述标记化合物与带有氨基的寡核苷酸按照摩尔比1～30：1溶于pH 7～10的碳酸氢钠水溶液中，在20～60℃下进行反应1～48小时，得到带有标记化合物的寡核苷酸粗产物；

(2)将步骤(1)得到的粗产物采用沉淀、PAGE或者高效液相方法进行纯化，得到纯化后的带有标记化合物的寡核苷酸，即Tm值提高后的寡核苷酸链。

进一步，所述Tm值提高后的寡核苷酸链可用于检测消化系统肿瘤，采用该Tm值提高后的寡核苷酸链，能有效的甄别野生型和突变型模板。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物(HT琥珀酸酯)及其应用，采用HT琥珀酸酯标记的探针能够有效的甄别DPYD*9A位点野生型和突变型模板，可用于检测消化系统肿瘤，具有重要应用前景。

(四)附图说明

图1为采用HT琥珀酸酯标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果；

图2为采用MGB标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果；

图3为采用TaqMan标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果；

图4为采用LNA标记的荧光定量PCR探针检测DPYD*9A位点(T85C)的检测图；其中，A：野生型模板检测结果；B：突变型模板检测结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：合成标记化合物

一种提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物，该标记化合物为一种琥珀酸酯，简称HT琥珀酸酯，HT琥珀酸酯的制备步骤为：

将1.8g Hoechst 33258与1.48g碳酸钾溶解在20ml DMF中，加入0.8ml 4-溴丁酸乙酯，将反应混合物在60℃加热12小时，冷却，过滤，旋蒸，剩余物质溶解在甲醇中，用硅胶柱纯化，甲醇和二氯甲烷最为洗脱剂，得到的产品用乙醇重结晶得到hoechst 33258-O-丁酸乙酯1.4g。1H NMR(DMSO-d6)δ1.19(3H),2.03(2H,m),2.45(2H,m),2.90(3H),3.08 and 3.16(4H,m),3.90(4H,m),4.08-4.12(4H,m),7.21(3H,m),7.34(1H,m),7.73(1H,d),7.94(1H,d),8.14(1H,m),8.24(2H,m),8.57(1H,s).

将1.3g hoechst 33258-O-丁酸乙酯放入5ml 1M NaOH和5ml乙醇中，加热到60℃1h，反应混合物冷却然后用10％的盐酸酸化到pH为4，产物析出，过滤，滤饼用水，丙酮和乙醚洗涤，干燥的到hoechst 33258-O-丁酸。1H NMR(DMSOd6)δ1.99(2H,m),2.42(2H,t),2.45(3H,s),2.84(4H,m),3.44(4H,s),4.10(2H,t),6.99(1H,d),7.11(3H,m),7.50(1H,d),7.66(1H,m),8.06(1H,d),8.24(2H,d),8.40(1H,s).

琥珀酸酯的合成：

将0.43g hoechst 33258-O-丁酸溶解在5ml DMF中，加入0.68ml三乙胺，然后加入0.31g TSTU，室温反应1h后倒入石油醚中，过滤，得到产物hoechst 33258-琥珀酸酯0.3g。

1H NMR(DMSOd6)δ1.99(2H,m),2.42(2H,t),2.45(3H,s),2.64(4H,m)，2.84(4H,m),3.44(4H,s),4.10(2H,t),6.99(1H,d),7.11(3H,m),7.50(1H,d),7.66(1H,m),8.06(1H,d),8.24(2H,d),8.40(1H,s).

实施例2：带有标记化合物的寡核苷酸的合成与纯化

提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物的标记方法，主要包括以下步骤：

(1)将Hoechst 33258-琥珀酸酯(化合物结构式I)5mg溶解在3mlDMF(二甲基甲酰胺)与3ml 0.1M NaHCO₃中，加入3.2mg amino修饰的寡核苷酸(C*TGCTCCCCGCGT*G和C*TGCTCCCCCCGT*G，其中*为氨基修饰)25℃反应2小时，可得到带有标记化合物的寡核苷酸粗产物；

(2)将步骤(1)得到带有标记化合物的寡核苷酸粗产物采用HPLC(高效液相色谱法)(C18柱，TEAAPH＝7.0体系分离)方法对寡核苷酸进行纯化，即可得到纯的带有标记化合物的寡核苷酸(野生型：C^#TGCTCCCCGCGT^#G，tm：67；突变型：C^#TGCTCCCCCCGT^#G，tm：67，其中，带^#为HT琥珀酸酯修饰的核苷酸)。

实施例3：HT琥珀酸酯在荧光定量PCR检测的探针特异性评价(在荧光定量PCR探针检TP53位点中的应用)

1、材料：

质粒基因组DNA提取试剂、PCR反应体系和Taq DNA聚合酶，pGEM-T-Easy克隆系统购自Promage公司、CFX96定量PCR仪为美国Biorad公司产品。

2、质粒标准品检测：

野生型和突变型TP53位点质粒为人工合成，由山东维真生物科技有限公司提供，采用质粒基因组DNA提取试剂提取基因组DNA，分别取1.0μL做模板，用检测用上下游引物在Biorad公司CFX96型定量PCR仪上进行PCR扩增。

PCR反应液组成如下：

1×PCR buffer2μL

野生型探针(10μM) 0.2μL

突变型探针(10μM) 0.2μL

上游引物：CAATGGTTCACTGAAGACCCA (10μM)1μL

下游引物：CGGTGTAGGAGCTGCTGGT (10μM)1μL

DNA聚合酶(5U/μL) 0.2μL

dNTPs(各250mM) 1.60μL

(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1：1：1：1)

模板DNA(50ng/μL) 1μL

水补足至20μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增。

3、四种修饰探针的特异性比较：

上游引物：CAATGGTTCACTGAAGACCCAtm：58

下游引物：CGGTGTAGGAGCTGCTGGTtm：58

TaqMan标记：

TaqMan-C(野生型)：CAGAGGCTGCTCCCCGCGT，tm：66

TaqMan-T(突变型)：CAGAGGCTGCTCCCCCCGT，tm：66

以ABI primer express3.0软件设计。

MGB标记：

TaqMan-MGB-C(野生型)：CTGCTCCCCGCGTG，tm：66

TaqMan-MGB-T(突变型)：CTGCTCCCCCCGTG，tm：66

以ABI primer express3.0软件设计。

LNA标记：

LNA-TaqMan-C(野生型)：CTGC+TCCCCG+CGTG，tm：70

LNA-TaqMan-T(突变型)：CTGC+TCCCCC+CGTG，tm：70

其中+号代表后面一个碱基为LNA修饰碱基，tm值符合EXIQON公司设计原则。

HT琥珀酸酯标记：

HT-C(野生型)：C^#TGCTCCCCGCGT^#G，tm：67

HT-T(突变型)：C^#TGCTCCCCCCGT^#G，tm：67

其中，带^#为HT琥珀酸酯修饰的核苷酸，其他组探针的MGB修饰、TaqMan修饰和LNA修饰的核苷酸按本领域常规。

将野生型和突变型检测探针分别采用HT琥珀酸酯标记、MGB标记、TaqMan标记和LNA标记，采用上述反应体系分别对野生型和突变型TP53位点质粒进行检测，图1为HT琥珀酸酯标记探针分别检测野生型(A)和突变型(B)模板的结果；图2为MGB标记探针分别检测野生型(A)和突变型(B)模板的结果；图3为TaqMan标记探针分别检测野生型(A)和突变型(B)模板的结果；图4为LNA标记探针分别检测野生型(A)和突变型(B)模板的结果。

结果显示HT琥珀酸酯标记的探针和MGB标记的探针均能有效的甄别野生型和突变型模板(见图1和图2)，而TaqMan标记和LNA标记的探针无法准确的检测与探针序列完全匹配的质粒标准品模板(见图3和图4)。

能够提高寡核苷酸链Tm值的标记化合物及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。