专利摘要

本发明分室培养连续扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法，是将培养室分为若干个隔离室并填充下层基质、中层基质与上层基质，进行间隔连续培植接种分离，由于丛枝菌根真菌可侵染宿主植物根系产生菌丝网，以及菌丝网的扩散与侵染性，所以只需要进行一次接种，丛枝菌根真菌孢子在相邻的隔离室中新萌发的幼苗根系就可以被其侵染，所以相对于单盆培养法具有连续性；丛枝菌根真菌的生活史为90天，每个隔离室中的宿主植物培养120天后，经遮光处理使宿主植物死亡而产生大量丛枝菌根真菌孢子，因此每间隔的天数为120与隔离室个数的比值，即可获得新鲜的丛枝菌根真菌孢子，相比于双重培养体系法，本发明培养条件要求低，操作方便，培养室可循环利用，可行性高。

权利要求

1.分室培养连续扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法，其特征在于：

a.制备培养室：用隔离板(2)将培养盆体(1)等分为若干个隔离室，隔离板(2)高度与培养盆体(1)深度一致，在每个隔离板(2)上部分别开有矩形槽，在培养盆体(1)底端开有若干个排水孔(3)，在隔离室底部填充具有良好吸水性、保水性及透气性的下层基质(4)，在下层基质(4)上填充粒径较大，吸水性及保水性差的中层基质(5)，在中层基质(5)上面分别铺设滤布(6)，在滤布(6)上面分别填充蛭石与白沙体积比为1:1的混合基质(7)至装满培养盆体(1)，下层基质(4)与中层基质(5)填充厚度分别为培养盆体(1)深度的五分之二和十分之一，构成培养室，培养室为圆柱形或矩形或其它形状，培养室下面放置托盘(8)；

b.首先在其中任一个隔离室中播种宿主植物种子，待其长成幼苗后在根系附近接种从野外分离且鉴定的或人工扩繁的丛枝菌根真菌孢子，通过隔离室中的宿主植物进行丛枝菌根真菌孢子的连续扩繁，每间隔的天数为120与隔离室个数的比值，依照隔离室的排列顺序在相邻隔离室中相继播种宿主植物种子，使其长成幼苗但不接种丛枝菌根真菌孢子；

c.每间隔15天在托盘中浇注较高磷浓度的Hoagland营养液，每间隔30天，在上层基质中浇注较低磷浓度的Hoagland营养液，同时往上层基质和托盘中浇水，保持基质含水量在50％～60％，以保证宿主植物和丛枝菌根真菌菌丝的生长；

d.120天后，对首次播种的隔离室中宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，每间隔的天数为120与隔离室个数的比值，按照原播种顺序依次对其它隔离室中的宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，任意一个隔离室中的宿主植物死亡后，移走这个隔离室中的上层基质，收集中层基质和下层基质，利用湿筛倾析法获取丛枝菌根真菌孢子；

e.取出任意一个隔离室中的基质后，保留上层基质重复利用，并依照上述步骤制备新的培养室，再次按原播种顺序进行播种接种宿主植物，经多次循环往复操作，获取所需用的丛枝菌根真菌孢子。

2.根据权利要求1所述的分室培养连续扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法，其特征在于：

a.制备培养室：选用圆形培养盆体(1)，用两块十字交叉的隔离板(2)将培养盆体(1)等分为四个隔离室，隔离板(2)高度与培养盆体(1)深度一致，在每个隔离板(2)上部分别开有矩形槽，用玻璃胶将隔离板(2)与培养盆体(1)之间的缝隙密封，在培养盆体(1)底端开有四个排水孔(3)，在隔离室底部填充的下层基质(4)为直径2mm的白沙，在白沙上填充的中层基质(5)为直径4mm的玻璃珠，在玻璃珠上铺设45μm的滤布”(6)，滤布(6)紧贴隔离板(2)上的矩形槽，在滤布(6)上面分别填充蛭石与白沙体积比为1:1的混合基质(7)至装满培养盆体(1)，白沙与玻璃珠填充厚度分别为培养盆体(1)深度的五分之二和十分之一，形成培养室，培养室下面放置托盘(8)；

b.首先在其中任一个隔离室中播种宿主植物种子，待其长成幼苗后在根系附近接种从野外分离且鉴定的丛枝菌根真菌孢子，通过隔离室中的宿主植物进行丛枝菌根真菌孢子的连续扩繁，每间隔30天，按顺时针方向在相邻的隔离室中相继播种宿主植物种子，使其长成幼苗但不接种丛枝菌根真菌孢子；

c.每间隔15天在托盘中浇注磷浓度为200μM·L-1的Hoagland营养液，每间隔30天在混合基质中浇注磷浓度为1μM·L-1的Hoagland营养液，同时往混合基质和托盘中浇水，保持基质含水量在50％～60％；

d.120天后，对首次播种的隔离室中宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，每间隔30天，按照隔离室中播种顺序依次对其他三个隔离室中的宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，任意一个隔离室中的宿主植物死亡后，移走这个隔离室中的混合基质，收集玻璃珠和白沙，利用湿筛倾析法获得丛枝菌根真菌孢子；

e.取出任意一个隔离室中的基质后，保留混合基质重复利用，并依照上述步骤制备新的培养室，再次按原播种顺序进行播种接种宿主植物，经多次循环往复操作，获取所需用的丛枝菌根真菌孢子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法，具体是一种分室培养连续扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法，属于微生物学领域。

背景技术

丛枝菌根真菌是专性活体营养共生的球囊菌门真菌，它不能在体外进行纯培养，只能通过丛枝菌根真菌菌丝侵染活体宿主植物根系形成共生体系，然后才能产生丛枝菌根真菌孢子，丛枝菌根真菌孢子是丛枝菌根真菌的休眠体，当其遇到宿主植物时会萌发出丛枝菌根真菌菌丝，然后侵染宿主植物根系重新形成共生体系。丛枝菌根真菌可以与超过80％的陆地维管束植物形成共生体，在干旱贫瘠的土壤中，丛枝菌根真菌菌丝可以延伸至宿主植物根系生长所达到的区域范围外，为宿主植物提供氮、磷等矿质元素和水分。此外，丛枝菌根真菌孢子产生的根外菌丝可以在宿主植物之间形成菌丝网，进行宿主植物间的物质输送和信息传递。因此，研究丛枝菌根真菌与宿主植物共生的机制以及丛枝菌根真菌对宿主植物和生态系统的功能较广泛,在生产中可以通过宿主植物根系菌根化而提高宿主植物抗逆性。然而在野外条件下有活性的野生丛枝菌根真菌孢子数目很少，无法满足生产应用的需求，而且分离鉴定较繁琐。丛枝菌根真菌与宿主植物根系形成共生体系后，如果使丛枝菌根真菌宿主死亡，丛枝菌根真菌菌丝就会产生大量丛枝菌根真菌孢子，为人工扩繁丛枝菌根真菌孢子提供了可能。

目前获得丛枝菌根真菌孢子的主要方法为单盆培养法和双重培养体系法。单盆培养法是指先种植宿主植物，然后接种丛枝菌根真菌孢子，待孢子萌发后侵染宿主植物根系，通过宿主植物生长达到孢子的扩繁。如国家知识产权局公开的《一种分层培养富集丛枝菌根真菌孢子的方法》(CN106190944B)，这种方法可以富集大量丛枝菌根真菌孢子，但是缺乏连续性，由于宿主植物生长和丛枝菌根真菌孢子的产生周期较长，所以多次扩繁就需要较长时间。双重培养法是指在无菌条件下，对培养基上的宿主植物接种萌发丛枝菌根真菌孢子，然后丛枝菌根真菌菌丝侵入根系内部形成共生体，通过根系的生长培养丛枝菌根真菌，最终获得丛枝菌根真菌孢子，这种方法培养条件要求严格且获得的孢子数量较少，无法满足生产应用中的大量需求。目前尚没有一种简单实用且可以连续获得丛枝菌根真菌孢子的方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服目前方法获得丛枝菌根真菌孢子的缺陷，而公开一种分室培养连续扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

a.制备培养室：用隔离板将培养盆体等分为若干个隔离室，隔离板高度与培养盆体深度一致，在每个隔离板上部分别开有矩形槽，在培养盆体底端开有若干个排水孔，在隔离室底部填充具有良好吸水性、保水性及透气性的下层基质，在下层基质上填充粒径较大，吸水性及保水性差的中层基质，在中层基质上面分别铺设滤布，在滤布上面分别填充蛭石与白沙体积比为1:1的混合基质至装满培养盆体，下层基质与中层基质填充厚度分别为培养盆体深度的五分之二和十分之一，构成培养室，培养室可以为圆柱形或矩形或其它形状，培养室下面放置托盘；

b.首先在其中任一个隔离室中播种宿主植物种子，待其长成幼苗后在根系附近接种从野外分离且鉴定的或人工扩繁的丛枝菌根真菌孢子，通过隔离室中的宿主植物进行丛枝菌根真菌孢子的连续扩繁，每间隔的天数为120与隔离室个数的比值，依照隔离室的排列顺序在相邻隔离室中相继播种宿主植物种子，使其长成幼苗但不接种丛枝菌根真菌孢子；

c.每间隔15天在托盘中浇注较高磷浓度的Hoagland营养液，每间隔30天，在上层基质中浇注较低磷浓度的Hoagland营养液，同时往上层基质和托盘中浇水，保持基质含水量在50％～60％，以保证宿主植物和丛枝菌根真菌菌丝的生长；

d.120天后，对首次播种的隔离室中宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，每间隔的天数为120与隔离室个数的比值，按照原播种顺序依次对其它隔离室中的宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，任意一个隔离室中的宿主植物死亡后，移走这个隔离室中的上层基质，收集中层基质和下层基质，利用湿筛倾析法获取丛枝菌根真菌孢子；

e.取出任意一个隔离室中的基质后，可以保留上层基质重复利用，并依照上述步骤制备新的培养室，再次按原播种顺序进行播种接种宿主植物，经多次循环往复操作，获取所需用的丛枝菌根真菌孢子。

本发明培养室分为若干个隔离室，进行间隔连续培植接种分离，由于丛枝菌根真菌可侵染宿主植物根系产生菌丝网，以及菌丝网的扩散与侵染性，所以只需要进行一次接种，丛枝菌根真菌孢子在相邻的隔离室中新萌发的幼苗根系就可以被其侵染，所以相对于单盆培养法具有连续性；丛枝菌根真菌的生活史约为90天，每个隔离室中的宿主植物培养120天后，经遮光处理使宿主植物死亡而产生大量丛枝菌根真菌孢子，因此每间隔的天数为120与隔离室个数的比值，即可获得新鲜的丛枝菌根真菌孢子，相比于双重培养体系法，本发明培养条件要求低，操作方便，培养室可循环利用，可行性高。

附图说明

附图1为本发明培养室主视剖面示意图。

附图2为本发明培养室俯视示意图。

附图标记说明如下：

培养盆体1，隔离板2，排水孔3，下层基质4，中层基质5，滤布6，上层基质7，托盘8。

具体实施方式

以下结合实施例及附图对本发明进行具体详细说明：

a.制备培养室：选用圆形培养盆体(1)，用两块十字交叉的隔离板(2)将培养盆体(1)等分为四个隔离室，隔离板(2)高度与培养盆体(1)深度一致，在每个隔离板(2)上部分别开有矩形槽，用玻璃胶将隔离板(2)与培养盆体(1)之间的缝隙密封，在培养盆体(1)底端开有四个排水孔(3)，在隔离室底部填充直径约为2mm的白沙(4)，在白沙(4)上填充直径为4mm的玻璃珠(5)，在玻璃珠(5)上铺设45μm的滤布(6)，滤布(6)紧贴隔离板(2)上的矩形槽，在滤布(6)上面分别填充蛭石与白沙体积比为1:1的混合基质(7)至装满培养盆体(1)，白沙(4)与玻璃珠(5)填充厚度分别为培养盆体(1)深度的五分之二和十分之一，形成培养室，培养室下面放置托盘(8)；

b.首先在其中任一个隔离室中播种宿主植物种子，待其长成幼苗后在根系附近接种从野外分离且鉴定的丛枝菌根真菌孢子，通过隔离室中的宿主植物进行丛枝菌根真菌孢子的连续扩繁，每间隔30天，按顺时针方向在相邻的隔离室中相继播种宿主植物种子，使其长成幼苗但不接种丛枝菌根真菌孢子；

c.每间隔15天在托盘中浇注磷浓度为200μM·L^-1的Hoagland营养液，每间隔30天在混合基质中浇注磷浓度为1μM·L^-1的Hoagland营养液，同时往混合基质和托盘中浇水，保持基质含水量在50％～60％；

d.120天后，对首次播种的隔离室中宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，每间隔30天，按照隔离室中播种顺序依次对其他三个隔离室中的宿主植物进行遮光处理，使宿主植物死亡，任意一个隔离室中的宿主植物死亡后，移走这个隔离室中的混合基质，收集玻璃珠和白沙，利用湿筛倾析法获得丛枝菌根真菌孢子；

e.取出任意一个隔离室中的基质后，可以保留混合基质重复利用，并依照上述步骤制备新的培养室，再次按原播种顺序进行播种接种宿主植物，经多次循环往复操作，获取所需用的丛枝菌根真菌孢子。

分室培养连续扩繁丛枝菌根真菌孢子的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。