专利摘要
本发明涉及乙烯利在促进白僵菌产孢中的应用。在白僵菌的菌丝生长阶段或分生孢子形成阶段施用乙烯利，可以显著促进所述白僵菌分生孢子的产生。
权利要求
1.一种促进白僵菌产孢的方法，其包括在白僵菌的菌丝生长阶段或分生孢子形成阶段施用乙烯利，对于白僵菌JG-17菌株，乙烯利的用量为100ng/cm
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在白僵菌菌丝生长阶段的第1/2至4/5的阶段施用所述乙烯利。
3.一种促进白僵菌产孢的方法，其包括在白僵菌的菌丝生长阶段施用乙烯利，对于白僵菌HFW-05菌株，乙烯利的用量为100ng/cm
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在白僵菌菌丝生长阶段的第1/2至4/5的阶段施用所述乙烯利。
5.一种促进白僵菌产孢的方法，其包括在白僵菌的菌丝生长阶段施用乙烯利，对于白僵菌JCF菌株，乙烯利的用量为200ng/cm
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在白僵菌菌丝生长阶段的第1/2至4/5的阶段施用所述乙烯利。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于，在白僵菌的菌丝表层喷施所述乙烯利。
8.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于，培养所述白僵菌的培养基为SDAY培养基或玉米发酵培养基。
9.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于，培养所述白僵菌的温度为23℃至29℃。
10.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于，在SDAY培养基上培养所述白僵菌的温度为27℃±2℃；
在玉米发酵培养基上培养所述白僵菌的温度为25℃±2℃。
说明书
技术领域
本发明涉及乙烯利在促进白僵菌产孢中的应用。
背景技术
昆虫病原真菌白僵菌是一种广泛应用于农林害虫防治的重要生物制剂，可以寄生700多种昆虫，在我国已成功用于防治马尾松毛虫、天牛、玉米螟、金龟子等多种害虫，是目前农业生产中发展有机绿色产品的首选生物药剂。
部分真菌菌制剂的有效杀虫成分为分生孢子，分生孢子的大量生产是满足田间应用的前提。不同菌的菌种(株)产孢能力和产孢水平存在明显差异，有的菌株(种)甚至出现在培养基上不产生分生孢子的现象。在白僵菌固体发酵过程中，分生孢子形成所需时间较长，通常需要5至10天，有的白僵菌菌株(种)甚至需要15天至30天。目前实验室及生产中提高真菌产孢的方法，主要是通过改变培养基的成分及配比来实现，也有菌落损伤法、紫外线照射法、光照交替培养法等。
提高白僵菌的产孢量，缩短生产周期，是白僵菌大规模生产中急需解决的关键技术，提高产孢量对有益生防菌株的推广应用具有重要意义。
发明内容
本发明之一提供了乙烯利在促进白僵菌产孢中的应用。
本发明之二提供了一种促进白僵菌产孢的方法，其包括在白僵菌的菌丝生长阶段或分生孢子形成阶段施用乙烯利。
以白僵菌分生孢子的萌发为0，到白僵菌的菌丝生长阶段以镜检初次检到分生孢子为,1，作为白僵菌的菌丝生长阶段。在一个具体实施方式中，在白僵菌菌丝生长阶段的第1/2至4/5的阶段施用所述乙烯利。
在一个具体实施方式中，乙烯利的用量为40ng/cm2至1500ng/cm2。
在一个具体实施方式中，对于白僵菌JG-17菌株，乙烯利的用量为80ng/cm2至500ng/cm2。
在一个具体实施方式中，对于白僵菌JG-17菌株，乙烯利的用量为100ng/cm2至500ng/cm2。
在一个具体实施方式中，对于白僵菌HFW-05菌株，乙烯利的用量为100ng/cm2至1000ng/cm2。
在一个具体实施方式中，对于白僵菌JCF菌株，乙烯利的用量为200ng/cm2至1500ng/cm2。
在一个具体实施方式中，在白僵菌的菌丝表层喷施所述乙烯利。
在一个具体实施方式中，培养所述白僵菌的培养基为SDAY培养基或玉米发酵培养基。
在一个具体实施方式中，培养所述白僵菌的温度为23℃至29℃。
在一个具体实施方式中，在SDAY培养基上培养所述白僵菌的温度为27℃±2℃；在玉米发酵培养基上培养所述白僵菌的温度为25℃±2℃。
在本发明中，术语“菌丝生长阶段”是指产生分生孢子之前的阶段，即以镜检初次检到分生孢子为节点之前的阶段；术语“分生孢子形成阶段”是指产生分生孢子之后的阶段，即以镜检初次检到分生孢子为节点之后的阶段。需要指出的是，不同的白僵菌菌株及其在不同的培养基上的菌丝生长阶段和分生孢子形成阶段不尽相同。
本发明的有益效果：
本发明首次发现乙烯利有利于提高白僵菌分生孢子的产孢量，并缩短发酵周期，可极大地提高有益白僵菌分生孢子的生产效率。特别是在白僵菌菌丝生长阶段(例如菌丝生长阶段的中后期)喷施乙烯利，可以促进白僵菌孢子的形成及脱落。这为白僵菌大规模生产提供关键的技术保障所述白僵菌菌丝生长期可以在平板培养基上，也可以是其他形式的固体培养基上。该方法无需特殊设备，一般实验室或生产车间均可操作。
附图说明
图1乙烯利对三株不同白僵菌菌株的菌丝生长速率的影响。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
白僵菌JG-17菌株参见CN201711061229.6，其对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟及铜绿丽金龟均有较强的致病力，但在培养过程中产孢速度慢，产孢量低。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14781，保藏日期为2017年09月21日。
白僵菌JCF菌株参见CN201610075756.1。其产孢速度慢，产孢量低。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11338，保藏日期为2015年09月08日。
白僵菌HFW-05菌株参见CN200810089529.X。其产孢速度较快、产孢量较高。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.2356，保藏日期为2008年01月24日。
白僵菌XCCF产孢速度慢、产孢量低。
实施例1
白僵菌JG-17在SDAY平板培养基上培养至菌丝生长阶段喷施乙烯利
(1)菌种活化：将低温保存的白僵菌菌株在试管斜面上活化培养，所用活化培养基为通用的SDAY培养基，培养条件为26±1℃，斜面长满孢子后即可使用。
(2)孢悬液制备：将斜面上活化的菌种分生孢子转接到SDAY平板培养基，待产孢后用0.1％吐温-80无菌水漂洗孢子，无菌纱布过滤除去菌丝体，充分震荡制成孢悬液，血球计数板计数。
(3)SDAY平板培养制作：牛肉蛋白胨1％、葡萄糖4％、酵母浸粉1％、定容1000mL、琼脂1.6％、自然pH值，121℃灭菌30min。待培养基温度降至40-50℃时，在超净工作台将培养基倒至9cm无菌培养皿中，备用。
(4)接种及培养：在无菌操作台中，移液器吸取1×107孢子/mL白僵菌孢悬液100μL，置于SDAY平板培养基上并用涂布棒涂布均匀，在27℃下培养。
(5)设置五组不同时间施用乙烯利的处理：在培养第5天、第6天、第7天、第8天和第9天(d)的白僵菌菌丝生长阶段，分别用喷雾塔在白僵菌菌丝表层施用不同量的乙烯利水溶液。每处理3次重复。以施用无菌水的白僵菌作为空白对照(CK)。各处理均在培养后的第2天开始镜检孢子产生情况，直至第16天。镜检孢子过程如下：在各处理培养物上用打孔器均匀打孔得到菌饼，然后将菌饼放入5ml离心管并加2ml蒸馏水用研磨机(离心管中加3粒直径为1.5mm的钢珠)研磨成糊状，倒入50ml离心管中，再加28ml水稀释混匀，血球计数板计数，计算每处理的产孢量。在培养至第5天施用乙烯利时，第二天镜检即有可见孢子，其他四组处理(第6天、第7天、第8天和第9天)在第二天也均有可见孢子出现，而未施用乙烯利的空白对照直到第10天镜检才有可见孢子。第16天的产孢量结果见表1。
由表1可以看出，在白僵菌菌丝生长阶段的不同时间施用一定用量的乙烯利，除去个别处理之外，多数处理的产孢量显著高于未施用乙烯利空白对照，但不同乙烯利用量和不同时间施用乙烯利下白僵菌产孢量存在一定差异，白僵菌在SDAY上培养基上培养至第8天时，在菌落表层喷施80至500ng/cm2的乙烯利白僵菌产孢量相对更优。
表1白僵菌JG-17在SDAY培养基培养至菌丝生长阶段喷乙烯利
注：表中数据为平均数±标准误。同一列中不同字母表示经Duncan氏新复极差检测在5％水平差异显著。
实施例2
白僵菌JG-17在SDAY平板培养基上分生孢子形成阶段施用乙烯利
根据实施例1的空白对照孢子的镜检结果可知，在不加任何干预的情况下，白僵菌JG-17在SDAY固体培养基上第10天进入分生孢子形成阶段。
(1)菌种活化：同实施例1。
(2)孢悬液制备：同实施例1。
(3)SDAY平板培养制作：同实施例1。
(4)接种及培养：同实施例1。
(5)设置五组不同时间施用乙烯利的处理：在培养第10天、第11天、第12天、第13天和第14天的白僵菌分生孢子形成阶段用喷雾塔在白僵菌菌丝表层施用不同量的乙烯利水溶液。以施用无菌水的白僵菌作为空白对照。每处理3次重复。在培养至第16d时测定产孢量(同实施例1)，结果见表2。
从表2可以看出，在白僵菌分生孢子形成阶段的不同时间施用不同用量的乙烯利，白僵菌在SDAY培养基上培养10-13天时，在菌落表层喷施100ng/cm2和200ng/cm2，产孢量显著高于空白对照的产孢量。但与表1中的数据比较，可以明显的知道，在第5天至第9天在菌落表层喷施用乙烯利优于在第10天至第14天在菌落表层喷施用乙烯利。
表2白僵菌在SDAY培养基培养至分生孢子形成阶段喷乙烯利结果
注：表中数据为平均数±标准误。同一列中不同字母表示经Duncan氏新复极差检测在5％水平差异显著。
实施例3
白僵菌JG-17在玉米固体培养基上培养后施用乙烯利
(1)菌种活化：同实施例1。
(2)孢悬液制备：同实施例1。
(3)种子液制备：用无菌接种环挑取一环活化的菌株接种到100mL SDY液体培养基中，在25至28℃、转速为180至220rpm的摇床上培养17至24h，得种子液。
(4)玉米发酵培养基的配制：以玉米颗粒为固体发酵基质，将粉碎机粉碎得到的大小不规则的玉米碎颗粒在常温水中浸泡3至4小时，使玉米碎颗粒平均含水量达到25％左右，然后将玉米碎颗粒捞出并控去多余水分，添加0.4％(W/W)色拉油防止灭菌过程中玉米颗粒黏成团，同时添加0.2％(W/W)无机盐溶液(无机盐溶液各成分为0.05％KH2PO4、0.01％MgSO4、0.2％NH4NO3)，充分混合均匀后，将培养基置于40cm×22cm聚丙烯PP培养袋内，每袋装400g湿料，用聚丙烯PP管扎口，管口依次用三层棉布和封口膜封口，121℃高温蒸汽灭菌40min。
(5)接种及培养：将已灭菌的装于培养袋内玉米发酵培养基放置在接种室中，待冷却后在无菌操作台中去掉培养袋扎口处的最外层封口膜，玉米发酵培养基于培养袋中平铺展开放置在培养箱中，按10％(v/w)比例接入1×107孢子/mL白僵菌孢悬液并抖落均匀，25±2℃条件下培养，无需额外增加湿度，在培养至24h和48h时分别翻动固料以增加底部固料通气量，同时也可避免发酵过程中热量累积而出现“烧料”现象。
(6)首先确定未施用乙烯利的空白对照第5天和第8天未见分生孢子，属于菌丝生长阶段；第11天镜检有分生孢子，属于分生孢子形成阶段。
设置三组不同时间施用乙烯利的处理：将培养第5天、第8天、和第11天的培养物从培养袋移出，置于灭菌不锈钢托盘中，在白僵菌的菌丝表层均匀施用不同量乙烯利溶液。根据实施例1和实施例2的结果，选取100ng/cm2、500ng/cm2和1000ng/cm2三组不同的乙烯利喷施用量。以施用无菌水的白僵菌作为空白对照。每处理3次重复。在培养至第16d时，随机称取各处理的培养物10g，分别放在研钵中，加入10mL蒸馏水进行充分研磨，研磨后放入三角瓶中，再加入20mL蒸馏水，同时加入玻璃珠，在摇床震荡，使得孢子充分脱离玉米基质，血球计数板计数，计算每处理的产孢量。
由表3可知，白僵菌在玉米培养基上培养一段时间后，在菌丝表层施用乙烯利，所有乙烯利处理的白僵菌产孢量均显著高于空白对照，喷施100ng/cm2处理的产孢量最高。
表3白僵菌JG-17在玉米培养基培养不同时间喷乙烯利继续培养至16d产孢量
注：表中数据为平均数±标准误。同一列中不同字母表示经Duncan氏新复极差检测在5％水平差异显著。
实施例4
乙烯利对白僵菌JG-17生长速率和产孢量的影响
根据实施例1和实施例2结果，为进一步说明乙烯利的使用方式，选取产孢量较高的3个乙烯利喷施用量100ng/cm2、200ng/cm2和500ng/cm2，在SDAY培养基上测定了乙烯利对白僵菌生长发育的影响。
(1)菌种活化：同实施例1。
(2)孢悬液制备：同实施例1。
(3)SDAY平板培养制作：牛肉蛋白胨1％、葡萄糖4％、酵母浸粉1％、定容1000mL、琼脂1.6％、自然pH值，121℃灭菌30min。倒入平板待培养基冷却凝固后，，将乙烯利水溶液通过0.22μm微孔过滤器灭菌，用喷雾塔将乙烯利水溶液喷洒在SDAY培养基表层，使其在培养基表层的剂量分别为100ng/cm2、200ng/cm2和500ng/cm2，以未喷施乙烯利的培养基作为空白对照。
(4)接种及培养：在无菌操作台中，移液器吸取1×107孢子/mL白僵菌孢悬液5μL，置于SDAY平板培养基上，在25至28℃下培养。每隔2d用游标卡尺测量菌落生长直径，共测定10d，以最小二乘法计算各个处理下白僵菌菌落的生长速率。培养至第16d测定产孢量(同实施例1)。结果见表4。
从表4可以看出，在乙烯利3个使用量与对照中，生长速率之间差异不显著，但随着SDAY培养基中乙烯利浓度的增加，白僵菌生长速率有下降趋势。在乙烯利3个使用量中，产孢量之间差异也不显著，随着SDAY培养基中乙烯利浓度的增加，白僵菌产孢量也有下降趋势，以至于200ng/cm2和500ng/cm2时与对照差异不显著。与在白僵菌分生孢子形成阶段施用乙烯利(见表2)相比，在培养基中添加乙烯利处理的白僵菌单位面积的产孢量稍低。与在白僵菌菌丝生长阶段施用乙烯利(见表1)相比，在培养基中添加乙烯利处理的白僵菌单位面积的产孢量则低的多。
表4不同浓度乙烯利的SDAY培养基中白僵菌JG-17的生长速率和产孢量
注：表中数据为平均数±标准误。同一列中不同字母表示经Duncan氏新复极差检测在5％水平差异显著。
实施例5
乙烯利对不同白僵菌菌株生长速率和产孢量的影响
为说明乙烯利对不同白僵菌的促进产孢作用，比较了乙烯利对其他几种不同白僵菌菌株生长发育和产孢量的影响。其中，白僵菌XCCF和JCF均产孢速度慢、产孢量低；白僵菌HFW-05产孢速度较快、产孢量较高。
(1)菌种活化：同实施例1。
(2)孢悬液制备：同实施例1。
(3)不同用量的乙烯利对白僵菌生长速率的影响：根据实施例1和实施例2结果，同时为了进一步确定高用量乙烯利对白僵菌生长和产孢量的影响，选取乙烯利的用量为100ng/cm2、200ng/cm2、500ng/cm2、1000ng/cm2和1500ng/cm2，乙烯利在培养基中的添加方法、生长速率测定方法同实施例4。结果见图1。
从图1可以看出，在含100ng/cm2、200ng/cm2、500ng/cm2乙烯利的SDAY平板上，各菌株的生长速率和空白对照的生长速率差异不显著，随着乙烯利浓度的增加，白僵菌的生长速率显著下降。
(4)在白僵菌菌丝生长阶段(XCCF菌株为培养的第8天；HFW-05菌株为培养的第3天；JCF菌株为培养的第6天)喷施乙烯利，乙烯利在培养基中的施用方法和产孢量的测定方法同实施例1。结果见表5。
表5的数据表明，在白僵菌菌丝生长阶段，对三株不同白僵菌菌株的菌丝体表层喷施不同用量的乙烯利，在一定的喷施用量下，三株白僵菌菌株单位面积的产孢量均显著优于未施用乙烯利的空白对照。此结果进一步说明一定用量范围的乙烯利可显著促进不同菌株的白僵菌产孢，对工业化生产中提高白僵菌的生产效率具有重要意义。
表5不同菌株白僵菌在菌丝生长阶段喷施不同浓度乙烯利后的产孢量×106孢子/cm2
注：表中数据为平均数±标准误。同一行中不同字母表示经Duncan氏新复极差检测在5％水平差异显著。
实施例6
白僵菌喷施乙烯利后所得分生孢子对杀虫活性的影响
白僵菌JG-17是一种对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟均有较高杀虫活性的生防菌株，为明确乙烯利对白僵菌分生孢子的杀虫活性是否造成不良影响，在此对实施例1中JG-17在平皿上培养第8天时喷施100ng/cm2乙烯利后，继续培养到第16天后得到的分生孢子和空白对照产生的分生孢子对两种金龟子幼虫的杀虫活性进行比较。
(1)JG-17孢悬液制备：同实施例1。
(2)活性测定方法：对金龟子幼虫的测定浓度分别为1×108、5×107、2×107、5×106孢子/mL JG-17孢悬液。
(3)金龟子幼虫处置室：将规格为高100mm×直径15mm指形管在电热恒温鼓风干燥箱175℃灭菌2小时，每个指形管底部放入1.5cm3大小土豆块作为幼虫饲料，细土曝晒过筛后，加水混匀，使其湿度为18至20％，细土装至指形管四分之三处，作为幼虫处置室。
(4)活性测定方法：挑取健康活泼、大小一致的2龄金龟子幼虫，将试虫逐头浸没在JG-17孢悬液中5s，取出后放在滤纸上吸去多于水分后放入幼虫处置室中，待试虫钻入土中后在幼虫处置室口塞入灭菌棉球，如有长时间未钻入土中的试虫，将其取出并挑取新的幼虫重新在相应的JG-17孢悬液浸没处理，至所有处理幼虫均钻入土中。每个幼虫处置室放置1头幼虫，每处理设3次重复，每重复10头试虫。27℃下饲养13天，定期检查死虫数，并将死虫挑出保湿处理，待其体表长出白色菌丝体视为菌株JG-17侵染致死。计算死亡率和校正死亡率，
计算公式：
死亡率(％)＝死虫数/试虫数×100
校正死亡率(％)＝(处理组死亡率-对照死亡率)/(100-对照组死亡率)×100
结果见表6。
从表6可以看出，喷施乙烯利和空白对照得到的JG-17分生孢子在各处理浓度下对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫的杀虫活性基本保持一致，说明喷施乙烯利没有影响分生孢子的致病力。
表6两种处理方式的JG-17分生孢子侵染金龟幼虫的校正死亡率(％)
综上，本发明方法效果显著，是一种优化有益病原真菌发酵工艺的优良方法。对于不易产孢或产孢量很低的有益白僵菌菌株，在白僵菌的菌丝生长阶段或分生孢子形成阶段，在白僵菌表层施用一定浓度的乙烯利，可以有效缩短白僵菌产孢时间，显著提高白僵菌产孢量。该方法对其它丝状真菌同样有一定的促进产孢作用或缩短产孢时间的作用。
乙烯利在促进白僵菌产孢中的应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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