专利摘要

本发明公开了一种抗炎三萜皂苷类化合物及其提取方法与应用。该化合物为新型的三萜皂苷类化合物，通过理化常数和现代波谱学进行鉴定，明确了其理化性质和化学结构，为进一步研究和开发利用短柄枹栎橡实中三萜类化学成分的价值提供有力的参考资料；本发明的分离与提纯方法简单、高效、且温和；同时，药效学试验表明：本发明提供的3种新型的三萜皂苷类化合物具有较好的体外抗炎活性，对BV‑2细胞具有抗炎活性，表明该化合物、其互变异构体、及其药学上可接受的盐具有作为制备新型抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物的巨大潜力，为抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物的进一步开发奠定了基础。

权利要求

1.三萜皂苷类化合物的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将短柄枹栎种子粉碎干燥、醇提、得提取液；

(2)将提取液依次用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得正丁醇层；

(3)将正丁醇层进行大孔树脂柱层析，利用甲醇或其水溶液进行洗脱，得70％甲醇水溶液洗脱液Y和100％甲醇溶液洗脱液Z有效部分；

(4)对有效部分Y进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶液梯度洗脱后、通过反相薄层分析，对氯仿-甲醇溶液体积比为3：1的洗脱部分进行ODS柱层析，甲醇或其水溶液梯度洗脱后，通过硅胶和反相薄层分析，对其40％甲醇水溶液洗脱部分进行半制备反相HPLC得到结构式为的三萜皂苷类化合物1；

(5)对有效部分Z进行ODS柱层析，甲醇或其水溶液梯度洗脱后，通过薄层分析，对其50％甲醇水溶液洗脱部分进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶液梯度洗脱后，通过反相和硅胶薄层色谱分析，对氯仿-甲醇溶液的体积比为15：1的洗脱部分进行半制备反相HPLC得到结构式为的三萜皂苷类化合物2。

2.三萜皂苷类化合物药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将短柄枹栎种子粉碎干燥、醇提、得提取液；

(2)将提取液依次用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得正丁醇层；

(3)将正丁醇层进行大孔树脂柱层析，利用甲醇或其水溶液进行洗脱，得70％甲醇水溶液洗脱液Y和100％甲醇溶液洗脱液Z有效部分；

(4)对有效部分Y进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶液梯度洗脱后、通过反相薄层分析，对氯仿-甲醇溶液体积比为3：1的洗脱部分进行ODS柱层析，甲醇或其水溶液梯度洗脱后，通过硅胶和反相薄层分析，对其40％甲醇水溶液洗脱部分进行半制备反相HPLC得到结构式为的三萜皂苷类化合物1；

(5)对有效部分Z进行ODS柱层析，甲醇或其水溶液梯度洗脱后，通过薄层分析，对其50％甲醇水溶液洗脱部分进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶液梯度洗脱后，通过反相和硅胶薄层色谱分析，对氯仿-甲醇溶液的体积比为15：1的洗脱部分进行半制备反相HPLC得到结构式为的三萜皂苷类化合物2；

(6)将三萜皂苷类化合物1或三萜皂苷类化合物2与相应的碱性盐溶解在溶剂中，从溶液中沉淀出三萜皂苷类化合物药学上可接受的盐。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种抗炎三萜皂苷类化合物及其提取方法与应用。

背景技术

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所产生的防御反应，大多数疾病都伴有炎症的发生，炎症会加重疾病的发生和发展，有些慢性炎症会导致肿瘤的发生，因此，对炎症的控制和治疗具有非常重要的意义。

天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产物，天然产物不仅可以作为药物半合成的前体物，还可以作为化学合成药物的模板，为新药设计提供新思路，天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。

短柄枹栎(Quercus serrata var.brevipetiolata)为壳斗科(Fagaceae)栎属(Quercus)植物。栎属作物是我国传统社会最早利用的野生木本粮食作物之一，有悠久的利用历史。中国栎属植物品种丰富，分布广泛，是温带、亚热带森林的主要树种之一。在《本草纲目》中记载，栎属作物的橡实，其性味涩、温，主治下痢、厚肥肠、肥健人等。

现代药理实验研究表明：短柄枹栎具有抗炎、抗肿瘤、抗菌抗病毒等活性。短柄枹栎橡实中的主要活性成分为三萜皂苷类成分，但现有研究对短柄枹栎橡实的化学成分研究仍不够彻底，因而短柄枹栎橡实中的三萜类化学成分仍值得进一步研究和开发利用。

本发明对短柄枹栎橡实的三萜皂苷类成分进行了系统分离，获得了一类新型的三萜皂苷类化合物，其化学结构和抗炎活性未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗炎三萜皂苷类化合物及其提取方法与应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种三萜皂苷类化合物，其互变异构体、及其药学上可接受的盐，该化合物的结构式如下所示：

优选地，上述三萜皂苷类化合物药学上可接受的盐为其钠、钾、钙、镁、铁、亚铁、铅、钡、铜、铵或锌盐。

本发明的另一目的在于提供上述三萜皂苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：

(1)将短柄枹栎种子粉碎干燥、醇提、得提取液；

(2)将提取液依次用低极性溶剂、中极性溶剂和高极性溶剂进行萃取，得高极性层；

(3)将高极性层进行大孔树脂柱层析，利用低级醇或其水溶液进行洗脱，得Y和Z有效部分；

(4)对有效部分Y进行硅胶柱层析，中极性-高极性溶液梯度洗脱后、通过反相薄层分析，对中极性和高极性溶液体积比为3：1的洗脱部分进行ODS柱层析，低级醇或其水溶液梯度洗脱后，通过硅胶和反相薄层分析，对其40％低级醇水溶液洗脱部分进行半制备反相HPLC得到化合物1；

(5)对有效部分Z进行ODS柱层析，低级醇或其水溶液梯度洗脱后，通过薄层分析，对其50％低级醇水溶液洗脱部分进行硅胶柱层析，中极性-高极性溶液梯度洗脱后，通过反相和硅胶薄层色谱分析，对中极性和高极性溶液的体积比为15：1的洗脱部分进行半制备反相 HPLC得到化合物2；

(6)对有效部分Y进行硅胶柱层析，中极性-高极性溶液梯度洗脱后，通过反相薄层分析，对中极性和高极性溶液体积比为5：1的洗脱部分进行中低压C8柱层析，低级醇或其水溶液梯度洗脱后，通过反相和硅胶薄层色谱分析，对其40％低级醇水溶液洗脱部分进行半制备反相HPLC得到化合物3；

其中，低级醇是指C1-6的烷基醇。

优选地，步骤(1)中短柄枹栎种子粉碎至粒径为35μm～64μm。

优选地，步骤(1)采用60～90％的醇进行提取。

更优选地，步骤(1)采用70％的醇进行提取。

优选地，步骤(1)醇提中使用的醇为乙醇，且在未特别声明的情况下，本发明的特定浓度的醇指的是在其水溶液中的浓度。

优选地，步骤(1)醇提1次以上。

优选地，步骤(1)醇提1～5次。

更优选地，步骤(1)醇提4次。

优选地，步骤(1)中醇的体积与短柄枹栎种子的重量比为(3～5)L：1Kg。

更优选地，步骤(1)中醇的体积与短柄枹栎种子的重量比为4.8L：1Kg。

优选地，步骤(2)、(4)、(5)、(6)中的低极性溶剂选自环己烷、石油醚、己烷、异辛烷、三甲基戊烷、环戊烷、庚烷等烃类溶剂中的至少一种；中极性溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、甲酸甲酯、硝基甲烷、乙酸丁酯、异丙醚中的至少一种；高极性溶剂选自正丁醇、甲醇、叔丁醇、丙醇、异丙醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、吡啶中的至少一种。

优选地，步骤(2)中低极性溶剂选自环己烷；中极性溶剂选自乙酸乙酯；高极性溶剂选自正丁醇。

优选地，步骤(4)、(5)、(6)中的中极性溶剂选自氯仿；高极性溶剂选自甲醇。

优选地，步骤(3)中的梯度洗脱顺序为：0～100％的低级醇或其水溶液，即：水溶液、 10％低级醇水溶液、30％低级醇水溶液、50％低级醇水溶液、70％低级醇水溶液和100％低级醇溶液。

其中，所述的低级醇水溶液中的浓度指的是溶液中低级醇的体积百分数。

优选地，步骤(3)中的Y为70％的低级醇水溶液的洗脱部分，Z为100％低级醇溶液的洗脱部分。

更优选地，步骤(3)的低级醇选自甲醇，有效部分为70％的甲醇水溶液和100％甲醇溶液洗脱的部分。

优选地，当步骤(4)中的中极性溶剂选自氯仿，高极性溶剂选自甲醇，低级醇选自甲醇时，氯仿-甲醇梯度洗脱顺序为100：0～0：1(体积比)的氯仿-甲醇溶液，甲醇水梯度洗脱顺序为20～100％的甲醇或其水溶液。

优选地，当步骤(5)中的中极性溶剂选自氯仿，高极性溶剂选自甲醇，低级醇选自甲醇时，甲醇水梯度洗脱顺序为30～100％的甲醇或其水溶液，氯仿-甲醇梯度洗脱顺序为100：0～ 0：1(体积比)的氯仿-甲醇溶液。

优选地，当步骤(6)中的中极性溶剂选自氯仿，高极性溶剂选自甲醇，低级醇选自甲醇时，氯仿-甲醇梯度洗脱顺序为100：0～0：1(体积比)的氯仿-甲醇溶液，甲醇水梯度洗脱顺序为20～100％的甲醇或其水溶液。

优选地，上述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇中的至少一种。

更优选地，上述低级醇选自甲醇。

本发明还提供上述三萜皂苷类化合物药学上可接受的盐的制备方法为：将三萜皂苷类化合物与相应的碱性盐溶解在溶剂中，从溶液中沉淀出三萜皂苷类化合物药学上可接受的盐。

优选地，上述三萜皂苷类化合物药学上可接受的盐的制备方法为：将本发明提取的化合物1、2、3中的任意一种与相应的碱性盐在溶剂中混合、搅拌溶解、静置、分离出沉淀物，即得药学上可接受的盐。

优选地，上述碱性盐选自碱式醋酸铅、碱式醋酸钙、碱式醋酸镁、碱式醋酸铁、碱式醋酸亚铁、碱式醋酸锌、氢氧化钡、氢氧化钠、氢氧化钾中的任意一种。

优选地，上述的溶剂选自水、乙醇、甲醇、丁醇、戊醇中的至少一种。

优选地，搅拌时间为0.1～30min，搅拌温度为40～80℃。

更优选地，搅拌时间为8～12min，搅拌温度为45～60℃。

优选地，置于2～6℃中静置0.1～60min。

更优选地，置于3～5℃中静置20～40min。

优选地，化合物1与碱性盐的摩尔比为1：1～6，化合物2与碱性盐的摩尔比为1：1～2，化合物3与碱性盐的摩尔比为1：1～4。

经研究表明：上述提取的三萜皂苷类化合物对炎症介质NO的抑制作用较显著，且其效果明显优于抗炎症药物吲哚美辛，说明该三萜皂苷类化合物、其互变异构体、及其药学上可接受的盐具有作为制备新型抗炎症药物的巨大潜力。

另外，阿尔兹海默病(AD)是一种进行性认知障碍和记忆力损伤的中枢神经退行性疾病，伴有情感及性格的改变，严重影响患者的工作能力和生存质量。现如今阿尔治海默症的发病率逐年增高。AD的主要病理特征是细胞外β-淀粉蛋白沉积形成的蛋白斑块和细胞内微观相关的蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结，最终导致炎症，氧化应激，神经元死亡等造成一系类AD病症。小胶质细胞(BV-2)是中枢免疫细胞，激活状态下能抑制β-淀粉样蛋白沉积和聚集。大量研究表明，多种因素引起BV-2激活进而引发的神经炎症反应在AD的发展中扮演重要的角色，试验证明：本申请提取的三萜皂苷类化合物对BV-2细胞具有抗炎活性，因而该三萜皂苷类化合物、其互变异构体、及其药学上可接受的盐具有作为制备新型治疗阿尔兹海默病药物的巨大潜力。

因此，基于上述研究，本发明的再一目的在于提供上述三萜皂苷类化合物，其互变异构体、及其药学上可接受的盐在制备抗炎症药物及治疗阿尔兹海默病药物中的应用。

优选地，上述炎症为神经炎症、肺炎、肝炎、乳腺炎、胃炎、滑囊炎、血栓闭塞性脉管炎、心肌炎中的任意一种炎症。

一种抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物，其活性成分包含上述的三萜皂苷类化合物，其互变异构体、及其药学上可接受的盐，还包括药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、抗氧剂。

优选地，载体选自淀粉、壳聚糖、海藻酸、琼脂、纤维蛋白、胶原蛋白、聚磷酸酯类、聚氨酯类、聚酸酐类、脂质体、聚乙二醇、甘露糖、半乳糖、聚维酮中的至少一种。

优选地，稀释剂选自微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉、糖精中的至少一种。

优选地，赋形剂选自甘露糖、甘氨酸、乳糖、氯化钠、葡萄糖中的至少一种。

优选地，稳定剂选自白蛋白、胶原、环糊精及其衍生物、聚乙二醇、吐温、司盘、右旋糖苷、甘露醇中的至少一种。

优选地，抗氧剂选自VC、VE、安息香酸、枸橼酸及其盐、山梨酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠中的至少一种。

优选地，上述抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物选自口服剂、注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂、栓即、膜剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释与控释剂、靶向制剂、粉剂中的任意一种剂型。

本发明的有益效果是：

1、本发明从短柄枹栎橡实中提取出3种新型的三萜皂苷类化合物，通过理化常数和现代波谱学进行鉴定，明确了其理化性质和化学结构，为进一步研究和开发利用短柄枹栎橡实中三萜类化学成分的价值提供有力的参考资料。

2、本申请的分离与提纯方法简单、高效，且温和，能完好地保存三萜皂苷类化合物的组分，且其结构明确，质量可控。

3、药效学试验表明：本发明提供的3种新型的三萜皂苷类化合物具有较好的体外抗炎活性，对BV-2细胞具有抗炎活性，表明该三萜皂苷类化合物、其互变异构体、及其药学上可接受的盐具有作为制备新型抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物的巨大潜力，为抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物的进一步开发奠定了基础。

附图说明

图1为酸水解化合物1后的气相色谱图；

图2为酸水解D-吡喃葡萄糖后的气相色谱图；

图3为化合物1的1H-NMR谱图；

图4为化合物1的13C-NMR谱图；

图5为化合物1的HR-ESI-MS谱图；

图6为化合物1的HMBC谱图；

图7为化合物1的NOESY谱图；

图8为酸水解化合物2后的气相色谱图；

图9为化合物2的1H-NMR谱图；

图10为化合物2的13C-NMR谱图；

图11为化合物2的HR-ESI-MS谱图；

图12为化合物2的HMBC谱图；

图13为化合物2的NOESY谱图；

图14为酸水解化合物3后的气相色谱图；

图15为化合物3的1H-NMR谱图；

图16为化合物3的13C-NMR谱图；

图17为化合物3的HR-ESI-MS谱图；

图18为化合物3的HMBC谱图；

图19为化合物3的HSQC谱图；

图20为化合物3的NOESY谱图；

图21：(A)为不同浓度的化合物对LPS诱导的BV-2细胞COX-2和INOS的蛋白表达图；(B)为对(A)的蛋白表达量量化图。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

实施例1 三萜皂苷类化合物的提取

(1)取干燥短柄枹栎橡实34.5kg，分成等量的两批提取，每批用60升70％乙醇在60℃下回流提取四次，合并所有提取液并减压浓缩至提取液体积为30L；

(2)将步骤1)中的提取液依次用等体积的环己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到 595.29g正丁醇层；

(3)将正丁醇层(500.6g)进行大孔树脂柱层析，利用甲醇水溶液梯度洗脱(H2O、10％甲醇水溶液、30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液、纯甲醇；v/v)，得70％甲醇水溶液洗脱液(Y)和100％甲醇溶液洗脱液(Z)有效部分；

(4)将Y经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶液梯度洗脱(100：1～0：1：v/v)，分为10 个部分，通过反相薄层分析，对其第8部分(氯仿和甲醇溶液的体积比为3：1的洗脱部分，即：3：1氯仿-甲醇洗脱部分)进行中低压ODS柱层析，甲醇水溶液(20％～100％)进行梯度洗脱后，通过硅胶和反相薄层分析，对其中第3个流份(40％甲醇水溶液洗脱部分)，再进行HPLC制备，得化合物1；

(5)将Z经中低压ODS柱层析，甲醇水溶液(30％～100％)进行梯度洗脱，通过硅胶薄层色谱分析，对其第4个流份(50％甲醇水溶液洗脱部分)进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶液梯度洗脱(100：1～0：1；v/v)后，通过反相和硅胶层色谱分析，对其第7个流份(15： 1氯仿-甲醇溶液洗脱部分)再进行HPLC制备，即得化合物2；

(6)将Y经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇溶液梯度洗脱(100：1～0：1；v/v)，分为10 个部分，通过反相薄层分析后，将第6部分(5：1氯仿-甲醇溶液洗脱部分)进行中低压C8 柱层析，用甲醇水溶液(20％～100％)进行梯度洗脱后，通过反相和硅胶薄层色谱分析后，对其中第2个流份(40％甲醇水溶液洗脱部分)再进行HPLC制备，即得化合物3。

三萜皂苷类化合物的鉴定

1、化合物1的鉴定：

分离纯化得到的化合物1为白色无定形粉末，且其对香兰素-硫酸以及10％硫酸-乙醇显蓝色，酸水解检出D-葡萄糖(见图1～2)，推测该化合物为三萜皂苷类化合物。

针对上述推测进一步对化合物1进行1H-NMR、13C-NMR、HR-ESI-MS、HMBC及NOESY 谱分析确定，结果见图3～7：

由图3的1H-NMR图谱可知：在高场区出现了三萜皂苷元中的六个特征甲基信号，分别是δH 1.68、1.40、1.18、1.09、1.07和1.06，在化学位移δH 7.86处有两个氢信号，推测其为苯环上对称的氢信号，在化学位移δH 6.30处的氢信号推测是一个糖的端基氢信号，而在化学位移δH 5.53处的氢信号推测是一个双键的氢信号，具体数据见表1中的1a列；

由图4的13C-NMR(DEPT)图谱可知：该化合物共有43个碳信号，δC 177.3为一个酯羰基碳信号，δC 139.7和128.5是一个双键的碳信号，结合1H-NMR图谱，推测这是一个乌苏烷型的三萜，δC 96.0是一个糖的端基碳信号，在化学位移δC 79.5～δC 62.7的范围内，有 9个连氧碳信号，其中δC 74.3、79.2、71.5、79.5、62.7是糖上的碳信号，剩余4个连氧碳信号，推测分别是C-2、C-3、C-19、C-23上连羟基的碳信号，在碳谱中还有一组没食子酸碳信号：δC121.7(C-1”)、110.3(C-2”)、147.7(C-3”)、140.9(C-4”)、147.7(C-5”)、110.3(C-6”)、167.3(C-7”)，具体数据见表1中的1a列；

图5的HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z m/z 841.4011[M+Na]+(Calcd forC43H62O15Na,841.3981)，提示其分子量为818，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C43H62O15；

由图6的HMBC图谱可知：首先从H-23(δH 4.69)出发，与C-24(δC 14.3)、C-4(δC43.5)、C-5(δC 48.9)、C-7”(δC 167.3)有相关；再从H-2”(δH 7.86)出发，与C-6”(δC110.2)、C-1”(δC 121.7)、C-4”(δC 140.9)、C-3”(δC 147.7)、C-7”(δC 167.3)有相关；从C-28(δC 177.4)出发，与H-1’(δH 6.30)、H-16(δH 3.03)、H-17(δH 1.87)、H-18(δH 2.92)、H-22(δH 1.89)有相关，因而可以确定糖基连在C-28上，没食子酸连在C-23上；

由图7的NOESY图谱中可分别观察到H-2与H-25(β)，H-3和H-5(α)，H-19和H-29(β)的相关信号，可以确定化合物1的相对构型是2α，3β，19α-三羟基；

综合上述分析，可以确定化合物1为23-O-没食子酸-2α,3β,19α-三羟基-12-烯-28-O-β-D- 吡喃葡萄糖基-乌苏酸，其结构式如下：

2、化合物2的鉴定：

分离纯化得到的化合物2为白色无定形粉末，且其对香兰素-硫酸以及10％硫酸-乙醇显蓝色，酸水解检出D-葡萄糖(见图8)，推测该化合物为三萜皂苷类化合物。

针对上述推测进一步对化合物2进行1H-NMR、13C-NMR、HR-ESI-MS、HMBC及NOESY 谱分析确定，结果见图9～13：

由图9的1H-NMR图谱可知：在高场区出现了三萜皂苷元的六个特征甲基信号，分别是δH 1.61(H-27)、1.22(H-24)、1.14(H-29)、1.13(H-26)、1.02(H-25)和0.98(H-30)，在化学位移δH 6.37处的氢信号推测是一个糖的端基氢信号，在化学位移δH 5.49处的氢信号推测是一个双键的氢信号，具体数据见表1中的2b列；

由图10的13C-NMR(DEPT)图谱可知：图谱中共出现40个碳信号，其中，δC 177.6(C-28) 为一个酯羰基碳信号，δC 144.6(C-13)和123.5(C-12)是一个双键的碳信号，结合图14的氢谱可以推测这是一个齐墩果型的三萜，δC 103.1(C-1”)为一个半缩醛的碳信号，δC96.0是一个糖的端基碳信号，在化学位移δC 90.9～δC 62.4的范围内，有9个连氧碳信号，其中δC74.4 (C-2’)、79.2(C-3’)、71.3(C-4’)、79.6(C-5’)和62.4(C-6’)是糖上的碳信号，剩余4个连氧碳信号，推测分别是C-2、C-3、C-19、C-23上连羟基的碳信号，与化合物Arjunglucoside I比对，发现化合物2多出了一个丁基碳信号组，分别是δC 103.1(C-1”)、δC 37.7(C-2”)、δC 17.5 (C-3”)和δC 15.1(C-4”)，并且在C-3位由δC 78.3向低场位移至δC90.9，在C-23位由δC 64.3 向低场位移至δC 78.6，由此推测丁基碳信号组连在C-3和C-23位上形成一个缩醛的结构，具体数据见表1中的2b列；

图11的HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z 743.4341[M+Na]+(Calcd forC43H62O15Na,743.4341)，提示化合物2的分子量为720，结合化合物2的1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C40H64O11；

由图12的HMBC图谱可知：从H-4”(δH 0.85)出发，与C-2”(δC 37.6)、C-3”(δC 17.7)有相关；从H-3”(δH 1.53)出发，与C-4”(δC 14.5)、C-2”(δC 37.6)、C-1”(δC 103.2)有相关，因此可以确定这四个碳是一个丁基碳信号；再从C-1”(δC 103.2)出发，与H-3(δH 3.34)、H-23(δH 3.86)、H-2”(δH 1.75)、H-3”(δH 1.53)有相关，因此，可以确定丁基碳信号组与C-3、C-23相连接形成一个缩醛的结构，也应证了依据碳谱信息的推测；从C-28(δC 177.6)出发，与H-1’(δH 6.38)、H-16(δH 2.84)、H-18(δH 3.52)、H-22(δH 2.05)有相关，所以可以确定糖基连在C-28 上；

由图13的NOESY图谱可以观察到H-2与H-25(β)、H-3和H-5(α)、H-19和H-29(β)的相关信号，确定化合物2的相对构型是2α，3β，19α-三羟基；

综合上述分析，可以确定化合物2为3,23-O-丁基-2α,3β,19α,23-四羟基-12-烯-28-O-β-D- 吡喃葡萄糖基-齐墩果酸，其结构式如下：

3、化合物3的鉴定：

分离纯化得到的化合物3为白色无定形粉末，且其对香兰素-硫酸以及10％硫酸-乙醇显蓝色，酸水解检出D-葡萄糖(见图14)，推测该化合物为三萜皂苷类化合物。

针对上述推测进一步对化合物3进行1H-NMR、13C-NMR、HR-ESI-MS、HMBC、HSQC 及NOESY谱分析确定，结果见图15～20：

由图15的1H-NMR图谱可知：高场区出现了三萜皂苷元中的5个特征甲基信号，分别是δH 0.93(C-27)、0.98(C-25)、1.04(C-24)、1.17(C-26)、1.71(C-30)，在化学位移δH 6.45处的氢信号推测是一个糖的端基氢信号，在化学位移δH 4.73、4.86处的氢信号推测是一个双键的氢信号，具体数据见表1中的3a；

由图16的13C-NMR(DEPT)图谱可知：图谱共出现了36个碳信号，其中包括5个仲碳、12个叔碳，6个季碳。在δC 175.3(C-28)处为一个酯羰基碳信号；在δC 151.3(C-19)和δc110.5处是一个环外双键的碳信号，结合氢谱，可以推测这是一个羽扇豆烷的三萜；在δC95.8处为一个糖的端基碳信号；在δC 60～δC 80的范围内有8个连氧碳信号，其中，δC62.6、71.5、 74.7、79.3、79.8是糖上的糖信号，除去糖上连氧碳信号，还有三个连氧碳信号推测是三萜母核上连羟基碳信号，具体数据见表1中的3a；；

图17的HR-ESI-MS图谱显示准分子离子峰m/z 673.3922[M+Na]+(Calcd forC43H62O15Na, 673.3925)，提示化合物3的分子量为650，结合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C36H58O10；

由图18的HMBC图谱可知：从H-1(δH 2.35)出发，与C-2(δC 69.5)、C-3(δC 78.6)、C-10 (δC 39.0)、C-25(δC 18.4)有相关；再从H-23(δH 3.71)出发，与C-3(δC 78.4)、C-4(δC 44.7)、 C-5(δC 48.5)、C-24(δC 14.5)有相关；并且三萜类化合物C-23和C-24连氧基取代规律：即当 C-23连氧基时，C-24甲基化学位移在15～20ppm；当C-24连氧基时，C-23甲基化学位移在 20～25左右，结合HMBC和HSQC(见图19)归属可知，羟基分别连在C-2、C-3、C-23位上；

由图20的NOESY图谱可以观察到H-2与H-25(β)，H-3和H-5(α)，确定化合物Ⅲ相对构型是2α，3β-二羟基；

综合上述分析，可以确定化合物3为2α,3β,23-三羟基-20(29)-烯-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基- 羽扇豆烷，其结构式如下：

表1

注：aNMR光谱在Avance III-500NMR光谱仪上获得；

bNMR光谱在Avance III-600NMR光谱仪上获得；

“--”表示没有该数据。

三萜皂苷类化合物的抗炎活性试验

采用LPS(脂多糖)诱导的BV-2(小鼠小胶质细胞)建立体外炎症模型，利用MTT和Griess实验，考察本发明化合物对经脂多糖诱导后的BV-2炎症介质NO的影响，抗炎药Indomethacin(吲哚美辛)作为阳性对照。

1、MTT试验

将BV-2细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后用MTT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率，细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％，并用CalcuSyn软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。

2、Griess实验

将BV-2细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后，吸取各孔培养液50μL，加入50μL Griess A试剂和50μL Griess B试剂混匀，用酶标仪于546nm处测定OD值，计算对NO产生的抑制率，NO抑制率＝(模型对照组OD值平均值-样品组 OD值平均值)÷(模型对照组OD值平均值-阴性对照组OD值平均值)×100％，并用CalcuSyn 软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)；

上述试验结果见下表2：

表2

3、Western Blot实验

将处于指数生长期的细胞种于96孔板中，分别加入不同浓度的化合物1～3(12.5、25、 50μmol·L-1)，并于相应时间点提取各组总蛋白，采用10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按常规操作方法进行Western blot实验，最后采用ECL试剂盒显影并成像。每组实验重复3次，实验结果见图21，其中图中的“*”表示LPS相对于控制组(CTL)的显著性，“#”表示三萜皂苷类化合物相对于肌动蛋白(actin)的显著性，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001；*p＜0.05，***p＜0.01，***p＜0.001)。

由表2可知：本发明的化合物1～3均具有一定的体外抗炎活性，其中化合物1和化合物 3对炎症介质NO的抑制作用较显著，且其效果明显优于抗炎药吲哚美辛；

由图21可知：当浓度为25.0和50.0μmol·L-1，化合物1、2、3均能显著下调LPS诱导的BV-2细胞的COX-2与INOS蛋白表达，提示：化合物1、2、3可通过抑制COX-2和INOS 的表达，从而下调NO的生物合成，这可能是化合物1、2、3抗炎机制之一；

上述结果表明本申请的短柄枹栎三萜皂苷类化合物1～3具有作为新的抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物或作为制备新的抗炎症或治疗阿尔兹海默病药物的巨大潜力。

一种抗炎三萜皂苷类化合物及其提取方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。