专利摘要

本发明涉及微生物药物技术，具体的说是弯孢霉菌素类衍生物及其制备方法和应用。所述弯孢霉菌素类衍生物的化学结构如式I所示，其中：R1和R2为H或R5CO；R3为H或R6CO；R4为H或含1-20个碳原子的烷基或烷氧基；其中当R1或R2为R5CO时，R5为氢或含1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯基、取代苯基或含杂原子的芳香基；当R3为R6CO时，R6为氢或含1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯基、取代苯基或含杂原子的芳香基。本发明制备所得弯孢霉菌素衍生物利用微生物进行发酵生产，具有操作工艺简单，生产周期短、产品成本低的特点。 CGMCCNo.7869 2013.07.03

权利要求

1.一种弯孢霉菌素类衍生物，其特征在于：弯孢霉菌素类衍生物如式I所示，

其中：

R₁、R₂为H、R₅CO；

R₃为H或R₆CO；

R₄为H或含1-20个碳原子的烷基或烷氧基；

R₅为氢或含1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯基、取代苯基或含杂原子的芳香基；

R₆为氢或含1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯基、取代苯基或含杂原子的芳香基。

2.按权利要求1所述的弯孢霉菌素衍生物，其特征在于：所述R₁、R₂、R₃及R₄不同时为氢。

3.按权利要求1所述的弯孢霉菌素衍生物，其特征在于：所述R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基，即为弯孢霉菌素类酯类化合物1,其化学式如下：

4.按权利要求1所述的弯孢霉菌素衍生物，其特征在于：所述R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基，即为弯孢霉菌素类酯类化合物2,其化学式如下:

5.一种按权利要求1所述的弯孢霉菌素衍生物的制备方法，其特征在于：按如下步骤：

1）将发酵培养后的苏门答腊青霉(penicillium sumatrense)经有机溶剂提取，提取物待用；有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水中的一种或几种；

2）将上述提取物进行减压硅胶柱层析，采用的洗脱液依次是梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1(v/v)的氯仿-甲醇；

3）收集上述氯仿-甲醇体积比10:1至5:1的梯度洗脱下的组分，将洗脱组分再由反相硅胶柱层析，采用的洗脱液为从20:80至80:20(v/v)的甲醇-水的混合溶剂；

4）收集上述甲醇-水体积比为50:50至80:20的洗脱组分，纯化后即为式I所示其他化合物。

6.按权利要求5所述的弯孢霉菌素衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤4中收集上述甲醇-水体积比为30:70的洗脱组分，纯化后即为式I所示化合物2，即式I中R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基；收集上述洗脱液体积比为40:60（甲醇-水）梯度的洗脱组分，纯化后即为式I所示化合物1,即式I中R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基。

7.按权利要求6所述的弯孢霉菌素衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤4）收集甲醇-水体积比为30:70（甲醇-水）的梯度洗脱组分进一步采用凝胶Sephadex LH-20柱层析以甲醇为洗脱液进行洗脱，即得纯化后式I所示化合物2，即式I中R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基所代表的化合物。

8.按权利要求6所述的弯孢霉菌素衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤4）收集甲醇-水体积比为40:60（甲醇-水）的梯度洗脱组分进一步采用硅胶柱层析纯化，洗脱液为梯度在30:1至5:1的氯仿-甲醇，即得纯化后式I所示化合物1，即式I中R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基所代表的化合物。

9.一种按权利要求1所述的弯孢霉菌素衍生物的应用，其特征在于：所述弯孢霉菌素衍生物为式I、式I的立体异构体、式I以任何比例组成的外消旋体或式I可接受的盐类作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。

10.一种按权利要求1所述的弯孢霉菌素衍生物的应用，其特征在于：所述弯孢霉菌素衍生物为式I、式I的立体异构体、式I以任何比例组成的外消旋体或式I可接受的盐类作为制备抗肿瘤药物或抑制肿瘤细胞增殖药物。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物药物技术，具体的说是一种弯孢霉菌素类衍生物及其制备方法和应用。 

背景技术

癌症是严重危害人类健康的一大顽症。据全国肿瘤登记中心2013年初发布的《2012中国肿瘤登记年报》的统计报告，中国每年新发癌症病例约312万，因癌症死亡超过200万，癌症发病率与死亡率近年来呈持续上升的趋势。另一方面，由于已有的抗肿瘤药物毒副作用大和长期或反复使用易产生耐药性而导致治疗失败。因此，新的抗肿瘤药物的发展已刻不容缓。 

发明内容

本发明的目的是提供一种弯孢霉素类衍生物及其制备方法和应用。 

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为： 

一种弯孢霉菌素类衍生物，弯孢霉菌素类衍生物如式I所示， 

其中： 

R₁、R₂为H、R₅CO； 

R₃为H或R₆CO； 

R₄为H或含1-20个碳原子的烷基或烷氧基； 

R₅为氢或含1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯基、取代苯基或含杂原子的芳香基； 

R₆为氢或含1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯基、取代苯基或含杂原子的芳香基。 

所述R₁、R₂、R₃及R₄不同时为氢。 

所述R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基，即为弯孢霉菌素类酯类化合物1,其化学式如下： 

所述R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基，即为弯孢霉菌素类酯类化合物2,其化学式如下: 

弯孢霉菌素衍生物的制备方法，按如下步骤： 

1）将发酵培养后的苏门答腊青霉(penicillium sumatrense)经有机溶剂提取，提取物待用；有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水中的一种或几种； 

2）将上述提取物进行减压硅胶柱层析，采用的洗脱液依次是梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1(v/v)的氯仿-甲醇； 

3）收集上述氯仿-甲醇体积比10:1至5:1的梯度洗脱下的组分，将洗脱组分再由反相硅胶柱层析，采用的洗脱液为从20:80至80:20(v/v)的甲醇-水的混合溶剂； 

4）收集上述甲醇-水体积比为50:50至80:20的洗脱组分，纯化后即为式I所示其他化合物。 

所述步骤4中收集上述甲醇-水体积比为30:70的洗脱组分，纯化后即为式I所示化合物2，即式I中R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基；收集上述洗脱液体积比为40:60（甲醇-水）梯度的洗脱组分，纯化后即为式I所示化合物1,即式I中R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基。 

所述步骤4）收集甲醇-水体积比为30:70（甲醇-水）的梯度洗脱组分进一步采用凝胶Sephadex LH-20柱层析以甲醇为洗脱液进行洗脱，即得纯化后式I所示化合物2，即式I中R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基所代表的化合物。 

所述步骤4）收集甲醇-水体积比为40:60（甲醇-水）的梯度洗脱组分进 一步采用硅胶柱层析纯化，洗脱液为梯度在30:1至5:1的氯仿-甲醇，即得纯化后式I所示化合物1，即式I中R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基所代表的化合物。 

所述弯孢霉菌素衍生物为式I、式I的立体异构体、式I以任何比例组成的外消旋体或式I可接受的盐类作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。 

所述弯孢霉菌素衍生物为式I、式I的立体异构体、式I以任何比例组成的外消旋体或式I可接受的盐类作为制备抗肿瘤药物或抑制肿瘤细胞增殖药物。 

本发明所具有的优点： 

1.本发明制备所得弯孢霉菌素衍生物可以作为具有抗肿瘤作用的新药物成分或先导化合物。 

2.本发明制备的弯孢霉菌素衍生物是利用微生物进行发酵生产，本发明所涉及的弯孢霉菌素类化合物由苏门答腊青霉（Penicillium sumatrense）发酵培养、提取分离而获得，其化学结构经核磁共振和高分辨质谱等技术鉴定，药理实验表明对多种肿瘤细胞具有显著的抑制活性。具有操作工艺简单，可控性强，生产周期短，产品成本低，易于实现工业化的特点。 

3.本发明利用微生物发酵法制备抗肿瘤化合物不会导致物种减少且对环境无污染。 

具体实施方式

为阐明对本发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。 

弯孢霉菌素衍生物如式I所示， 

其中： 

R₁、R₂为H或R₅CO； 

R₃为H或R₆CO； 

R₄为H或含有1-20个碳原子的烷基或烷氧基； 

其中：当R₁或R₂为R₅CO时，R₅为氢或含有1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯基、取代苯基或含杂原子（氮、氧、硫）的芳香基（吡 啶基、呋喃基、噻唑基等）；当R₃为R₆CO时，R₆为氢或含有1-20个碳原子的直链或支链的烷基或烯基、苯、取代苯基或含杂原子（氮、氧、硫）的芳香基（吡啶基、呋喃基、噻唑基等）。 

弯孢霉菌素类化合物1和2的化学结构分别是（结构式中的阿拉伯数字是化学结构中的碳原子的标位）： 

其中： 

化合物1为通式（I）中R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基所代表的化合物； 

化合物2为通式（I）中R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基所代表的化合物。 

以及式I立体异构体、式I任何比例组成的外消旋体或式I接受的盐类，可接受的盐可为盐酸盐、柠檬酸盐。 

实施例1：化合物1和2的发酵生产及分离精制： 

1)发酵培养 

菌种培养：按照微生物的常规培养方法，取保存于琼脂－麦芽膏培养基的苏门答腊青霉(Penicillium sumatrense)(该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年7月3日，保藏号为CGMCC No.7869）菌种适量接种到PDA平板培养基上，在28℃培养箱中培养4天，作为下一步发酵培养的菌种，待用。 

所述苏门答腊青霉(Penicillium sumatrense)分离自海南文昌的红树林植物榄李的根际土壤。 

切取上述PDA平板表面的菌种适量，接种至已灭菌的、盛有大米培养基的锥形瓶中，室温静置培养30天后采用乙酸乙酯灭菌，待用。 

所述大米培养基为每瓶含大米70g/瓶，蛋白胨0.3g/瓶，玉米浆0.1g/瓶，天然海水100mL，在1L的锥形瓶中培养。 

2)发酵产物分离与纯化 

将上述青霉经大米培养基发酵培养的产物用乙酸乙酯超声提取3次， 合并提取液，减压蒸馏得浸膏。按照洗脱液极性递增顺序，分别以石油醚-乙酸乙酯（体积比20:1至1:1）和氯仿-甲醇（体积比20:1至1:1）为梯度洗脱剂进行硅胶柱层析分离。收集氯仿-甲醇体积比10:1至5:1梯度的洗脱组分用于制备弯孢霉菌素类化合物。 

将收集的上述组分即梯度为10:1至5:1的氯仿-甲醇洗脱下的组分进行反相硅胶柱层析，采用体积比从20:80至80:20的甲醇-水作为梯度洗脱剂。 

收集上述甲醇水体积比为50:50至80:20的洗脱组分，纯化后即为式I所示其他化合物。 

进一步的说，收集上述洗脱液体积比为40:60（甲醇-水）梯度的洗脱组分，再用硅胶柱层析纯化，洗脱液是梯度为30:1至5:1的氯仿-甲醇，即得纯化后式I所示化合物1，即式I中R₁、R₂及R₃为H，R₄为甲基所代表的化合物。 

收集上述洗脱液体积比为30:70（甲醇-水）梯度的洗脱组分，再经凝胶Sephadex LH-20柱层析纯化，以甲醇为洗脱液进行洗脱，即得纯化后式I所示化合物2，即式I中R₁、R₂为H，R₃为乙酰基，R₄为乙酰化乙基所代表的化合物。 

化合物1，淡黄色针状结晶;mp169-171℃; UV(MeOH)λ_max(logε)201(4.30),274(3.72),304(3.65)nm;CD(c0.17,MeOH)λ_max(Δε)333(–3.65),306(4.46),276(4.48),229(–11.4)nm;ESI-MS m/z427[M+H]⁺,449[M+Na]⁺,465[M+K]⁺;HR-ESI-MS m/z427.1402[M+H]⁺(calcd for C₂₀H₂₇O₈S⁺,427.1421).¹H-and¹³C-NMR，见表1。 

化合物2,淡黄色油状固体; UV(MeOH)λ_max(logε)200(4.31),274(3.78),304(3.70)nm;CD(c0.29,MeOH)λ_max(Δε)334(–3.03),306(3.78),275(3.27),229(–8.64)nm;ESI-MS m/z451[M+H]⁺HR-ESI-MS m/z451.1792[M+H]⁺(calcd for C₂₅H₃₃O₁₁S,451.1744).¹H-and ¹³C-NMR，见表1。 

表1.化合物1–2的¹H、¹³C-NMR数据acetone-d₆(500MHz,J in Hz) 

实施例2：抗肿瘤活性试验 

选择以下8株供试细胞株：小鼠黑色素瘤细胞（B16）、人肝癌细胞株（Hu-7）、人胰腺癌细胞株（SW1990）、人宫颈癌细胞株（HeLa）、人前列腺癌细胞株（DU145）、人非小细胞肺癌细胞株（NCI-H460）、人乳腺癌细胞株（MCF-7）及人胃癌细胞株（SGC-7901）进行抗肿瘤活性测试。 

1)实验样品的准备： 

被测样品溶液的准备：测试样品为上述实施例中分离获得的纯品化合物1和2。准确称取适量样品，用二甲基亚砜(DMSO)配制成所需浓度的溶液，供活性测试。 

2)肿瘤细胞生长抑制活性测试（MTT法）： 

本发明采用四氮唑盐染色法（MTT法）测试、评价了被测试样品对肿瘤细胞的生长抑制活性。四氮唑盐MTT是一种能接受H⁺的黄色染料。在活细胞线粒体呼吸链中，琥珀酸脱氢酶和细胞色素C可使MTT的四氮唑环开裂，生成蓝紫色的formazan结晶，而死细胞中不含这种脱氢酶。Formazan结晶的生成量与活细胞数成正比，该结晶的DMSO溶液在570纳米处有最大吸收峰，所以，可通过检测formazan结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。 

取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至2×10⁵个细胞/毫升，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5%二氧化碳的培养箱中培养4小时。样品分别设定5个浓度梯度10^-8，10^-7，10^-6，10^-5和10^-4mol/L，每个浓度设三个平行样，每孔加样品液或空白液各2微升，培养48小时，然后每孔加浓度为5毫克/毫升的MTT液10微升，继续培养4小时，除去上清液。每孔加入DMSO各100微升，在微量震荡器上震荡10分钟，至结 晶完全溶解后，酶标仪测定每孔570纳米处的吸光值（OD值）。 

取三孔平均OD值，按IR%=（OD_空白对照-OD_样品）/OD_空白对照×100%式计算样品对细胞增殖的抑制率（IR%）。 

实验结果见表2 

表2.化合物1、2的抗肿瘤活性 

实验结果（表2）表明：化合物1、2对小鼠黑色素瘤细胞（B16）、人胃癌细胞株（SGC-7901）和人乳腺癌细胞株（MCF-7）有较强的抑制活性，另外对人肝癌细胞株（Hu-7）、人胰腺癌细胞株（SW1990）、人宫颈癌细胞株（Hela）、人前列腺癌细胞株（DU145）以及人非小细胞肺癌细胞株（H460）也具有一定的生长抑制活性。 

上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对不同的肿瘤细胞株具有生长抑制活性，它们可作为抗肿瘤制剂，并有望以任何可接受的盐或添加临床可接受的辅料或载体如赋形剂、稀释剂的形式在制备相关药物中得到应用。 

一种弯孢霉菌素类衍生物及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。