专利摘要

本发明公开了一种利用SLP将功能蛋白定向固定到介质表面的方法，该方法是通过基因工程的手段将SLP进行改造，保留其自组装的特性，使其作为融合表达标签与各种功能蛋白进行融合表达，形成SLP融合蛋白，再将SLP融合蛋白固定到介质表面，从而实现了功能蛋白的定向固定化。本发明的方法能将功能蛋白在介质表面作高度有序、高密度地固定化，对介质表面无需特殊处理，工艺简单，对功能蛋白无损伤，有利于保护蛋白活性，提高功能蛋白活性利用率。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白固定化领域，具体涉及一种利用SLP将特定功能蛋白定向固定到介质表面的方法。

背景技术

细菌表面自组装蛋白(Crystalline bacterial cell surface layers，S-layers，S-layer protein，SLP)是一种存在于多种古细菌与细菌表面的蛋白质，在细胞膜表面形成规则的网格结构，起到稳定细胞膜的作用。游离的SLP单体可以在各种固体表面(如多聚合物、硅片及金属)及两相界面(如气液表面、脂膜表面或脂质体表面)通过静电作用力、离子作用力和疏水作用力自发组装成规则的、厚度约为5～28nm、由大小约3～35nm的网格单元组成的单分子层网格结构。SLP的这种自组装特性使其在生物纳米技术上极具应用潜力。

功能蛋白(如酶、抗体、抗原、多肽等)在生物工程中具有广泛的应用。但功能蛋白一般为水溶性分子，对环境因素(如pH值、离子强度、温度等)比较敏感，环境因素的轻微改变即可使蛋白质结构和功能发生改变。因此，在研究和生产活动中，常采用蛋白固定化技术将功能蛋白固定到介质表面以增加其结构和功能的稳定性。蛋白质固定化后其结构与功能的稳定性增加，通过常规方法即可将其从反应系统中分离，生产过程易于控制。固定化的蛋白能反复多次使用，且便于运输和贮存，有利于自动化生产。然而，目前常用的蛋白固定化方法常使功能蛋白的活性降低，使用范围缩小。下面简述目前常用的4种蛋白固定化方法及其优缺点。

一、吸附法

1.物理吸附法：利用各种吸附剂将蛋白质分子吸附在其表面从而实现固定化。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多空陶瓷、多空玻璃等。此方法操作简单，条件温和，但吸附不具备特异性，吸附力较弱，蛋白质容易脱落。

2.离子吸附法：蛋白质通过离子键吸附于有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。用于此法的载体有阴离子交换剂如DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶，Amberlite IRA-93，IRA-410，IRA-900；阳离子交换剂如羧甲基纤维素，Amberlite CG-50，IR-120，Dowex-50等。离子吸附法操作简单，处理条件温和。但是固定化的蛋白质容易受缓冲液影响，在离子强度高的条件下进行反应时，往往会从载体上脱落。

二、包埋法

包埋法可分为网格型和微囊型两种。将蛋白质包埋于高分子凝胶细微网格中的称为网格型，包埋于高分子半透膜中的称为微囊型。包埋法几乎不改变蛋白的高级结构，蛋白活力回收率较高。但是在包埋时发生的化学聚合反应，容易使蛋白的活力降低，需要设计适宜的反应条件，而且蛋白分子在聚合物中呈随机分布，排布散乱，有效活性位点朝向不一致而导致整体活力下降。

三、共价结合法

蛋白的非必需基团通过共价键和固相支持物形成不可逆的连接。所用载体主要有：天然有机载体、无机载体、合成聚合物等。蛋白分子中可以形成共价键的基团主要有：α-氨基或ε-氨基，α、β或γ位的羟基、巯基、咪唑基、酚基等。首先将载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活性基团，然后此活性基团与蛋白分子上的某一基团反应，形成共价键。用共价偶联法固定化蛋白，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，可以连续使用很长时间。但载体活化的操作复杂，而且由于采用了比较剧烈的反应条件，会导致蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，而且固定化的蛋白不具备方向性，排布散乱，有效活性位点朝向不一致而导致整体活力下降。

四、交联法：

借助于双功能或多功能试剂使蛋白质之间发生交联反应，制成不溶于水的网状结构。参与交联反应的蛋白的功能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨基的巯基和组氨酸的咪唑基等。交联剂有形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N，N’-乙烯双马来亚胺等。交联法的反应条件比较强烈，蛋白质活力回收率一般较低。

以上几种方法固定的蛋白质分子均无方向性，活性利用率低，并存在或结合不牢固、或操作复杂剧烈等缺点。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种将特定功能蛋白定向固定到介质表面的方法，该方法是通过基因工程的手段将SLP进行改造，保留其自组装的特性，使其作为融合表达标签与各种功能蛋白进行融合表达，形成SLP融合蛋白，再将SLP融合蛋白固定到介质表面，从而实现功能蛋白的定向固定化。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种将功能蛋白定向固定到介质表面的方法，包括以下步骤：

(1)首先扩增SLP蛋白和功能蛋白的编码基因，然后将两种蛋白的编码基因连接入原核表达载体中，得到含有这两种编码基因的原核融合表达载体；再将原核融合表达载体转化入大肠杆菌表达菌株，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导大肠杆菌表达菌株表达融合蛋白，然后将菌体破碎并离心，得到SLP融合蛋白的包涵体沉淀物；

(2)用尿素(Urea)溶解SLP融合蛋白的包涵体沉淀物，然后凝胶层析纯化，得到可溶性的SLP融合蛋白；

(3)将SLP融合蛋白与含有1～100mM CaCl₂、pH值6～10的Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶液混合，配制成包埋液；包埋液的SLP融合蛋白的终浓度为0.01～1mg/mL；

(4)在4～50℃条件下，将介质表面置于包埋液中孵育2～24小时；

(5)去除包埋液，用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液清洗介质表面；

(6)在室温下，将介质表面置于DMP(邻苯二甲酸二甲酯)溶液中孵育10～120min；

(7)去除DMP(邻苯二甲酸二甲酯)溶液，用Tris缓冲液清洗介质表面。

步骤(1)所述SLP蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.1；

步骤(1)所述的功能蛋白优选蛋白A(Protein A)、链酶亲和素(Streptavidin，SA)、蛋白G(Protein G)、蛋白A/G(Protein A/G)、蛋白L(Protein L)中的一种；

所述的蛋白A的氨基酸序列见SEQ ID NO.2，链酶亲和素的氨基酸序列见SEQ ID NO.3，蛋白G的氨基酸序列见SEQ ID NO.4，蛋白A/G的氨基酸序列见SEQ ID NO.5，蛋白L的氨基酸序列见SEQ ID NO.6；

步骤(1)所述的原核融合表达载体带有T7启动子及抗性筛选标签，优选pET28A；

步骤(1)所述的大肠杆菌表达菌株优选BL21(DE3)Star；

步骤(1)所述IPTG的浓度为0.1～1mM；

步骤(1)所述将菌体破碎的方式优选超声处理，超声处理的功率为200W，时间10～30min；

步骤(2)所述尿素的浓度优选5M；

步骤(2)所述的凝胶层析优选Superdex 200凝胶过滤层析；

所述Superdex 200凝胶过滤层析使用5～150mM Tris、50～200mM NaClpH9.0缓冲液为流动相，流速2～3mL/min。

步骤(5)所述HEPES溶液的浓度优选0.01～1M；

步骤(5)所述的介质优选超顺磁性磁珠、塑料细胞培养板、超细纤维膜、硅片、玻璃、聚丙烯塑料、聚乙烯塑料、聚苯乙烯塑料或金属；

步骤(6)所述DMP溶液的浓度优选5～100mM；

步骤(7)所述Tris缓冲液的浓度优选50mM。

步骤(5)所述交联处理并非必须，可按固定化蛋白的用途(是否需要耐受离子强度、pH值等外部环境的剧烈变化)决定是否需要交联，交联后蛋白更加稳定。未交联的自组装蛋白可耐受低离子强度(5～200mM NaCl)及中性pH(pH6～8)缓冲液的反复冲洗。

本发明的原理是：经过改造的带有功能基团的SLP融合蛋白分子在介质表面通过静电作用力、离子作用力和疏水作用力自发组装成规则的、厚度约为5～28nm、由大小约3～35nm的网格单元组成单分子层网格结构，其中功能基团位于网格单元的上表面(参考图1的左图)，经过DMP交联反应，网格中的SLP融合蛋白单体分子上的游离氨基相互共价交联，也可与经过氨基(或羧基、羟基等可以与SLP融合蛋白单体分子上的游离氨基相互共价交联的基团)修饰的介质表面进行共价交联，达到牢固的固定化效果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明利用SLP在介质表面自组装成规则的单分子层网状结构，使融合表达的功能蛋白在介质表面实现高度有序、高密度的固定化，对固体载体表面无需特殊处理，工艺简单，对功能蛋白无损伤，有利于保护蛋白活性，提高功能蛋白活性利用率。

2、本发明的SLP融合蛋白能高密度固定化：SLP融合蛋白在介质表面自组装形成网格结构，密度达9.3×10¹³molecules/cm²。

3、本发明的SLP融合蛋白能定向固定化：用传统方法进行固定，功能蛋白在随意位点与载体结合，或是有多个位点与载体结合，功能蛋白无方向性，且容易造成对活性位点的屏蔽，降低活性利用率。通过SLP融合蛋白对功能蛋白进行固定化，功能蛋白均处于SLP融合蛋白的表面，且固定后的蛋白质具有统一的方向性及规则的高密度排列，比传统的固定化方法包埋密度更高、能充分提高功能蛋白的利用率(参考图1)。此外，固定化后的蛋白分子活动更接近于水溶性蛋白，能与底物更充分地接触而发挥生物活性。

4、本发明的SLP融合蛋白固定化方法操作简单、条件温和：①用SLP对功能蛋白进行固定化，其自组装过程可以在4～25℃下进行，对操作温度无特殊要求；②SLP自组装反应条件温和，功能蛋白基团不直接参与固定化过程，有利于保护蛋白质活性；③整个固定化过程无需使用任何有毒或挥发性化学物质，有利于保护环境及操作人员的人身安全；④载体表面无需特殊的化学活化过程，简化了操作步骤，适合于大规模生产；⑤经过交联处理的SLP网格结构极其稳固，能抵抗极端条件的处理(如高浓度变性剂、去垢剂、热处理等)。

附图说明

图1左图是蛋白A包埋介质表面示意图；右图是SL-PA融合蛋白(SLP蛋白与蛋白A基因经原核表达载体融合表达的蛋白)包埋介质表面示意图。图1中蛋白A只是与SLP融合的功能蛋白的一个代表，也可以是蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、链霉亲和素、多肽等功能蛋白的任一种。

图2左图是蛋白A结合抗体示意图；右图是SL-PA融合蛋白结合抗体示意图，图2中蛋白A只是与SLP融合的功能蛋白的一个代表，也可以是蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、链霉亲和素、多肽等功能蛋白的任一种。

图3是原核表达载体pET28A的图谱。

图4是实施例1的SL-PA包埋磁珠与同类蛋白A包埋磁珠产品IgG结合量对比图。

图5是实施例1的SL-PA包埋磁珠稳定性测试结果柱状图。

图6是SL-PA包埋细胞培养板IgG结合测试暗室显影结果图；其中，1是SL-PA包埋孔，2是不加SL-PA的包埋孔，3是用BSA代替SL-PA的包埋孔，左边的孔是显影后的，右边的孔是显影前的。

图7是未包埋SL-PA融合蛋白的聚苯乙烯培养板表面(左)与包埋了SL-PA融合蛋白的聚苯乙烯培养板表面(右)电子显微镜对比图：图(a)所示是10μm×10μm表面积内的显微图像；图(b)所示是3μm×3μm表面积内的显微图像；图(c)所示是700nm×700nm表面积内的显微图像。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种将蛋白A定向固定到磁珠表面的方法。蛋白A是一种存在于金黄葡萄球菌Staphylococcus aureus细胞膜表面的蛋白，可以与抗体Fc段特异性结合，被广泛用于抗体纯化及免疫检测等领域。本实施例是将SLP蛋白与蛋白A的IgG结合结构域(ZZ结构域)进行融合表达。具体包括以下步骤：

(1)PCR扩增SLP蛋白和蛋白A的编码基因：

扩增SLP蛋白编码基因(序列见SEQ ID NO.7)，模板采用质粒rSbpA-pUC19(购自奥地利Nano-S Biotechnologie公司)，引物对(引物上均已含有限制性酶切位点)如下：

SLP引物1：5`AACCATGGCGCAAGTAAACGACTATAAC(Nco I)；

SLP引物2：5`AA GGATCCTTCTGAATATGCAGTAGTTG(BamH I)。

扩增蛋白A编码基因(序列见SEQ ID NO.10)，模板采用质粒pEZZ-18a(购自美国GE Healthcare公司)，引物对(引物上均已含有限制性酶切位点)如下：

蛋白A引物1：5`TGGATCCGACAACAAATTCAACAAAGAA(BamH I)；

蛋白A引物2：5`AACTCGAGTTATACTTTCGGCGCCTGAG(Xho I)。

(2)通过酶(Nco I、BamH I、Xho I)切连接的方式将SLP和蛋白A编码基因分别连接入原核表达载体pET28A(从美国Merck公司购买，其载体图谱见图3)，得到SLP与蛋白A的(SL-PA)融合表达载体。

(3)将所得到的SL-PA融合表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自美国Merck公司)，37℃培养4小时，然后加入终浓度为0.1mM IPTG进行诱导表达4h。收集诱导后菌体，加入50mM Tris缓冲液重悬菌体，用超声波破碎菌体，离心分离破碎后上清液及沉淀物，得到表达后的SL-PA包涵体沉淀物。

(4)用5M尿素溶解SL-PA包涵体，溶解后蛋白溶液用Superdex 200凝胶过滤层析柱进行纯化，流动相为50mM Tris、pH9.0的200mM NaCl溶液，流速2～5mL/min。纯化后得到可溶性的SL-PA融合蛋白。

(5)将SL-PA融合蛋白与含有50mM CaCl₂、pH值为6的Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶液混合，SL-PA终浓度为0.5mg/mL，得到包埋液。

(6)取1毫克经氨基修饰的聚乙烯包裹磁珠(直径为200nm)，与步骤(5)配制的包埋液混合，放置于4℃环境中包埋反应2小时。

(7)去除包埋后的上清液，用含有500mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液清洗磁珠。

(8)往磁珠中加入浓度为5mM的DMP(邻苯二甲酸二甲酯)交联缓冲液，室温中孵育20min。

(9)去除DMP交联缓冲液，用浓度为50mM Tris缓冲液清洗磁珠，即可得到交联有固定化SL-PA融合蛋白的磁珠。

所得到的固定有SL-PA融合蛋白的磁珠可用于抗体纯化、免疫检测、细胞筛选。

SL-PA包埋磁珠与人源IgG结合活性测试实验：

1)取SL-PA包埋磁珠1毫克，用1毫升人源IgG结合缓冲液(50mM磷酸缓冲液，pH7.5，其中NaCl浓度为150mM))洗两次；

2)取浓度为1mg/mL的人源IgG(从美国Sigma公司购买)300μL，加入清洗后磁珠及人源IgG结合缓冲液至总反应体积500μL，室温下混合15min，使人源IgG与磁珠结合；

3)收集反应后上清，加入1毫升人源IgG结合缓冲液洗一次，去除结合缓冲液；

4)加入1毫升人源IgG洗脱液(0.1M甘氨酸(pH2.0))，室温中混合均匀10min，使结合在磁珠上的人源IgG洗脱到上清液中；

5)收集含人源IgG的洗脱上清液，加入500μL人源IgG洗脱液振荡洗涤磁珠一次，收集上清；

6)在10000g离心条件下，将以上各次洗涤及洗脱的上清液离心10min，然后测定上清液在280nm处紫外光吸收值，计算人源IgG结合量及洗脱量。

结果如表1所示：

每毫克磁珠结合500μg SL-PA融合蛋白，包埋密度为9.3×10¹³molecules/cm²。

表1SL-PA包埋磁珠与IgG结合能力测试结果

从表1可以看出，每毫克SL-PA包埋磁珠能结合203μg人源IgG、洗脱169μg，回收率为83％。

与同类仅用蛋白A包埋的磁珠产品对比：SL-PA包埋磁珠IgG结合量比Invitrogen公司生产的 Protein A磁珠每毫克IgG结合量高出188.4μg；比Thermo公司MagnaBind ^TM Protein A磁珠每毫克IgG结合量高出163.4μg，SL-PA包埋磁珠IgG结合能力具有明显优势(参考图2与图4)。

经过70％乙醇(室温处理过夜)、6M盐酸胍(室温处理5min)、50mMNaOH+1MNaCl(室温处理10、20、30min)、0.1％Triton X-100(37℃处理1min)、95℃加热20min处理后，SL-PA包埋磁珠IgG结合能力仍能保持90％～100％，证明SL-PA包埋磁珠具有极高的稳定性(见图5)。

实施例2

一种将蛋白A定向固定到细胞培养板表面的方法，其原料和制备方法基本同实施例1，所不同的是以聚苯乙烯细胞培养板替代氨基聚乙烯包裹的磁珠。所得到的固定有SL-PA融合蛋白的聚苯乙烯细胞培养板可用于免疫检测。

SL-PA融合蛋白包埋细胞培养板人源IgG结合能力验证测试：

1)在SL-PA融合蛋白包埋细胞培养板的培养孔中加入200mL小鼠抗人IgG-HRP(1μg/mL，北京博士德公司)，室温中振荡结合30min。用水与牛血清白蛋白(BSA，浓度为1mg/mL，美国Sigma公司)代替SL-PA融合蛋白进行包埋实验的培养孔为负对照。

2)用PBST缓冲液(含0.1％Triton的50mM磷酸缓冲液，pH7.5)清洗培养孔2次，洗去未结合的IgG。

3)加入ECL荧光反应底物(Thermo公司)，暗室中显影并拍摄显影结果。

人源IgG结合试验结果见图6，与负对照相比，SL-PA融合蛋白包埋孔显影出强烈的荧光，证明此包埋孔具有IgG结合能力，可以用于酶联免疫反应(ELISA)。

SL-PA融合蛋白包埋表面电子显微镜图片(见图7)显示其具有极高的包埋密度。

实施例3

一种将链酶亲和素定向固定到磁珠(氨基聚乙烯包裹的磁珠，直径为200nm)表面的方法。链酶亲和素是一种从链霉菌属细菌Streptomyces avidinii中纯化获得的四聚体蛋白，大小为52800Da；一分子链酶亲和素可以高度特异性地与四分子生物素(Biotin)结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10¹⁵M数量级，这种高亲和性使其在分子(DNA、蛋白质)检测方面有广泛的应用；包括以下步骤：

(1)PCR扩增SLP和链酶亲和素的编码基因：

扩增SLP编码基因的方法和材料同实施例1步骤(1)；

扩增链酶亲和素编码基因，模板序列是SEQ ID NO.13，由赛业生物科技有限公司合成，采用以下引物对(已含有限制性酶切位点)：

SA引物1：5’-TACATGGGATCCGCATCACCGGCACCTG(BamH I)

SA引物2：5’-CGGCCTCGAGCCACCTTGGTGAAGGTGTCG(Xho I)；

(2)通过酶(Nco I、BamH I、Xho I)切连接的方式将SLP和链酶亲和素的编码基因分别连接入原核表达载体pET28A，得到SL-SA融合表达载体；

余下步骤同实施例1步骤(3)-(9)，最终得到固定有SL-SA融合蛋白的磁珠。

经检测(通过对比包埋前及包埋后溶液在280nm处紫外光吸收值(A280)，计算包埋前后溶液中SL-SA融合蛋白的量的变化，再计算出每毫克磁珠结合SL-SA融合蛋白的量)，每毫克氨基聚乙烯包埋的磁珠结合800μg SL-SA融合蛋白，包埋密度达到7.6×10¹³molecules/cm²。

本实施例的SL-SA融合蛋白包埋磁珠与Biotin结合能力测试：

方法：1毫克SL-SA融合蛋白包埋磁珠与1毫升300μg/mL的生物素化绿色荧光蛋白(Biotin-eGFP，海狸(广州)生物科技有限公司有售)混合，室温中混匀10分钟使磁珠与Biotin-eGFP结合，然后收集结合后上清液，用考马斯亮蓝G-250(Coomassie G-250，MBCHEM公司生产)染色法测定上清液中剩余的Biotin-eGFP的量，计算每毫克SL-SA融合蛋白磁珠结合Biotin-eGFP的量。

结果：每毫克SL-SA磁珠结合253.1μg Biotin-eGFP。

以上实验证明：①SLP可以成功地将SA固定到介质表面，固定化密度高(7.6×10¹³molecules/cm²)；②SLP固定化的SA活性不受影响：实验结果表明，SL-SA包埋磁珠具有卓越的Biotin结合能力，每毫克SL-SA包埋磁珠结合253.1μg Biotin-eGFP

实施例4

一种将蛋白G定向固定到磁珠(经氨基修饰的聚乙烯包裹磁珠，直径为200nm)表面的方法。蛋白G是一种从链球菌属Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis GGS_124分离得到的蛋白，可以与抗体Fc段特异结合，被广泛用于抗体纯化及免疫检测等领域。本实施例是将SLP与蛋白G的IgG结合结构域(C1、C2、C3结构域)进行融合表达。具体包括以下步骤：

(1)PCR扩增SLP蛋白和蛋白G编码基因：

扩增SLP编码基因的方法和材料同实施例1步骤(1)；

合成蛋白G编码基因，模板序列是SEQ ID NO.16，由赛业生物技术有限公司合成，引物对(引物上均已含有限制性酶切位点)如下：

蛋白G引物1：5`TGGATCCAAACCAGAAGTGATCGATGC(BamH I)；

蛋白G引物2：5`AACTCGAGCATCATAAGTCCAAACACCA(Xho I)。

(2)通过酶(Nco I、BamH I、Xho I)切连接的方式将SLP和蛋白G的编码基因分别连接入原核表达载体pET28A，得到SL-PG融合表达载体；

余下步骤同实施例1步骤(3)-(9)，最终得到固定有SL-PG融合蛋白的磁珠。所得到的固定有SL-PG融合蛋白的磁珠可用于抗体纯化、免疫检测、细胞筛选。

SL-PG融合蛋白包埋磁珠的大鼠IgG结合活性测试，测试方法同实施例1，结果如表2所示：

表2SL-PG包埋磁珠与大鼠IgG结合能力测试结果

从上表可以看出，每毫克磁珠结合500μg SL-PG融合蛋白，包埋密度为1.4×10¹⁴molecules/cm²。每毫克SL-PG融合蛋白包埋磁珠能结合167μg大鼠IgG、洗脱153μg，回收率为91.6％。

实施例5

一种将蛋白A/G定向固定到磁珠(经氨基修饰的聚乙烯包裹磁珠，直径为200nm)表面的方法。蛋白A/G是一个人工设计的、将蛋白A上5个IgG结合结构域与蛋白G上2个IgG结合结构域连接在一起的蛋白，可以与抗体Fc段特异结合，被广泛用于抗体纯化及免疫检测等领域。本实施例是将SLP与蛋白A/G的IgG结合结构域进行融合表达。)，具体包括以下步骤：

(1)PCR扩增SLP和蛋白A/G的编码基因：

扩增SLP编码基因的方法和材料同实施例1步骤(1)；

PCR扩增蛋白A/G编码基因，模板序列是SEQ ID NO.19，由赛业生物技术有限公司合成，引物对(引物上均已含有限制性酶切位点)如下：

蛋白A/G引物1：5`TGGATCCAATGCGGCACAGCACGATGA(BamH I)；

蛋白A/G引物2：5`AACTCGAGTTCCGTGACAGTAAACGTCT(Xho I)。

(2)通过酶(Nco I、BamH I、Xho I)切连接的方式将SLP和蛋白A/G编码基因分别连接入原核表达载体pET28A，得到SL-PA/G融合表达载体；

余下步骤同实施例1步骤(3)-(9)，最终得到交联有固定化SL-PA/G融合蛋白的磁珠。所得到的固定有SL-PA/G融合蛋白的磁珠可用于抗体纯化、免疫检测、细胞筛选等领域。

SL-PA/G融合蛋白包埋磁珠的大鼠IgG结合活性测试，测试方法同实施例1，结果如下表所示：

表3SL-PA/G包埋磁珠与大鼠IgG结合能力测试结果

从表2可以看出，每毫克磁珠结合500μg SL-PA/G融合蛋白，包埋密度为1.4×10¹⁴molecules/cm²。每毫克SL-PA/G融合蛋白包埋磁珠能结合254μg大鼠IgG、洗脱227μg，回收率为89.3％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

一种利用SLP将功能蛋白定向固定的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。