专利摘要

本发明公开了一种农用抗生素多氧霉素P及其生物合成方法与应用。本发明提供了的化合物，其结构式为如下式1：本发明还提供了一种制备上述化合物的方法，包括如下步骤：发酵重组菌7100ΔsanN/pol，收集发酵产物，即得到上述化合物；上述重组菌7100ΔsanN/pol为将pPOL导入圈卷产色链霉菌sanN阻断突变株中得到的重组菌。本发明的实验证明，本发明提供了一种新的化合物——多氧霉素P，其为发酵重组菌7100ΔsanN/pol制备得到的发酵产物，该化合物具有抑制真菌生长的活性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种农用抗生素多氧霉素P及其生物合成方法与应用。

背景技术

多氧霉素是由可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)产生的核苷肽类抗生素，由核苷和肽基两部分通过肽键缩合而成(图1)。由于它在结构上与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺类似，因此能够竞争性地抑制几丁质的合成，从而抑制真菌、昆虫等的生长。多氧霉素已经作为一种重要的农用抗真菌抗生素进行了大规模的应用，用于防治稻瘟病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病和白粉病、烟草赤星病、蔬菜白粉病、菌核病等真菌性植物病害。

尼可霉素(Nikkomycin)是由圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes 7100)产生的一种核苷肽类抗真菌抗生素，结构与多氧霉素非常类似(图1)。在尼可霉素生物合成途径中，SanN催化肽基部分的前体吡啶酰CoA形成吡啶醛。在sanN基因阻断突变株(ΔsanN)中，由于肽基部分合成的阻断而丧失了产生尼可霉素的能力，但是核苷部分的合成不受影响。且在多氧霉素生物合成基因簇中，并不存在sanN的同源基因，不会由于同源基因的互补导致尼可霉素的恢复产生，从而降低了分离纯化的难度。

多氧霉素的核苷部分为5-氨基己糖醛酸以N-糖苷键连接尿嘧啶，在尿嘧啶C-5位经常有甲基、羧基、羟甲基等修饰。而其肽基部分N端氨基酸为CPOAA，C端氨基酸为POIA，它们分别以肽键与核苷部分相连，形成多种多氧霉素组分(多氧霉素A-M)。这些多氧霉素组分均易溶于水，难溶于甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等常见有机溶剂。不同结构的多氧霉素对不同真菌的抑制作用存在差异。因此，为了扩大多氧霉素的抑菌谱范围，合成新的多氧霉素组分是必要的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种化合物。

本发明提供的化合物，其结构式为如下式1：

本发明的另一个目的是提供一种制备上述化合物的方法，包括如下步骤：

发酵圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol，收集发酵产物，即得到上述化合物；

上述圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol为将质粒pPOL导入圈卷产色链霉菌sanN阻断突变株ΔsanN中得到的重组菌。

在上述方法中，所述圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol的保藏号为CGMCC No.5520；

所述发酵的温度为28℃，所述发酵时间为4天-6天；所述发酵为震荡培养，所述震荡培养的转速为220rpm，所述震荡培养的旋转半径为30mm。

在上述方法中，在所述收集发酵产物的步骤后，还包括如下步骤：

1)将所述发酵产物离心取上清液、过滤，收集滤液；

2)将步骤1)得到的滤液经乙酸乙酯萃取，收集水相，浓缩，得到浓缩液；

3)将步骤2)得到的浓缩液经吸附树脂纯化，收集流穿液；

4)将步骤3)得到的流穿液经阳离子交换树脂纯化，收集洗脱液；

5)将步骤4)得到的洗脱液经无水乙醇沉淀、离心、沉淀溶解、过滤，收集滤液1；

6)将步骤5)得到的滤液1经HPLC纯化，收集洗脱液，得到上述的化合物。

在上述方法中，

步骤1)中，所述离心的时间为5min-10min，所述离心的离心力为4000g-8000g；

上述过滤采用孔径为3mm滤纸；

步骤2)中，所述乙酸乙酯和所述滤液的体积比为1∶3，萃取3次；

所述浓缩为旋转蒸发浓缩；

步骤3)中，所述吸附树脂纯化为将所述浓缩液经大孔吸附树脂HP20分离，收集流穿液；所述分离的流速为15ml/min；

步骤4)中，所述阳离子交换树脂纯化为将所述流穿液经强酸性阳离子交换树脂Dowex 50WX 2分离，用0.4M氨水洗脱，所述洗脱流速为8ml/min-10ml/min；

上述步骤4)中用0.4M氨水洗脱后，收集洗脱液，将所述洗脱液进行抗真菌检测，收集具有抗真菌活性的洗脱液进行如下步骤5)；

所述抗真菌检测中的真菌为长柄链格孢Alternaria longipes AS3.2875，检测方法为：将长柄链格孢Alternaria longipes AS3.2875的菌液与培养基混合倒入平板中，凝固后，在平板中的培养基上打洞，将所述洗脱液加入洞中，培养，若有抑菌圈则为抗真菌，若没有，则不抗真菌。

步骤5)中，所述沉淀的温度为4℃，所述沉淀的时间为12h，所述离心的温度为4℃，所述离心的离心力为8000g-13000g，所述离心的时间为20min；

上述溶解采用的溶剂为水，所述过滤采用2.2μm微孔滤膜；

步骤6)中，所述HPLC纯化为将所述滤液1经HPLC分离，用体积比为90∶10的三氟乙酸水溶液和甲醇组成的混合物进行洗脱，收集洗脱液为收集15.0min-15.5min的洗脱液；所述洗脱的流速0.3ml/min，所述三氟乙酸溶液为体积浓度为1‰的三氟乙酸水溶液。

在上述方法中，步骤1)中，在所述过滤前，还包括将所述上清液调pH值至4.5后静置12h的步骤；

在所述步骤3)和步骤4)间，还包括将所述流穿液调pH至4.5的步骤；

在步骤4)和步骤5)之间，还包括将所述洗脱液调解pH值至4.5的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为将质粒pPOL导入圈卷产色链霉菌sanN阻断突变株ΔsanN中得到的重组菌。

本发明的第三个目的是提供一株圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol。

本发明提供的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol，其保藏号为CGMCC No.5520。

本发明的第四个目的是提供一种抑菌剂。

本发明提供的抑菌剂，其活性成分为上述的化合物或上述的方法中的所述圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol发酵产物或上述重组菌或上述的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520。

上述抑菌剂中的菌具体为长柄链格孢(Alternaria longipes AS3.2875)。

上述的化合物或上述的方法中的所述圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol发酵产物或上述重组菌或上述的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520在抑菌和/或制备抑菌剂中的应用；上述菌具体为长柄链格孢(Alternaria longipes AS3.2875)。

上述菌株7100ΔsanN/pol于2011年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5520，其分类命名为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。

本发明的实验证明，本发明提供了一种新的化合物——多氧霉素P，其为发酵重组菌7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520制备得到的发酵产物，该化合物具有抑制真菌生长的活性，可作为农用抗生素使用，具有很好的农业应用前景。

附图说明

图1为多氧霉素和尼可霉素的化学结构

图2为重组菌株7100ΔsanN/pol的PCR验证

图3为化合物的质谱分析

图4为The ¹H-NMR spectrum of polyoxin P

图5为The ¹³C-NMR spectrum of polyoxin P

图6为The DEPT spectrum of polyoxin P

图7为The COSY spectrum of polyoxin P

图8为The HSQC spectrum of polyoxin P

图9为The HMBC spectrum of polyoxin P

图10为重组菌株7100ΔsanN/pol发酵液的生物活性检测

图11为多氧霉素P的生物活性检测

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、化合物多氧霉素P的获得

一、重组菌株7100ΔsanN/pol的构建

1、多氧霉素生物合成基因簇重组质粒的构建

从可可链霉菌基因组cosmid文库中筛选得到含有多氧霉素生物合成基因簇的质粒，并利用Red/ET技术将载体替换成可在链霉菌中稳定遗传的载体pSET152，从而构建了多氧霉素生物合成基因簇的重组质粒pPOL，pPOL含有从po1R-po1B间所有的多氧霉素生物合成必需基因。

重组质粒pPOL记载在Li Jine，Li Lei，Tian Yuqing，Niu Guoqing，and Tan Huarong*.(2011)Hybrid antibiotics with the nikkomycin nucleoside and polyoxin peptidyl moieties.Metab Eng.13：336-344，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

2、重组菌株7100ΔsanN/pol的构建

将多氧霉素生物合成基因簇的重组质粒pPOL转化E.coli ET12567(pUZ8002)(Li Jine，Li Lei，Tian Yuqing，Niu Guoqing，and Tan Huarong*.(2011)Hybrid antibiotics with the nikkomycin nucleoside and polyoxin peptidyl moieties.Metab Eng.13：336-344，公众可从中国科学院微生物研究所获得)感受态细胞中，通过大肠杆菌和链霉菌间的接合转移，将pPOL导入圈卷产色链霉菌sanN基因阻断突变株ΔsanN(Ling Hongbo，Wang Guojun，Li Jine and Tan Huarong*.(2008)sanN encoding a dehydrogenase is essential for nikkomycin biosynthesis in Streptomyces ansochromogenes.J Microbio Biotechnol.18(3)：397-403.，公众可从中国科学院微生物研究所获得)。

利用安普霉素筛选转化子，转化子在MS培养基上产孢，收集孢子。将孢子接种于液体YEME培养基中培养48h(28℃，220rpm)，提取总DNA，并做如下两组的PCR验证：A：由引物RTS/A-afsR(CCTCTACCGCAGTCTCCT和TGTCCTCGTCCTCCAGTT)进行的PCR扩增；B：由引物RTS/A-26(CCGCTCGCTCCACATCAAC和AGCCAGGAGTGGGTGAGGT)进行的PCR扩增。以S.cacaoi AS4.1602(Chen，W.，Huang，T.，He，X.，Meng，Q.，You，D.，Bai，L.，Li，J.，Wu，M.，Li，R.，Xie，Z.，Zhou，H.，Zhou，X.，Tan，H.，Deng，Z.(2009).Characterization of the polyoxin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cacaoi and engineered production of polyoxin H.J Biol Chem 284：10627-10638.，公众可从中国科学院微生物研究所获得)、S.ansochromogenes 7100(Chen，W.，Zeng，H.，and Tan，H.(2000).Cloning，sequencing，and function of sanF：A gene involved in nikkomycin biosynthesis of Streptomyces ansochromogenes.Curr Microbiol 41：312-316.，公众可从中国科学院微生物研究所获得)、突变株ΔsanN为对照。

结果如图2所示，1：S.cacaoi；2：S.ansochromogenes 7100；3-8：转化子；9：突变株ΔsanN；10：100bp ladder，可以看出，A组得到670bp的片段，且B组得到540bp的为阳性转化子，共得到7个阳性转化子，命名为重组菌株7100ΔsanN/pol。

上述菌株7100ΔsanN/pol于2011年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5520，其分类命名为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。

二、重组菌株7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520发酵液的获得

将重组菌株7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520的孢子接种于液体YEME培养基(酵母提取物0.3％，胰蛋白胨0.5％，麦芽提取物0.3％，蔗糖20％，每100ml使用前加入以下灭过菌的溶液，2.5M MgCl₂ 200μl，50％葡萄糖2ml，10％甘氨酸5ml)，震荡培养36h(28℃，220rpm)，然后按照1％比例接种于液体SP培养基(甘露醇3％，马铃薯淀粉1％，中性大豆蛋白胨0.5％，酵母提取物0.8％，pH＝6.0)中发酵培养5d(28℃，220rpm(旋转半径为30mm))，收集重组菌株7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520发酵液。

采用同样的方法培养S.ansochromogenes 7100、ΔsanN突变株和S.cacaoi，得到S.ansochromogenes 7100发酵液、ΔsanN突变株发酵液和S.cacaoi发酵液。

三、多氧霉素P(Polyoxin P)的获得

1、首先4000g 5min离心上述二得到的重组菌株7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520发酵液，收集上清液；用饱和草酸调上清液的pH值至4.5，4℃过夜后两层3mm滤纸过将上清液过滤，收集滤液；

2、乙酸乙酯萃取滤液(乙酸乙酯和所述滤液的体积比为1∶3，萃取3次)，收集水相并旋转蒸发浓缩(≤40℃)，得到浓缩液；

3、将浓缩液过大孔吸附树脂HP20(三菱公司)(流速15ml/min)，由于抗真菌活性物质并不吸附在大孔树脂上，所以收集流穿液；用乙酸重调流穿液pH至4.5；

4、将上述的流穿液过强酸性阳离子交换树脂Dowex 50WX 2(H+，100-200mesh，Sigma)，0.4M氨水洗脱，流速为10ml/min、收集具有抗真菌活性的洗脱液；

检测方法为：将长柄链格孢Alternaria longipes AS3.2875的菌液与培养基混合倒入平板中，凝固后，在平板中的培养基上打洞，将所述洗脱液加入洞中，培养，若有抑菌圈则为抗真菌，若没有，则不抗真菌。

5、将收集到的具有抗真菌活性的洗脱液旋转蒸发浓缩(≤40℃)至20ml，乙酸调pH值至4.5；

6、加入80ml预冷的无水乙醇，4℃过夜(12h)；4℃，13000rpm离心20min，收集沉淀并将其晾干；用水重新溶解沉淀，2.2μm微孔滤膜过滤后收集滤液；

7、将上述得到的滤液进行HPLC分离，HPLC分离的条件：试剂A：H₂O(1‰三氟乙酸)；试剂B：甲醇。洗脱条件：流速0.3ml/min，90％水(1‰三氟乙酸)和10％甲醇恒定梯度。仪器：Agilent 1100 HPLC；分析柱：Agilent公司的ZORBAX SB-Aq C18(4.6×250mm，5μm)，并使用Agilent公司的相应的预柱。收集15.0-15.5min的液体为化合物1，并冷冻抽干。

将上述得到的化合物1进行结构鉴定。首先进行质谱分析，采用的是LCQ Deca XPPlus(Thermo-Finnigan)质谱仪(电喷雾离子源)和Aglient quadrupole time-of-flight(Q-TOF)LC/MS高分辨质谱仪。核磁共振研究采用的是Bruker instruments(AV600MHz)仪器进行的分析。

化合物1的最大紫外吸收值在260nm左右，并通过质谱和核磁共振进行结构鉴定，结果如下：

化合物1的一级质谱数据表明，它的分子离子峰为[M+H]⁺＝476；结合二级质谱中化学键的断裂方式及各个残基的质荷比，推测这个化合物的结构与多氧霉素类似。为了确定其化学式，又将此化合物进行高分辨质谱分析(图3)，测定其分子离子峰为[M+H]⁺＝476.1647，推测其化学式为C₁₇H₂₅N₅O₁₁([M+H]⁺理论计算值为476.1629)。

以上数据还不足以阐明这个化合物的化学结构，所以将其进行核磁共振研究(表1)。根据其¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、COSY、HSQC及HMBC图谱(图4-9)，推测了它的化学结构：核苷部分为5-氨基己糖醛酸以N-糖苷键连接尿嘧啶碱基，在尿嘧啶C-5位有甲基修饰；肽基部分为缺失一个羟基的CPOAA。

将化合物1命名为多氧霉素P(Polyoxin P)，其化学结构式如下式1：

表1化合物的核磁共振分析(δin ppm，mult.，J in Hz)

实施例2、重组菌株7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520发酵液及多氧霉素P(Polyoxin P)的抑菌能力

一、重组菌株7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520发酵液的抑菌能力

将长柄链格孢Alternaria longipes AS3.2875(接种PDA液体培养基(取去皮的土豆200g，加900ml蒸馏水，煮沸15min，四层纱布过滤，滤液定容至1000ml，并在其中加入20g葡萄糖，15磅灭菌30min。固体PDA培养基中加入0.8％的琼脂)，28℃，220rpm培养5d。将培养好的菌液用匀浆机打匀，按照10％比例和融化的固体PDA培养基混匀，取100ml混合物倒入直径12cm的平板中。待琼脂凝固后，用打孔器移出琼脂块，在孔洞内加入100μl由实施例1得到的重组菌株7100ΔsanN/pol CGMCC No.5520发酵液做抑菌试验(2d，28℃)。以S.ansochromogenes 7100发酵液、ΔsanN突变株发酵液和S.cacaoi发酵液为对照。

结果如图10所示，其中，1为S.ansochromogenes 7100发酵液；2为ΔsanN突变株发酵液；3为S.cacaoi发酵液；4-9为重组菌株7100ΔsanN/pol发酵液，抑菌圈大小具体如下：1为5.5cm，2为无抑菌圈，3为1.6cm，4为3.5cm，5为3.7cm，6为3.7cm，7为3.9cm，8为3.3cm，9为3.7cm。结果可以看出，重组菌株7100ΔsanN/pol的发酵液具有抑制长柄链格孢生长的活性，其抑菌能力虽然弱于圈卷产色链霉菌(S.ansochromogenes 7100)，却高于可可链霉菌(S.cacaoi)。

二、多氧霉素P(Polyoxin P)的抑菌能力

采用上述一的方法，不同的在孔洞内加入100μl由实施例1得到的0.1mg/ml多氧霉素P(Polyoxin P，溶于水中)做抑菌试验(2d，28℃)。

结果如图11所示，A：S.ansochromogenes 7100发酵液稀释10倍，上样100μl；B：S.cacaoi发酵液上样100μl；C：0.1mg/ml的由实施例1得到的多氧霉素P，上样100μl，抑菌圈大小具体如下：A为3.1cm，B为3.1cm，C为3.8cm。

可以看出，多氧霉素P能够抑制植物病原真菌长柄链格孢的生长。

农用抗生素多氧霉素P及其生物合成方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。