专利摘要

一种无创性动态监测材料体内降解速率与组织再生匹配程度的方法，采用一维成像方法和三维成像方法同时对植入受试生物体内的材料进行双模式成像。本发明提供的监测方法，不但能从一维平面监测，能从三维空间结构进行监测，可以建立监测支架材料降解速率与组织形成匹配程度的体系，实现监测的无创性和动态性。

权利要求

1.一种监测的方法，其特征在于采用一维成像方法和三维成像方法同时对植入受试生物体内的材料进行双模式成像。

2.根据权利要求1所述的监测方法，其特征在于所述的一维成像方法选自于荧光成像方法和同位素成像方法之一种或几种。

3.根据权利要求1所述的监测方法，其特征在于所述的三维成像方法选自于CT成像方法、磁共振成像方法、PET成像方法和B超成像方法之一种或几种。

4.根据权利要求1所述的监测方法用于监测支架材料的降解速率。

5.根据权利要求1所述的监测方法用于监测组织再生的状态。

6.根据权利要求1所述的监测方法用于监测材料降解速率与组织再生匹配程度。

7.根据权利要求1所述的监测方法在组织修复中的应用。

8.根据权利要求1所述的监测方法，其特征在于所述的材料为标记或掺杂标记物的生物可降解材料。

9.根据权利要求1所述的监测方法，其特征在于所述的标记物选自于荧光标记物、磁颗粒标记物和同位素标记物之一种或几种。

10.根据权利要求1所述的监测方法，其特征在于所述的标记物选自于荧光纳米标记物、磁颗粒纳米标记物和同位素纳米标记物之一种或几种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植入材料在生物体内降解的成像和监测方法，尤其涉及一种监测材料降解速率与组织形成匹配程度的方法，实现监测的动态性和无创性。

背景技术

组织工程基本原理是将体外扩增的种子细胞接种到可降解支架材料上，通过细胞在支架材料上的增殖和细胞外基质分泌及支架材料的逐步降解，从而最终在体外或体内形成组织工程化组织。在这一过程中，支架材料不仅提供了细胞粘附、迁移、增殖和功能代谢，还承载着细胞与信号分子以及营养物质的传输和废物的排泄通畅等功能。

理想支架材料的重要特征之一是具有与组织形成相匹配的降解速率。支架材料过早降解将无法提供所需的支架让细胞再生组织；过晚降解则导致占位置效应使细胞无空间再生组织。然而在实际研究中，如何动态监测支架材料降解速率与组织形成是否匹配仍然是一个本领域亟待解决的难题之一。

传统的研究方法是采用组织切片染色法来确定支架材料的降解情况和组织再生情况。但这一方法依赖于在固定时间节点处死不同个体动物，无法实现同一动物体内的连续观察。近年来，非侵入成像技术(Non-invasive Imaging Technology，NIR)得到迅速发展，包括X射线计算机断层成像(CT)、超声成像(USI)、磁共振成像(MRI)以及荧光光学成像技术等，为动态监测体内组织工程支架材料降解提供了可行性。然而，生物大分子或高分子聚合物等组织工程支架材料无法采用上述方法成像或显影。

中国发明专利ZL200910026721.9公开了一种可生物降解荧光聚酯共聚物的制备方法，以3,4-二羟基肉桂酸为主单体，不同分子量的聚乙二醇PEG400、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000、乳酸、对羟基苯甲酸、或石胆酸为功能单体，乙酸钠为催化剂，乙酸酐为溶剂，采用两步熔融缩聚法得到了咖啡酸酯类共聚物。所制备的咖啡酸酯类共聚物可作为降解材料或荧光探针应用于组织工程、生物医药以及环保等领域。

中国发明专利申请201410711669.1公开了一种具有荧光性的接枝可降解嵌段聚氨酯、骨修复材料及制备方法，在由脂肪族二异氰酸酯的硬段，与含有端羟基的聚合物或嵌段共聚物的可降解聚合物链段的软段聚合而成的结构中接枝有医学中可以接受的荧光性成分。骨修复材料该聚氨酯与纳米羟基磷灰石粉末共同组成，具有良好的生物相容性和可降解性，并同时具有荧光特性，可用来示踪评价嵌段聚氨酯的降解过程，分析降解机理，考察降解速率对材料力学性能和组织再生重建过程的影响，为高分子降解材料的生物安全性评价提供新的视角和手段。

2013年，哈佛大学的Soon Hee Kim等才首次报道利用小鼠动物模型，通过两性离子近红外荧光纳米分子探针ZW800-1标记胶原支架并对其进行了长时间体内近红外荧光成像。结果表明，荧光成像可以实时示踪胶原支架在体内代谢的动态过程(Scientific reports 2013；3)。

随着支架材料的降解，解体的材料单体和荧光纳米探针将被释放和清除，修复区域的荧光会越来越弱，直至支架完全降解而消失。而在支架材料降解过程中，新生组织再生(如成软骨或成骨等)的密度和体积越来越大，直至修复整个创伤区。在这一过程中，支架材料降解后所释放的游离荧光标记物可被周围细胞吞噬而进入新生组织之中，使新生组织具有荧光标记，从而导致在荧光成像系统中无法区分未降解的支架材料上的荧光信号。

因此，荧光分子探针和荧光成像系统虽然能对支架材料的降解情况在细胞和分子水平上进行示踪，具有很高的灵敏度，但是它的不足之处在于只能在一维平面上成像，无法获得活体三维结构(剖视性)和三维空间分辨率低下等。同时，荧光探针在代谢时有可能被周围细胞吸收，从而进入新生组织中，荧光残留其中时，怎样区分新生组织的残留荧光和原支架材料荧光，成为单独使用荧光成像无法解决的难题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种监测材料降解速率的方法，实现监测的动态性和无创性。

本发明的另一个目的在于提供通过组织工程在体内所形成组织的状况进行监测的方法，实现监测的动态性和无创性。

本发明的再一个目的在于提供一种监测材料降解速率与组织形成匹配程度的方法，实现监测的动态性和无创性。

本发明的又一个目的在于提供在骨修复中无创和动态监测材料降解速率、组织形成及其匹配程度的方法。

本发明提供的一种监测材料降解速率与组织形成匹配程度的方法，采用一维成像方法和三维成像方法同时对植入受试生物体内的材料进行双模式成像。一维成像方法如：但不仅限于荧光成像方法和同位素成像方法。三维成像方法如：但不仅限于CT成像方法、磁共振成像方法、PET成像方法和B超成像方法等。

可将本发明提供的监测方法用于组织修复(如：骨生成)，以监测支架材料的降解速率，组织再生的状态及其匹配程度。

一维成像方法(如：荧光成像系统)和三维成像方法(如：Micro CT)组成的双模式成像不但能从一维平面(如：荧光)监测，同时能从三维空间结构(如：Micro CT显微成像)进行监测，二者结合的使用具有互补效应。

植入受试生物体内的材料为生物可降解材料如：但不仅限于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)，其上标记或混入(掺杂)的标记物，如：但不仅限于荧光标记物、磁颗粒标记物和同位素标记物等，尤其是荧光纳米标记物、磁颗粒纳米标记物和同位素纳米标记物等。标记物优先选择近红外荧光材料，如：但不仅限于金纳米团簇(Nanoscale 2012,4(24):7766-72；Nano Res.2012,5(9):630-639；Nanoscale Res.Lett.2013,8(1):182)。

一维成像设备从植入材料的受试生物体捕捉射线信号。如：荧光成像设备将红外光(尤其是近红外光)照射植入材料的受试生物体，通过照相机捕捉照射后的光信号。

三维成像设备从植入材料的受试生物体捕捉射线信号。如：显微CT设备将X射线照射植入材料的受试生物体，通过X射线探测器获得监测信号并成像。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的方法，将一维成像方法和三维成像方法二者结合，同时对植入受试生物体内的材料进行双模式成像，不但能从一维平面监测，同时能从三维空间结构进行监测，可以建立监测支架材料降解速率与组织形成匹配程度的体系，实现监测的无创性和动态性。

本发明提供的方法还可以解决特殊条件下荧光的区分，即对游离的和支架材料上的荧光信号实现区分，解决新生组织中对原支架材料所发荧光的干扰问题，达到有效区分支架材料和新生组织的目的，并最终解决支架材料的降解速率和组织再生相匹配监测的难题。

附图说明

图1为本发明监测材料降解速率的方法一实施例的示意图；

图2为裸鼠皮下植入可降解材料时的CT图；

图3为可降解材料植入裸鼠皮下后的降解CT图；

图4为大鼠颅骨受损时的CT图，图中箭头所示为受损处；

图5为在大鼠颅骨受损处植入可降解材料原位组织修复的CT图，图中箭头所示为受损处经修复后的状态。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

经研究发现，Micro CT成像只能对硬组织，例如：骨骼和牙齿等组织具有良好成像效果，而对密度低的软组织如肝脏、心脏、血管和胃肠道等以及高分子材料或聚合物等成像效果差，组织之间无法区分，且有些不能成像。利用牛血清蛋白(BSA)或鸡蛋清等为模板，成功地制备了一系列具有良好生物相容性的贵金属荧光纳米团簇(Au、Ag、Pt Cluster)(Nanoscale Research Letters,2013,8:182；Nanoscale 2012,4(24):7766)，实验结果表明，金纳米粒子或纳米团簇在小动物血管造影和肿瘤成像中都具有良好的CT成像效果(Optics Express 2011,19(18):17030；J.Mater.Chem.B,2014,2(40):6931-6938；J.Mater.Chem.B,2013,1(38):5045-5053)。金纳米粒子是有效的软组织CT造影剂，而金纳米团簇具有很好的荧光特性，完全符合荧光和Micro CT双模式成像的要求。

目前，在材料科学领域中，无机纳米材料或有机高分子材料等表面修饰或改性，一般运用直接吸附、静电吸附、偶联剂共价链接等。特别高分子聚合物，例如：PLGA的表面亲水性修饰。在PLGA中加入碱性物质形成碱性溶液，溶液中的氢氧根离子和聚合物材料分子骨架中的酯键发生反应，导致聚合物分子链中的部分酯键发生断裂，从而使聚合物材料表面形成暴露的亲水基团-羧基和羟基，这些亲水基团的出现和增多有助于改善PLGA的亲水性，增强材料的细胞粘附性。因此，PLGA的羧基上通过偶联剂共价链接带有氨基端的荧光金纳米团簇。化学偶联法具有结合牢固、量化关系明显等优点。

化学法制取荧光标记PLGA材料的步骤具体如下：先取PLGA支架材料0.1g，加入10mM的氢氧化钠溶液50mL，形成碱性溶液，溶液中的氢氧根离子和聚合物材料分子骨架中的酯键发生反应，导致聚合物分子链中的酯键发生部分断裂，从而使PLGA材料表面形成暴露的亲水基团-羧基和羟基，提供了标记纳米团簇的结合位点。

将2mg的EDC、0.1mg的NHS以及0.2mg的纳米团簇加入500μL连接缓冲液中混匀，避光连续旋转反应30分钟，活化纳米团簇的氨基后加入已制备的羧基化的PLGA材料，避光连续旋转反应24小时。收集溶液以5×10³rpm离心洗涤两次，每次15分钟，弃去上清液以除去溶液中过量的未反应的纳米团簇，最后将制备好的具有近红外荧光金纳米团簇PLGA材料冷冻干燥以备用。

还可采用直接掺杂和三维打印法制备荧光PLGA。具体过程如下：(1)将不同分子量的PLGA在高温下融化，再取不同浓度的荧光金纳米团簇加入融化的PLGA溶液中，充分搅拌，以备用；(2)模型动物修复待修复区域微观数据的获得：取大鼠颅骨标本，清除表面皮肤及软组织。采用Micro-CT扫描(μCT-80)，扫描阈值设为220Hu。平扫数据传至图形数据处理工作站，以DICOM格式保存所有数据；(3)根据DICOM数据筛选并生成STL文件：将Micro-CT的数据导入医学三维图像处理软件Mimics，按照灰度将骨骼、软骨、软组织分辨清楚并分离出骨骼的三维影像数据，确定分辨率及精度后便可看到数字资料构建的高度仿生颅骨缺损模型；(4)颅骨快速成型：STL文件是目前可以被大多数RP(快速成型)机识别的三维数据格式，将Mimics软件编辑的STL文件传送至快速成型机(杭州3D-Print公司提供)，最后用荧光纳米团簇掺杂的PLGA将其打印成型。

图1是本发明运用一维成像方法和三维成像方法同时对植入受试生物体内的材料进行双模式成像以监测材料降解速率与组织形成匹配程度的一实施例示意图。制得的荧光标记或掺杂的PLGA材料植入受试生物体，在特定的时间和时间间隔同时应用荧光成像设备和显微CT设备(即双模式成像技术)对受试生物体进行监测，了解植入材料的降解速率和组织形成状况及其匹配程度。

荧光成像设备为近红外成像系统是在改进的Kodak活体成像仪上完成。Andor DU897EMCCD作为信号接收器。近红外荧光图像通过Kodak分子成像软件进行分析。激发光源使用另外引入的连续波近红外激光器，发射光谱收集范围为600nm-1100nm。受试生物体(如：裸鼠)采用10％的水合氯醛麻醉后进行活体近红外成像观测。

显微CT成像采用瑞士SCANCO Medical AG公司的MicroCTμCT80型。裸鼠麻醉后固定于样品池中，采用20μm的分辨率，进行快速扫描，最后三维重建。分析实验组和对照组PLGA裸鼠皮下的降解情况。

实施例1裸鼠皮下植入(异位)降解模型动态监测

选取裸鼠70只，分成4组，分别于裸鼠皮下种植体积相同的上述荧光PLGA作为实验组和非标记的PLGA作为对照组。其中两组用于双模式成像技术连续动态观测(实验组5只+对照组5只＝10只)，每两周观测一次，观测3个月，共6次双模式成像监测，采集数据。另外两组用于组织切片染色法验证双模式监测结果(实验组30只+对照组30＝60只)，对应于动态监测的时间，每两周取样一次，每次取实验组和对照组各5只，做组织切片染色检测支架材料的降解情况，分析数据。

根据选取的时间节点，分别收集对应的近红外成像和显微CT成像结果(参见图2和图3)，经图像软件分析，依据成像信号的变化计算出相应的降解速率以及新生组织的成骨效果。

实施例2大鼠组织工程颅骨再生模型的建立(原位降解模型)及其动态监测

选取昆明大鼠70只，分成4组，分别麻醉后在大鼠颅骨上钻取直径为5mm颅骨缺损(参见图4)，取上述荧光PLGA作为实验组和非标记的PLGA作为对照组进行实验，分别将实验组和对照组支架材料填充到颅骨缺损内，然后缝合伤口。其中两组用于双模式成像技术连续动态观测(实验组5只+对照组5只＝10只)，每两周观测一次，观测3个月，共6次双模式成像监测，采集数据。另外两组用于组织切片染色法验证双模式监测结果(实验组30只+对照组30＝60只)，对应于动态监测的时间，每两周取样一次，每次取实验组和对照组各5只，做组织切片染色检测支架材料的降解情况，分析数据。

实时观测动物模型体内移植手术部位的近红外光学成像和显微CT成像的变化情况，确定荧光PLGA支架材料体内降解速率和新生组织再生的过程和特征。根据选取的时间节点，分别收集对应的近红外成像和显微CT成像结果，经图像软件分析出来，依据成像信号的变化计算出相应的降解速率以及新生组织的成骨效果(参见图5)。

无创性动态监测材料降解速率与组织再生匹配程度的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。