专利摘要

本发明公开了一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及用途，制备方法为：设计核糖体结合位点RBS1、RBS2、RBS3、RBS4和RBS5；将各个核糖体结合位点分别与基因ribA、ribB、ribD、ribE、ribC连接成片段，将各片段按顺序拼接并酶切连接到质粒pTrc99a得到质粒p20C-EC10；转入大肠杆菌，得到RF01S菌株；改造RF01S菌株的糖酵解途径及ED途径的相关基因，以提高核黄素的产量，并对核黄素的消耗途径进行改造，使核黄素代谢速度下降以进一步提高核黄素积累；将Ptrc强启动子插入到菌株的基因组中，得到生产核黄素的大肠杆菌菌株。本发明所构建的大肠杆菌菌株遗传背景清楚，可利用葡萄糖为底物生产核黄素，且在摇瓶发酵结果为1g/L以上，为提高核黄素产量和产率奠定了基础。

权利要求

1.一种生产核黄素的大肠杆菌菌株构建方法，其特征是包括如下步骤：

（1）设计以SEQ ID NO.37所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO.38所示的核糖体结合位点RBS2、以SEQ ID NO.39所示的核糖体结合位点RBS3、以SEQ ID NO.40所示的核糖体结合位点RBS4和以SEQ ID NO.41所示的核糖体结合位点RBS5；

（2）分别将所述RBS1和基因ribA连接成片段1、将RBS2和基因ribB连接成片段2、将RBS3和基因ribD连接成片段3、将RBS4和基因ribE连接成片段4、将RBS5和基因ribC连接成片段5；

（3）将步骤（2）所获得的片段1、片段2、片段3、片段4和片段5通过重叠-延伸PCR依次连接并酶切连接到质粒pTrc99a得到质粒p20C-EC10；转入大肠杆菌Escherichia coli MG1655，得到菌株命名为RF01S；

（4）敲除步骤（3）所获得的菌株基因组的糖酵解途径中的pgi基因和ED途径中的edd基因及eda基因；对基因组的ribF基因上游+14到-96之间的序列置换为由SEQ ID NO.42所示的J23115序列，得到由SEQ ID NO.43所示的ribF基因及改造后的上游序列，使核黄素代谢速度下降；

（5）将Ptrc强启动子插入到步骤（4）所获菌株的基因组中acs基因上游55bp位点上，得到基因型为E.coli MG1655,ΔpgiΔedaΔedd P_J23115-ribF P_trc-acs;P_trc-RBS1-ribA-RBS2-ribB-RBS3-ribD-RBS4-ribE-RBS5-ribC,amp，命名为E.coli RF05S的生产核黄素的大肠杆菌菌株。

2.权利要求1的方法构建的生产核黄素的大肠杆菌菌株。

3.权利要求2的生产核黄素的大肠杆菌菌株在发酵生产核黄素的用途。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及应用。

背景技术

维生素B2，又称核黄素，是一种黄色的天然水溶性B族维生素。维生素B2作为人体必需的13种维生素之一，微溶于水。核黄素是机体内许多酶系统的重要辅基－黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)与黄素单核甘酸(FMN)的组成成分。作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸作用和生物氧化的代谢过程中起着重要的作用，是生命活动必需的维生素，是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质。此外核黄素已作为饲料添加剂、食品添加剂及色素广泛应用于饲料、食品、医药等领域。

核黄素的生产工艺主要有4种：植物体提取法、化学合成法、半微生物发酵合成法和微生物发酵法。在工业上应用的核黄素生产方法主要为微生物发酵法和半微生物发酵合成法两种。半微生物发酵合成法工艺简化、成本较低，长期以来是核黄素工业生产的主要方法之一，半微生物发酵合成法生产核黄素的过程中原料浪费较大，耗能比发酵法高；其次是生产中需要大量的有机溶剂甲酸具有强烈的刺激性和腐蚀性，环境污染严重。相较于化学合成法和半微生物发酵合成法，微生物发酵法具有微生物发酵法是后来发展起来的一种十分经济有效的方法，生产工艺简单、原料廉价，且成本低、环境友好、生产周期短、产品纯度较高等优点，目前已成为核黄素工业化生产的主要方法。

目前生产上应用的产核黄素菌株产氨棒杆菌(Corynebactia aminogensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、棉囊阿舒霉(Ashbya gossypii)、无名假丝酵母(Candida famata)及阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbya)等菌株多是通过多轮理化诱变之后筛选到的，由于随机诱变引入突变点的不确定性，这些生产菌株往往具有比较复杂的遗传背景，使得通过代谢工程进一步合理改进这些工业菌株面临着较大的挑战。大量未知突变的存在也使得对进一步合理改进的解释和评估变得更为复杂了。另外，随机诱变使得高产菌株在逐渐积累和目标产品高产相关的正突变的过程中也不可避免的积累了一些不利突变点以及一些与目标表型无关的突变点。枯草芽孢杆菌中核黄素的生产和菌体的生长是相偶联的，在稳定期核黄素已不再积累。然而在棉囊阿舒霉中，核黄素的生产是在稳定期不再与生产关联，但在指数生长期没有积累核黄素。无名假丝酵母相较于丝状真菌更容易放大培养，用于工业生产的无名假丝酵母dep8菌株也是相当不稳定的。它们大都在菌体生长速度、底物利用种类、遗传稳定性等方面存在缺陷。与这些性状相关的基因型通常非常复杂。

大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。

经检索，目前未见有使用代谢工程改造的大肠杆菌生产核黄素的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能高效率地生产核黄素的大肠杆菌菌株。

本发明的第二个目的是提供一种生产核黄素的大肠杆菌菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种生产核黄素的大肠杆菌菌株的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产核黄素的大肠杆菌菌株构建方法，包括如下步骤：

（1）设计以SEQ ID NO.37所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO.38所示的核糖体结合位点RBS2、以SEQ ID NO.39所示的核糖体结合位点RBS3、以SEQ ID NO.40所示的核糖体结合位点RBS4和以SEQ ID NO.41所示的核糖体结合位点RBS5；

（2）分别将所述RBS1和基因ribA连接成片段1、将RBS2和基因ribB连接成片段2、将RBS3和基因ribD连接成片段3、将RBS4和基因ribE连接成片段4、将RBS5和基因ribC连接成片段5；

（3）将步骤（2）所获得的片段1、片段2、片段3、片段4和片段5通过重叠-延伸PCR依次连接并酶切连接到质粒pTrc99a得到质粒p20C-EC10；转入大肠杆菌Escherichia coli MG1655，得到菌株命名为RF01S；

（4）敲除步骤（3）所获得的菌株基因组的糖酵解途径中的pgi基因和ED途径中的edd基因及eda基因；对基因组的ribF基因上游+14到-96之间的序列置换为由SEQ ID NO.42所示的J23115序列，得到由SEQ ID NO.43所示的ribF基因及改造后的上游序列，使核黄素代谢速度下降；

（5）将Ptrc强启动子插入到步骤（4）所获菌株的基因组中acs基因上游55bp位点上，得到基因型为E.coli MG1655,ΔpgiΔedaΔedd P_J23115-ribF Ptrc-acs；P_trc-RBS1-ribA-RBS2-ribB-RBS3-ribD-RBS4-ribE-RBS5-ribC,amp，命名为E.coli RF05S的生产核黄素的大肠杆菌菌株。

上述方法构建的生产核黄素的大肠杆菌菌株。

上述生产核黄素的大肠杆菌菌株在发酵生产核黄素的用途。

本发明所构建的大肠杆菌菌株克服了目前核黄素生产菌株遗传背景不清楚的缺点，可以利用葡萄糖为底物生产核黄素，且在摇瓶的发酵结果为1g/L以上，这为后续发酵罐连续补料提高核黄素的产量和产率奠定了基础。

附图说明

图1为基因操作靶点。

图2为核黄素合成通路中各个基因的构建。

图3为pTrc99a图谱。

图4为核黄素操纵子EC10。

图5为质粒p20C-EC10构建图。

图6为电泳验证图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的原始菌株E.coli MG1655来源为CGSC（Coli Genetic Stock Center，http://cgsc.biology.yale.edu/）。

原始质粒pTKRED和pTKS/CS来源为Addgene(Addgene,https://www.addgene.org/)。

所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买（http://www.thermoscientificbio.com/fermentas）。

所用其他生化试剂从生工生物工程（上海）股份有限公司购买（http://www.sangon.com/）。

由于大肠杆菌核黄素合成代谢通路的相关基因是分散在大肠杆菌的基因组上的，鉴于此，我们通过给大肠杆菌核黄素合成代谢通路的五个基因（ribA、ribB、ribD、ribE、ribC）的编码序列上游加入一个人工设计的核糖体结合位点（RBS1、RBS2、RBS3、RBS4、RBS5），将该核糖体结合位点加到设计的上游引物序列中(FuECribA-F、FuECribB-F、FuECribD-F、FuECribE-F、FuECribC-F)，并组合成一个操纵子。将操纵子酶切连接到质粒pTrc99a中，再转入到大肠杆菌中，并对大肠杆菌基因组进行改造，具体步骤见实施例。

图1为基因操作靶点，其中黑色的“X”表示敲除，加粗表示过表达，空心前头表示弱化，虚线表示该途径不在本申请讨论的范围内。

实施例1

设计以SEQ ID NO.37所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO.38所示的核糖体结合位点RBS2、以SEQ ID NO.39所示的核糖体结合位点RBS3、以SEQ ID NO.40所示的核糖体结合位点RBS4和以SEQ ID NO.41所示的核糖体结合位点RBS5。

实施例2

利用扩增引物FuECribA-F（SEQ ID NO.1）/FuECribA-R（SEQ ID NO.2）以大肠杆菌MG1655(购自CGSC)基因组为模板将核黄素合成代谢通路上ribA基因人工设计的核糖体结合位点RBS1及编码序列扩增出来，得到片段1(见图2)。

利用扩增引物FuECribB-F（SEQ ID NO.3）/FuECribB-R（SEQ ID NO.4）以大肠杆菌MG1655(购自CGSC)基因组为模板将核黄素合成代谢通路上ribB基因人工设计的核糖体结合位点RBS2及编码序列扩增出来，得到片段2(见图2)。

利用扩增引物FuECribD-F（SEQ ID NO.5）/FuECribD-R（SEQ ID NO.6）以大肠杆菌MG1655(购自CGSC)基因组为模板将核黄素合成代谢通路上ribD基因人工设计的核糖体结合位点RBS3及编码序列扩增出来，得到片段3(见图2)。

利用扩增引物FuECribE-F（SEQ ID NO.7）/FuECribE-R（SEQ ID NO.8）以大肠杆菌MG1655(购自CGSC)基因组为模板将核黄素合成代谢通路上ribE基因人工设计的核糖体结合位点RBS4及编码序列扩增出来，得到片段4(见图2)。

利用扩增引物FuECribC-F（SEQ ID NO.9）/FuECribC-R（SEQ ID NO.10）以大肠杆菌MG1655(购自CGSC)基因组为模板将核黄素合成代谢通路上ribC基因人工设计的核糖体结合位点RBS5及编码序列扩增出来，得到片段5(见图2)。

实施例3

利用扩增引物FuECribA-F（SEQ ID NO.1）/FuECribC-R（SEQ ID NO.10），以实施例2获得的片段1、片段2、片段3、片段4和片段5为模板，通过重叠-延伸聚合酶链式反应将这5个基因以RBS1-ribA-RBS2-ribB-RBS3-ribD-RBS4-ribE-RBS5-ribC的顺序拼接起来并命名该操纵子为EC10(见图4)，在EcoRⅠ/HindⅢ位点克隆到质粒pTrc99a（见图3，购自Addgene）质粒经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到质粒p20C-EC10(见图5)，并将该质粒转入到大肠杆菌Escherichia coli MG1655，得到RF01S菌株。

其中，LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L的NaCl，调节pH至7.0。0.1Mpa压力下灭菌20min。LB固体培养基配方为：在调节好pH值的LB液体培养基中加入15g/L的琼脂粉，0.1Mpa压力下灭菌20min。

实施例4

（1）敲除RF01S菌株基因组的糖酵解途径中的pgi基因的具体操作如下：

利用Δpgi U_F（SEQ ID NO.11）、Δpgi U_R（SEQ ID NO.12）和Δpgi L_F（SEQ ID NO.15）、Δpgi L_R（SEQ ID NO.16）两对引物，以E.coli MG1655的基因组为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为353bp和325bp的上下游同源臂Δpgi-U和Δpgi-L。利用Δpgi T_F（SEQ ID NO.13）、T2（SEQ ID NO.36）和T1（SEQ ID NO.35）、Δpgi T_R（SEQ ID NO.14）以质粒pTKS/CS为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为1065bp和875bp的四环素上下游片段Δpgi-T2和Δpgi-T1。经切胶回收后利用引物Δpgi U_F（SEQ ID NO.11）、T2（SEQ ID NO.36）和T1（SEQ ID NO.35）、Δpgi L_R（SEQ ID NO.16），同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上游同源臂和四环素上游及下游同源臂和四环素下游的拼接产物Δpgi-UT,Δpgi-TL,大小分别为1384bp和1170bp。以上两个片段经切胶回收后利用引物Δpgi U_F（SEQ ID NO.11）、Δpgi L_R（SEQ ID NO.16），同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到大小为1976bp上下游同源臂和四环素PCR敲除片段Δpgi-tet。

将质粒pTKRED转入E.coli RF01S菌株中并制作成电转感受态；将片段Δpgi-tet转入电转感受态，用四环素筛选阳性克隆,并用菌落PCR验证。四环素抗性基因通过诱导归巢核酸内切酶I-sceI的表达将其删掉,并用菌落PCR验证，从而得到代谢工程菌株RF02S菌株。

（2）敲除ED途径中的edd基因及eda基因的具体操作如下：

利用ΔED U_F（SEQ ID NO.17）、ΔED U_R（SEQ ID NO.18）和ΔED L_F（SEQ ID NO.21）、ΔED L_R（SEQ ID NO.22）两对引物，以E.coli MG1655的基因组为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为421bp和331bp的上下游同源臂ΔED-U和ΔED-L。利用ΔED T_F（SEQ ID NO.19）、T2（SEQ ID NO.36）和T1（SEQ ID NO.36）、ΔED T_R（SEQ ID NO.20）以质粒pTKS/CS为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为1081bp和875bp的四环素上下游片段ΔED-T2和ΔED-T1。经切胶回收后利用引物ΔED U_F、T2和T1、ΔED L_R，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上游同源臂和四环素上游及下游同源臂和四环素下游的拼接产物ΔED-UT,ΔED-TL,大小分别为1470bp和1158bp。将以上两个片段经切胶回收后利用引物ΔED U_F（SEQ ID NO.17）、ΔED L_R（SEQ ID NO.22），同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到大小为2050bp上下游同源臂和四环素PCR敲除片段ΔED-tet。

将质粒pTKRED转入E.coli RF02S菌株中并制作成电转感受态；将片段ΔED-tet转入本步骤获得的电转感受态，用四环素筛选阳性克隆,并用菌落PCR验证(见图6)。四环素抗性基因通过诱导归巢核酸内切酶I-sceI的表达将其删掉,并用菌落PCR验证(见图6)，从而得到RF03S菌株。

实施例5：ribF基因上游+14到-96之间的序列的置换

利用PribF U_F（SEQ ID NO.23）、PribF U_R（SEQ ID NO.24）和PribF L_F（SEQ ID NO.27，含有由SEQ ID NO.42所示的序列）、PribF L_R（SEQ ID NO.28）两对引物，以E.coli MG1655的基因组为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为421bp和331bp的上下游同源臂PribF-U和PribF-L。利用PribF T_F（SEQ ID NO.25）、T2（SEQ ID NO.36）和T1（SEQ ID NO.35）、PribF T_R（SEQ ID NO.26）以质粒pTKS/CS为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为1081bp和875bp的四环素上下游片段PribF-T2和PribF-T1。经切胶回收后利用引物PribF U_F、T2和T1、PribF L_R，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上游同源臂和四环素上游及下游同源臂和四环素下游的拼接产物PribF-UT,PribF-TL,大小分别为1470bp和1158bp。以上两个片段经切胶回收后利用引物PribF U_F（SEQ ID NO.23）、PribF L_R（SEQ ID NO.28），同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到大小为2050bp上下游同源臂、四环素和含有由SEQ ID NO.42所示的J23115序列的PCR敲除片段PribF-tet。

将质粒pTKRED转入E.coli RF03S菌株中并制作成电转感受态；将上述步骤获得的片段PribF-tet转入本步骤获得的电转感受态，用四环素筛选阳性克隆,并用菌落PCR验证。四环素抗性基因通过诱导归巢核酸内切酶I-sceI的表达将其删掉,并用菌落PCR验证，从而得到代谢工程菌株RF04S菌株，RF04S菌株中含由SEQ ID NO.43所示的ribF基因及改造后的上游序列。

实施例6：将Ptrc强启动子插入到实施例5所获菌株的基因组中acs基因上游55bp位点上

利用Pacs U_F（SEQ ID NO.29）、Pacs U_R（SEQ ID NO.30）和Pacs L_F（SEQ ID NO.33，含有强启动子Ptrc）、Pacs L_R（SEQ ID NO.34）两对引物，以E.coli MG1655为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为328bp和303bp的上下游同源臂Pacs-U和Pacs-L。利用Pacs T_F（SEQ ID NO.31）、T2（SEQ ID NO.36）和T1（SEQ ID NO.35）、Pacs T_R（SEQ ID NO.32）以质粒pTKS/CS为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为1087bp和880bp的四环素上下游片段Pacs-T2和Pacs-T1。经切胶回收后利用引物Pacs U_F、T2和T1、Pacs L_R，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上游同源臂和四环素上游及下游同源臂和四环素下游的拼接产物Pacs-UT,Pacs-TL,大小分别为1383bp和1151bp。将以上两个片段经切胶回收后利用引物Pacs U_F（SEQ ID NO.29）、Pacs L_R（SEQ ID NO.34），同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到大小为1956bp上下游同源臂、四环素和含有强启动子Ptrc的PCR敲除片段Pacs-tet。

将质粒pTKRED转入E.coli RF04S菌株中并制作成电转感受态；将上述步骤获得的片段Pacs-tet转入本步骤获得的电转感受态，用四环素筛选阳性克隆,并用菌落PCR验证。四环素抗性基因通过诱导归巢核酸内切酶I-sceI的表达将其删掉,并用菌落PCR验证，获得基因型为E.coli MG1655,ΔpgiΔedaΔedd P_J23115-ribF P_trc-acs；P_trc-RBS1-ribA-RBS2-ribB-RBS3-ribD-RBS4-ribE-RBS5-ribC,amp，并命名为E.coli RF05S的工程菌株。

本发明中的菌株代号如RF01S～RF05S等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。

实施例7：利用构建的RF05S菌株进行核黄素分批摇瓶发酵

为了测试本发明构建的菌株利用葡萄糖生产核黄素的能力，本发明还提供了一种分批发酵方式用于在好氧条件下生产核黄素。

发酵条件为：将RF05S菌株和对照菌株E.coli MG1655分别在含10g/L葡萄糖的LB培养基中（500mL锥形瓶装液量100mL，摇床转速250rpm）31℃培养48h，RF05S菌能够积累1120.92mg/L核黄素，核黄素的得率为118.62mg/g-葡萄糖，检测不到副产物乙酸的积累。对照菌株E.coli MG1655只检测到6mg/L核黄素。

接种方式为：首先在LB固体平板上活化菌株，在31℃过夜培养后，挑单菌落接种装有5mL LB培养基的试管，培养12小时，接种到100mL LB培养基，初始OD为0.05，待OD长到0.4～0.8，加入终浓度为10g/L的葡萄糖及2mM IPTG进行诱导。

LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L的NaCl，调节pH至7.0，0.1Mpa压力下灭菌20min。

从摇瓶发酵结果可以看出，本发明所构建的生产核黄素的大肠杆菌菌株能够达到较高的核黄素生产得率，具有很好的应用前景。

一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。