专利摘要

一种单细胞微生物发酵系统及其发酵方法，本发明属于生物发酵设备及方法，解决现有装置发酵过程中pH值不易控制的问题，并解决现有发酵方法每轮发酵种子扩培次数过多、导致花费时间过长及成本过高的问题。本发明的发酵系统，包括发酵罐装置和N级种子罐装置，发酵罐装置包括培养罐、中和剂储罐、循环泵和可编程逻辑控制器，各级种子罐装置的组成、结构均与发酵罐装置相同，仅尺寸有区别。本发明的发酵方法，包括预装、种子扩培、种子暂存、发酵、第N级种复培和循环步骤。采用本发明，缩短了种子扩培时间，降低了染菌风险，较大地节省了发酵生产的时间与成本，而且提高了中和剂加入精度，避免管道结垢堵塞，使pH值更易控制，提高了发酵生产水平。

权利要求

1.一种单细胞微生物发酵系统，包括发酵罐装置(100)和N级种子罐装置(200)，N≥2，其特征在于：

所述发酵罐装置(100)包括培养罐(110)、中和剂储罐(120)、循环泵(130)和可编程逻辑控制器(140)；所述培养罐(110)包括罐体(111)、多个搅拌器(117)和多个中和剂分布器(118)，所述罐体(111)具有温度调节结构，用于调节罐体(111)的温度；所述多个搅拌器(117)在罐体(110)内部沿罐体中轴线分布，多个中和剂分布器(118)在罐体(111)内部沿罐体中轴线分布，且与所述多个搅拌器(117)交叉间隔排列，所述中和剂分布器(118)为由不锈钢管构成的闭合圆圈，圆圈底面具有均匀分布的小孔，各中和剂分布器的圆圈所在平面与罐体中轴线垂直；

罐体(111)顶部具有接种口(111A)以及进气管(112)、出气管(113)、进料管(114)，并装有呼吸器(115)，罐体(111)底部具有排料管(116)，排料管(116)上接有排料阀(119)，罐体(111)的侧壁插入pH电极(141)；所述中和剂储罐(120)底部通过管道与循环泵(130)进口连接，循环泵(130)出口通过管道分别连接控制阀门(131)一端和中和剂送料管(132)，中和剂送料管(132)连通所述中和剂储罐(120)的顶部；所述pH电极(141)通过导线连接可编程逻辑控制器(140)的输入端，可编程逻辑控制器(140)的输出端通过导线连接控制阀门(131)的控制端，所述控制阀门(131)另一端通过管道分别连接多个中和剂分布器(118)；

所述各级种子罐装置(200)的组成、结构均与发酵罐装置(100)相同，仅尺寸有区别；

各级种子罐装置的排料阀出口通过管道分别连接移种泵(310)和排污阀(330)，移种泵(310)通过管道连接下一级种子罐装置的培养罐罐体顶部的接种口；第N－1级种子罐装置的培养罐罐体顶部具有回送口(111B)，第N级种子罐装置的排料阀出口通过管道分别连接移种泵(310)、回送泵(320)和排污阀(330)，移种泵(310)通过管道连接所述发酵罐装置(100)的培养罐罐体顶部的接种口，回送泵(320)通过管道连接第N－1级种子罐装置的培养罐罐体顶部的回送口(111B)；

进行发酵生产时，第N－1级种子罐装置的培养罐作为暂存罐。

2.如权利要求1所述的单细胞微生物发酵系统，其特征在于：

所述罐体(111)的温度调节结构为沿罐体的内壁均匀分布有温控列管或者罐体的侧壁具有环绕的空心夹层，温控列管和空心夹层用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温；

构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为相应罐体(110)直径的1/4～3/4，不锈钢管的内径为0.5cm～30cm。

3.如权利要求1或2所述的单细胞微生物发酵系统，其特征在于：

所述发酵罐装置(100)以及N级种子罐装置(200)各自的中和剂储罐各为2个，2个中和剂储罐并联，分别用于储备酸性中和剂和碱性中和剂。

4.权利要求1所述单细胞微生物发酵系统的发酵方法，其特征在于,包括下述步骤：

A.预装步骤：系统启动前，在发酵罐装置(100)、各级种子罐装置(200)的中和剂储罐中准备好所需浓度的中和剂备用，并对各中和剂送料管灭菌；在第一级种子罐装置(200)的培养罐罐体内装入新鲜培养基并灭菌；进行步骤B；

B.种子扩培步骤：在摇瓶内完成种子培养，将种子移种到第一级种子罐装置(200)的培养罐罐体内；待第一级种子罐装置(200)的培养罐罐体内的种子培养至达到移种条件，启动其对应的移种泵，将所有的种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第二级种子罐装置(200)的培养罐罐体内并培养；待第二级种子罐装置(200)的培养罐罐体内的种子培养至达到移种条件，启动其对应的移种泵，将所有的种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第三级种子罐装置(200)的培养罐罐体内并培养；同上操作，直至第N级种子罐装置进行种子培养，培养至达到移种条件；进行步骤C；

C.种子暂存步骤：启动第N级种子罐装置(200)对应的移种泵，将80～90％的种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的发酵罐装置(100)的培养罐罐体内接种进行发酵生产，将第N级种子罐内剩余10～20％的种子液通过回送泵泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：调整培养条件进行发酵，待发酵罐装置(100)的培养罐罐体内发酵完成后，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；

E.第N级种子复培步骤：在进行步骤D的同时，将第N级种子罐装置(200)的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第N级种子罐装置(200)的培养罐罐体内接种，进行第N级种子的重复培养，并将其培养至达到移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C，不断循环，直至停止生产。

5.如权利要求4所述单细胞微生物发酵系统的发酵方法，其特征在于：

自所述步骤B开始，启动发酵罐装置和N级种子罐装置各自的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，随着发酵进行，发酵液的pH值改变，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值参数，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，以中和不断产生的有机酸或碱性物质，实现发酵液pH值调节至设定参数。

6.如权利要求4或5所述单细胞微生物发酵系统的发酵方法，其特征在于：

所述中和剂为氢氧化钙、氢氧化钠、氨水、液氨、碳酸钠、盐酸、硫酸和硝酸中的一种或两种。

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵设备及方法，具体涉及一种单细胞微生物发酵系统及其发酵方法。

背景技术

包括各种饲料、食品添加剂以及原料药在内的许多重要产品，主要通过发酵生产获得。其中很多单细胞微生物，如细菌、酵母等被用作生产菌，一般不需要借助孢子传代，其发酵周期较短，放罐频率较高，需高频率地扩培种子，工作量较大；另一方面，随着发酵技术的发展，发酵罐体积逐渐扩大到200m³～500m³，种子罐的级数也逐渐增多，从摇瓶开始，最终到大型发酵罐,种子扩培需要3～4级。种子罐级数越多，不仅成本高，种子扩培时间长，而且操作复杂，不可控因素多，染菌风险大，发酵生产容易出现较大波动。以200m³发酵罐为例，每批发酵生产需经过：摇瓶、50～100L种子罐、1～3m³种子罐、6～10m³种子罐、30～60m³种子罐，最终接种到200m³发酵罐，经过四级种子扩培，工艺流程较长。在发酵生产上，也有人采取“留种”措施来改进以上缺点，即在发酵生产末期，待发酵液排出90％后，将剩余10％左右的发酵液留在发酵罐内作为下一批次发酵生产的种子液。这样虽然能缩短种子培养周期，降低种子扩培成本，但也有明显的不足之处：一是每次放罐的发酵液体积比正常减少10％，收率下降，平摊下来每罐生产成本增加；二是发酵液内菌体在发酵末期活力下降，若再次利用为新种子则可能影响到下一批发酵水平；三是发酵液直接留在发酵罐中，则发酵罐及其培养基无法灭菌，发酵生产有染菌的风险。另外还存在一个问题是，在绝大多数发酵生产过程中，微生物会分泌出有机酸或碱性代谢物，导致发酵液pH值呈现波动，发酵生产过程中需不断补充中和剂，以维持合适的发酵酸碱度环境。以乳酸发酵生产为例，目前多数厂家采用氢氧化钙作为中和剂，而氢氧化钙有两种添加方式，一种是以液体形式流加，另一种是以固体粉末形式加入。以液体形式加入存在氢氧化钙容易结垢、堵塞管道的问题；而以固体粉末形式加入会导致pH值控制的延迟和不均匀，pH值不易控制。

发明内容

本发明提供一种单细胞微生物发酵系统，同时提供其发酵方法，解决现有装置发酵过程中pH值不易控制的问题，并解决现有发酵方法每轮发酵种子扩培次数过多、导致花费时间过长及成本过高的问题；以减少种子培养级数和周期、优化中和剂添加方式，降低种子扩培成本、提高发酵生产效率。

本发明所提供的一种单细胞微生物发酵系统，包括发酵罐装置和N级种子罐装置，N≥2，其特征在于：

所述发酵罐装置包括培养罐、中和剂储罐、循环泵和可编程逻辑控制器(PLC)；所述培养罐包括罐体、多个搅拌器和多个中和剂分布器，所述罐体具有温度调节结构，用于调节罐体的温度；所述多个搅拌器在罐体内部沿罐体中轴线分布，多个中和剂分布器在罐体内部沿罐体中轴线分布，且与所述多个搅拌器交叉间隔排列，所述中和剂分布器为由不锈钢管构成的闭合圆圈，圆圈底面具有均匀分布的小孔，各中和剂分布器的圆圈所在平面与罐体中轴线垂直；

罐体顶部具有接种口以及进气管、出气管、进料管，并装有呼吸器，罐体底部具有排料管，排料管上接有排料阀，罐体的侧壁插入pH电极；所述中和剂储罐底部通过管道与循环泵进口连接，循环泵出口通过管道分别连接控制阀门一端和中和剂送料管，中和剂送料管连通所述中和剂储罐的顶部；所述pH电极通过导线连接可编程逻辑控制器(PLC)的输入端，可编程逻辑控制器(PLC)的输出端通过导线连接控制阀门的控制端，所述控制阀门另一端通过管道分别连接多个中和剂分布器；

所述各级种子罐装置的组成、结构均与发酵罐装置相同，仅尺寸有区别；

各级种子罐装置的排料阀出口通过管道分别连接移种泵和排污阀，移种泵310通过管道连接下一级种子罐装置的培养罐罐体顶部的接种口；第N－1级种子罐装置的培养罐罐体顶部具有回送口，第N级种子罐装置的排料阀出口通过管道分别连接移种泵、回送泵和排污阀，移种泵通过管道连接所述发酵罐装置的培养罐罐体顶部的接种口，回送泵通过管道连接第N－1级种子罐装置的培养罐罐体顶部的回送口；

进行发酵生产时，第N－1级种子罐装置的培养罐作为暂存罐。

所述的单细胞微生物发酵系统，其特征在于：

所述罐体的温度调节结构为沿罐体的内壁均匀分布有温控列管或者罐体的侧壁具有环绕的空心夹层，温控列管和空心夹层用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温；

构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为相应罐体直径的1/4～3/4，不锈钢管的内径为0.5cm～30cm。

所述的单细胞微生物发酵系统，其特征在于：

所述发酵罐装置以及N级种子罐装置各自的中和剂储罐各为2个，2个中和剂储罐并联，分别用于储备酸性中和剂和碱性中和剂。

所述单细胞微生物发酵系统的发酵方法，其特征在于,包括下述步骤：

A.预装步骤：系统启动前，在发酵罐装置、各级种子罐装置的中和剂储罐中准备好所需浓度的中和剂备用，并对各中和剂送料管灭菌；在第一级种子罐装置的培养罐罐体内装入新鲜培养基并灭菌；进行步骤B；

B.种子扩培步骤：在摇瓶内完成种子培养，将种子移种到第一级种子罐装置的培养罐罐体内；待第一级种子罐装置的培养罐罐体内的种子培养至达到移种条件，启动其对应的移种泵，将所有的种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第二级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；待第二级种子罐装置的培养罐罐体内的种子培养至达到移种条件，启动其对应的移种泵，将所有的种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第三级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同上操作，直至第N级种子罐装置进行种子培养，培养至达到移种条件；进行步骤C；

C.种子暂存步骤：启动第N级种子罐装置对应的移种泵，将80～90％的种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的发酵罐装置的培养罐罐体内接种进行发酵生产，将第N级种子罐内剩余10～20％的种子液通过回送泵泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：调整培养条件进行发酵，待发酵罐装置的培养罐罐体内发酵完成后，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；

E.第N级种子复培步骤：在进行步骤D的同时，将第N级种子罐装置的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第N级种子罐装置的培养罐罐体内接种，进行第N级种子的重复培养，并将其培养至达到移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C，不断循环，直至停止生产。

所述单细胞微生物发酵系统的发酵方法，其特征在于：

自所述步骤B开始，启动发酵罐装置和N级种子罐装置各自的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，随着发酵进行，发酵液的pH值改变，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值参数，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，以中和不断产生的有机酸或碱性物质，实现发酵液pH值调节至设定参数。

所述中和剂可以为氢氧化钙、氢氧化钠、氨水、液氨、碳酸钠、盐酸、硫酸和硝酸中的一种或两种。

为控制发酵生产的酸碱度环境，现有工艺一般直接加入氢氧化钙液体或粉末等中和剂，或者设备上没有配套的中和剂分布器，直接以一根管道通入发酵罐，中和剂加入量不均匀，导致pH值波动较大、发酵液局部环境过酸或过碱，影响发酵单位，甚至造成中途停产事故。本发明所提供的单细胞微生物发酵系统，在发酵罐装置和N级种子罐装置中分别均设置了中和剂循环流动系统，可以避免氢氧化钙等中和剂转化为碳酸钙而在管道中结垢堵塞管道；同时于培养罐内设置了多个中和剂分布器，可将中和剂随时均匀送入罐内各个部位，提高了中和剂加入精度，使各级种子罐装置以及发酵罐装置罐体内pH值更易控制，避免了局部中和剂加入过量，整体pH值控制不均的问题，从而提高了发酵生产水平。

现有各种饲料、食品添加剂以及原料药发酵生产大多通过大规模生产来增加产量和降低生产成本，然而现有工艺的种子均从摇瓶到种子罐逐级扩培，发酵罐体积越大，种子扩培级数也越多，工艺复杂，成本依旧较高；同时种子扩培级数越多，扩培过程中发生染菌的机会也越大，易造成扩培失败，产生浪费。

采用本发明的发酵方法进行发酵生产时，将第N－1级种子罐装置的培养罐作为暂存罐，在第N级种子移种时保留部分第N级种子并将其移回暂存罐；待第N级种子罐装置清洗、消毒以及加入新鲜培养基并灭菌后，再将暂存罐内的第N级种子移回第N级种子罐装置内培养；以此方法省去前N-1级种子培养，缩短了种子扩培的时间，降低了扩培过程中发生染菌的风险，避免了染菌导致的浪费，最终较大节省了整个发酵生产的时间与成本。

由于所采用的单细胞微生物发酵系统，在发酵罐装置和N级种子罐装置中分别均设置了中和剂循环流动系统，提高了中和剂加入精度，使各级种子罐装置以及发酵罐装置罐体内pH值更易控制，避免了局部中和剂加入过量，整体pH值控制不均的问题，从而提高了发酵生产水平。

附图说明

图1为本发明系统结构示意图；

图2为发酵罐装置结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进一步说明。

如图1、图2、所示，本发明所提供的一种单细胞微生物发酵系统，包括发酵罐装置100和N级种子罐装置200，N≥2；

所述发酵罐装置100包括培养罐110、中和剂储罐120、循环泵130和可编程逻辑控制器(PLC)140；所述培养罐110包括罐体111、多个搅拌器117和多个中和剂分布器118，所述罐体111具有温度调节结构，用于调节罐体111的温度；所述多个搅拌器117在罐体110内部沿罐体中轴线分布，多个中和剂分布器118在罐体111内部沿罐体中轴线分布，且与所述多个搅拌器117交叉间隔排列，所述中和剂分布器118为由不锈钢管构成的闭合圆圈，圆圈底面具有均匀分布的小孔，各中和剂分布器的圆圈所在平面与罐体中轴线垂直；

罐体111顶部具有接种口111A以及进气管112、出气管113、进料管114，并装有呼吸器115，罐体111底部具有排料管116，排料管116上接有排料阀119，罐体111的侧壁插入pH电极141；所述中和剂储罐120底部通过管道与循环泵130进口连接，循环泵130出口通过管道分别连接控制阀门131一端和中和剂送料管132，中和剂送料管132连通所述中和剂储罐120的顶部；所述pH电极141通过导线连接可编程逻辑控制器(PLC)140的输入端，可编程逻辑控制器(PLC)140的输出端通过导线连接控制阀门131的控制端，所述控制阀门131另一端通过管道分别连接多个中和剂分布器118；

所述各级种子罐装置200的组成、结构均与发酵罐装置100相同，仅尺寸有区别；

各级种子罐装置的排料阀出口通过管道分别连接移种泵310和排污阀330，移种泵310通过管道连接下一级种子罐装置的培养罐罐体顶部的接种口；第N－1级种子罐装置的培养罐罐体顶部具有回送口111B，第N级种子罐装置的排料阀出口通过管道分别连接移种泵310、回送泵320和排污阀330，移种泵310通过管道连接所述发酵罐装置100的培养罐罐体顶部的接种口，回送泵320通过管道连接第N－1级种子罐装置的培养罐罐体顶部的回送口111B；

进行发酵生产时，第N－1级种子罐装置的培养罐作为暂存罐。

实施例1，单细胞微生物发酵系统，包括发酵罐装置100和四级种子罐装置200，发酵罐装置100和四级种子罐装置200，各自的中和剂储罐均为1个；

发酵罐装置的培养罐直径为4.5m，容积为200m³，罐体111的内壁均匀分布有温控列管，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器115为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体111内的搅拌器和中和剂分布器各有4个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为1.125m、为相应罐体直径的1/4，不锈钢管的内径为30cm；

第一级种子罐装置的培养罐容积为30L，直径为0.3m，罐体的侧壁具有环绕的空心夹层，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体内的搅拌器和中和剂分布器各有3个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为0.075m、为相应罐体直径的1/4，不锈钢管的内径为0.5cm；

第二级种子罐装置的培养罐容积为500L，直径为0.8m，所述罐体的侧壁具有环绕的空心夹层，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体内的搅拌器和中和剂分布器各有3个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为0.2m、为相应罐体直径的1/4，不锈钢管的内径为2cm；

第三级种子罐装置的培养罐容积为3m³，直径为1.1m，所述罐体的内壁均匀分布有温控列管，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体内的搅拌器和中和剂分布器各有4个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为0.275m、为相应罐体直径的1/4，不锈钢管的内径为10cm；

第四级种子罐装置的培养罐容积为30m³，直径为2.4m，所述罐体的内壁均匀分布有温控列管，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体内的搅拌器和中和剂分布器各有4个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为0.6m、为相应罐体直径的1/4，不锈钢管的内径为20cm。

实施例2，单细胞微生物发酵系统，包括发酵罐装置100和三级种子罐装置200，发酵罐装置100和三级种子罐装置200各自的中和剂储罐均为2个，

发酵罐装置的培养罐容积为300m³，直径为5.8m，所述罐体111的内壁均匀分布有温控列管，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器115为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体111内的搅拌器和中和剂分布器各有4个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为4.35m、为相应罐体直径的3/4，不锈钢管的内径为30cm；

第一级种子罐装置的培养罐容积为8L，直径为0.2m，所述罐体的侧壁具有环绕的空心夹层，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体内的搅拌器和中和剂分布器各有3个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为0.15m、为相应罐体直径的3/4，不锈钢管的内径为0.5cm；

第二级种子罐装置的培养罐容积为2m³，直径为1.1m，所述罐体的侧壁具有环绕的空心夹层，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体内的搅拌器和中和剂分布器各有4个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为0.825m、为相应罐体直径的3/4，不锈钢管的内径为10cm；

第三级种子罐装置的培养罐容积为60m³，直径为3.5m，所述罐体的内壁均匀分布有温控列管，用于通入热介质或冷介质，对罐体升温或降温，呼吸器为0.2μm的微孔过滤器；所述罐体内的搅拌器和中和剂分布器各有4个，构成所述中和剂分布器的闭合圆圈直径为2.625m、为相应罐体直径的3/4，不锈钢管的内径为20cm。

实施例3，利用实施例1的系统，采用乳酸细菌进行乳酸发酵生产的发酵方法，包括下述步骤：

A.预装步骤：系统启动前，在发酵罐装置100、各级种子罐装置200的中和剂储罐中准备好50％氢氧化钙乳液备用，并对各中和剂送料管灭菌；在第一级种子罐装置200的培养罐罐体内装入新鲜培养基并灭菌；进行步骤B；

B.种子扩培步骤：采用耐高温厌氧乳酸细菌(干酪乳酸杆菌LactobacilluscaseiB9232)在摇瓶内进行1.6L种子培养，15小时左右到达到对数期，完成种子培养，将种子移种到第一级种子罐装置的培养罐罐体内；

打开第一级种子罐装置对应的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值6.50，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，实现发酵液pH值稳定在6.40～6.60之间；

待第一级种子罐装置的培养罐罐体内的种子培养至对数期，启动其对应的移种泵，将16L的第一级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第二级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同样控制第二级种子罐罐体内种子的pH值稳定在6.40～6.60之间；待第二级种子罐装置200的培养罐罐体内的第二级种子培养至对数期，启动其对应的移种泵，将160L的第二级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第三级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同样控制第三级种子罐罐体内种子的pH值稳定在6.40～6.60之间；待第三级种子罐装置的培养罐罐体内的第三级种子培养至对数期，启动其对应的移种泵，将1600L的第三级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第四级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同样控制第四级种子罐罐体内种子的pH值稳定在6.40～6.60之间；直至第四级种子罐装置的培养罐罐体内的第四级种培养至对数期；进行步骤C；

C.种子暂存步骤：启动第四级种子罐装置对应的移种泵，将15000L的第四级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的发酵罐装置的培养罐罐体内接种进行发酵生产，将第四级种子罐内剩余500L的第四级种子液通过回送泵泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐(即第三级种子罐)内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：打开发酵罐装置对应的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值6.50，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，实现发酵液pH值稳定在6.40～6.60之间；调整温度以及搅拌转速等培养条件进行乳酸发酵，待发酵罐装置的培养罐罐体内发酵完成后，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；本轮乳酸发酵生产检测结果，放罐发酵液中的乳酸含量为175g/L，记录发酵周期112小时，其中，发酵周期为所有种子培养时间与发酵生产时间的总和；

E.第四级种子复培步骤：在进行步骤D的同时，将第四级种子罐装置的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第四级种子罐装置的培养罐罐体内接种，进行第四级种子的第二次培养，并将其培养至达到移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C；以下，对步骤C的第二次循环进行说明：

C.种子暂存步骤：(第二次)启动第四级种子罐装置对应的移种泵，将15000L的第四级种子液第二次泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的发酵罐装置的培养罐罐体内接种进行第二轮发酵生产，将第四级种子罐内剩余500L的第四级种子液通过回送泵第二次泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐(即第三级种子罐)内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：(第二次)调整培养条件进行乳酸发酵，待发酵罐装置的培养罐罐体内发酵完成后，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；第二轮乳酸发酵生产检测结果，放罐发酵液中的乳酸含量为178g/L，与第一轮含量接近，发酵周期52小时，比第一轮节省60小时，且节省了摇瓶种子与前三级种子的培养成本；

E.第四级种子复培步骤：在进行步骤D的同时，将第四级种子罐装置的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第四级种子罐装置的培养罐罐体内接种，进行第四级种子的第三次培养，并将其培养至达到移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C；如此不断循环，直至停止生产；并且之后每轮乳酸发酵生产相对第一轮均可节省时间60小时左右，缩短了发酵周期，并且节省了总发酵成本，大大提高了企业在乳酸行业的竞争力。

实施例4，利用实施例2的系统，采用酵母菌进行发酵生产活性酵母菌丝体的发酵方法，包括下述步骤：

A.预装步骤：系统启动前，在发酵罐装置100、各级种子罐装置200的两个并联中和剂储罐中分别准备好30％的硫酸和30％的碳酸钠溶液备用，并对各中和剂送料管灭菌；在第一级种子罐装置200的培养罐罐体内装入新鲜培养基并灭菌；进行步骤B；

B.种子扩培步骤：采用无糖酵母菌株(面包酵母SaccharomycescerevisiaeCICC1525)在摇瓶内进行400mL种子培养，48小时左右达移种条件，完成摇瓶种子培养，将种子移种到第一级种子罐装置的培养罐罐体内；

打开第一级种子罐装置对应的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值4.30，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，实现发酵液pH值稳定在4.25～4.35之间；

待第一级种子罐装置的培养罐罐体内的级种培养至24小时达到移种条件，启动其对应的移种泵，将4.8L的第一级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第二级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同样控制第二级种子罐罐体内种子的pH值稳定在4.25～4.35之间；待第二级种子罐装置的培养罐罐体内的第二级种培养15小时达到移种条件，启动其对应的移种泵，将1200L的第二级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第三级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同上控制第三级种子罐罐体内种子的pH值稳定在4.25～4.35之间；进行第三级种子罐装置的培养罐罐体内第三级种培养，采用流加糖蜜的方式补料培养15小时达到移种条件；进行步骤C；

C.种子暂存步骤：启动第三级种子罐装置对应的移种泵，将35800L的第三级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌发酵罐装置的培养罐罐体内接种进行发酵生产，将第三级种子罐内剩余200L的第三级种子液通过回送泵泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐(即第二级种子罐)内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：打开发酵罐装置对应的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值4.30，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，实现发酵液pH值稳定在4.25～4.35之间；采用流加糖蜜的方式补料培养，调整温度以及搅拌转速等培养条件进行生产活性酵母菌丝体的发酵，约20小时左右，发酵结果达到预定指标，结束发酵并放罐，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；本轮发酵生产检测结果，放罐发酵液湿重达到200g/L，酵母的发酵活力达到预定指标650，记录发酵周期122小时，其中，发酵周期为所有种子培养时间与发酵生产时间的总和；

E.第四级种复培步骤：在进行步骤D的同时，将第三级种子罐装置的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第三级种子罐装置的培养罐罐体内接种，进行第三级种子的第二次培养，控制培养条件使第三级种子22小时到达移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C；以下对步骤C的第二次循环进行说明：

C.种子暂存步骤：(第二次)启动第三级种子罐装置对应的移种泵，将35800L的第三级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌发酵罐装置的培养罐罐体内接种进行发酵生产，将第三级种子罐内剩余200L的第三级种子液通过回送泵泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐(也即第二级种子罐)内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：(第二次)调整培养条件进行生产活性酵母菌丝体的发酵，待发酵罐装置的培养罐罐体内发酵完成后，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；本轮发酵生产检测结果，放罐发酵液湿重达到205g/L，发酵活力达到预定指标655，发酵液湿重与酵母的发酵活力与第一轮结果接近，记录发酵周期45小时，比第一轮节省53小时，且节省了摇瓶种子与前二级种子的培养成本；

E.第四级种子复培步骤：在进行步骤D的同时，将第三级种子罐装置的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第三级种子罐装置的培养罐罐体内接种，进行第三级种子的第三次培养，控制培养条件使第三级种子22小时到达移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C；如此不断循环，直至停止生产；并且之后每轮生产活性酵母菌丝体的发酵生产相对第一轮均可节省时间50小时左右，缩短了发酵周期，并且节省了总发酵成本，大大提高了企业在活性酵母生产行业的竞争力。

实施例5，利用实施例1的系统，区别仅在于其中的中和剂储罐为压力容器，采用枯草芽孢杆菌进行核黄素发酵生产的发酵方法，包括下述步骤：

A.预装步骤：系统启动前，在发酵罐装置100、各级种子罐装置200的中和剂储罐中准备好液氨备用，并对各中和剂送料管灭菌；在第一级种子罐装置200的培养罐罐体内装入新鲜培养基并灭菌；进行步骤B；

B.种子扩培步骤：采用核黄素生产细菌(枯草芽孢杆菌Bacillussubtiliscjkb0001)在摇瓶内进行1.6L种子培养，15小时左右到达到对数期，完成种子培养，将种子移种到第一级种子罐装置的培养罐罐体内；

打开第一级种子罐装置对应的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值6.50，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，实现发酵液pH值稳定在6.45～6.55之间；

待第一级种子罐装置的培养罐罐体内的种子培养至对数期，启动其对应的移种泵，将16L的第一级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第二级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同样控制第二级种子罐罐体内种子的pH值稳定在6.45～6.55之间；待第二级种子罐装置200的培养罐罐体内的第二级种子培养至对数期，启动其对应的移种泵，将160L的第二级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第三级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同样控制第三级种子罐罐体内种子的pH值稳定在6.45～6.55之间；待第三级种子罐装置的培养罐罐体内的第三级种子培养至对数期，启动其对应的移种泵，将1600L的第三级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的第四级种子罐装置的培养罐罐体内并培养；同样控制第四级种子罐罐体内种子的pH值稳定在6.45～6.55之间；直至第四级种子罐装置的培养罐罐体内的第四级种培养至对数期；进行步骤C；

C.种子暂存步骤：启动第四级种子罐装置对应的移种泵，将15000L的第四级种子液泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的发酵罐装置的培养罐罐体内接种进行发酵生产，将第四级种子罐内剩余500L的第四级种子液通过回送泵泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐(即第三级种子罐)内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：打开发酵罐装置对应的循环泵，使中和剂在管道内循环流动，通过pH电极、可编程逻辑控制器及控制阀门组成的自控系统，根据设定的pH值6.50，自控阀自动开启或关闭，向培养罐中泵入中和剂，实现发酵液pH值稳定在6.45～6.55之间；调整温度以及搅拌转速等培养条件进行核黄素发酵，待发酵罐装置的培养罐罐体内发酵完成后，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；本轮核黄素发酵生产检测结果，放罐发酵液中的核黄素含量为15g/L，记录发酵周期117小时，其中，发酵周期为所有种子培养时间与发酵生产时间的总和；

E.第四级种子复培步骤：在进行步骤D的同时，将第四级种子罐装置的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第四级种子罐装置的培养罐罐体内接种，进行第四级种子的第二次培养，并将其培养至达到移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C；以下，对步骤C的第二次循环进行说明：

C.种子暂存步骤：(第二次)启动第四级种子罐装置对应的移种泵，将15000L的第四级种子液第二次泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的发酵罐装置的培养罐罐体内接种进行第二轮发酵生产，将第四级种子罐内剩余500L的第四级种子液通过回送泵第二次泵入已清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌的暂存罐(即第三级种子罐)内培养；进行步骤D和进行步骤E；

D.发酵步骤：(第二次)调整培养条件进行核黄素发酵，待发酵罐装置的培养罐罐体内发酵完成后，排出发酵液，提取发酵产物；对培养罐罐体清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌；第二轮核黄素发酵生产检测结果，放罐发酵液中的核黄素含量为15.5g/L，与第一轮含量接近，发酵周期56小时，比第一轮节省61小时，且节省了摇瓶种子与前三级种子的培养成本；

E.第四级种子复培步骤：在进行步骤D的同时，将第四级种子罐装置的培养罐罐体排空后清洗、消毒灭菌、装入新鲜培养基并灭菌，再将暂存罐内的种子液通过其对应的移种泵泵回第四级种子罐装置的培养罐罐体内接种，进行第四级种子的第三次培养，并将其培养至达到移种条件；

F.循环步骤：待步骤D、E完成后，转步骤C；如此不断循环，直至停止生产；并且之后每轮核黄素发酵生产相对第一轮均可节省时间60小时左右，缩短了发酵周期，并且节省了总发酵成本，大大提高了企业在核黄素行业的竞争力。

一种单细胞微生物发酵系统及其方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。