专利摘要
本发明公开了一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法，构建方法为：(1)获得rib‐int段：(2)构建pLR01质粒：(3)构建EC‑rib01菌株：(4)构建EC‑Rib02菌株：敲除步骤(3)所获得的菌株EC‑Rib01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC‑Rib02。本发明的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC‑Rib02核黄素产量达到10.47g/L以上，是目前大肠杆菌生产核黄素的最高产量；本发明的EC‑Rib02菌株的生产周期为60‑80h，比现有常用的核黄素工程菌株生产周期短，节省能源。
权利要求
1.一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)获得rib-int段：
以SEQ ID No.4所示rib-F和以SEQ ID No.5所示rib-R为引物，以p20C-EC10为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.1所示rib-int片段；
(2)构建pLR 01质粒：
以SEQ ID No.6所示Cat-F和以SEQ ID No.7所示Cat-R为引物，以pCas9为模板，通过PCR扩增，得到氯霉素乙酰转移酶基因，将氯霉素乙酰转移酶基因命名为Cat基因，通过CEPC组装技术，将Cat基因和来自于pTKRed质粒上的pSC101复制子组装成质粒pRB 01；将步骤(1)获得的rib-int片段通过酶切连接的方法，连接到pRB 01质粒上面，得到质粒命名为pLR01；
(3)构建EC-rib 01菌株：
将步骤(2)获得的pLR 01质粒转入大肠杆菌E.coli MG1655，得到菌株EC-Rib 01；
(4)构建EC-Rib 02菌株：
敲除步骤(3)所获得的菌株EC-Rib 01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC-Rib 02。
2.权利要求1所述的方法构建的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02。
3.一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，其特征是包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将权利要求2所述的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划线，37℃培养10-20h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，32-37℃，180-240rpm培养10-20h，然后将所得菌液按照体积比为1％-10％的接种量接种到发酵培养基中，32-37℃，180-240rpm培养10-20h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为1％-10％的比例接种到装有2-3L发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉素，使浓度为5-40ug/L，在35-37℃，pH＝6.5-7.3，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到2g/L以下时，采用连续补料的方式补充补料培养基；补料速度为0.1-0.5ml/min，当溶氧水平降至10％以下时，增加发酵罐的压力至0.02-0.1MPa；当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵；
所述发酵培养基是以每1L计含有：葡萄糖5-30g，酵母抽提物1-15g，硫酸铵0.5-5g，硫酸镁0.05-1g，磷酸氢二钠1-10g，磷酸二氢钾1-10g，尿素1-10g，柠檬酸铁铵10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0.1mg，氯化锰0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化钴0.01-0.1mg，硫酸铜0.01-0.1mg，氯化镍0.01-0.1mg，钼酸钠0.01-0.1mg，余量为水；
所述补料培养基是以每1L计含有：葡萄糖500-800g，酵母抽提物5-20g，硫酸铵1-10g，硫酸镁0.1-5g，磷酸氢二钠2-5g，磷酸二氢钾2-15g，柠檬酸铁铵10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0.1mg，氯化锰0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化钴0.01-0.1mg，硫酸铜0.01-0.1mg，氯化镍0.01-0.1mg，钼酸钠0.01-0.1mg，余量为水。
4.权利要求2所述的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02发酵生产核黄素的用途。
说明书
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用和发酵工程领域，具体地涉及一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及发酵技术。
背景技术
核黄素，又称维生素B2，是一种黄色的天然水溶性B族维生素。其分子式为C17H20O6N4，分子量为376，是人体必需的13种维生素之一。核黄素是机体内许多酶系统的重要辅基－黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)与黄素单核甘酸(FMN)的合成的前体物质。作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用，是生命活动中不可缺少的维生素，是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质。
核黄素已经广泛用于饲料、食品和医药领域。核黄素能促进蛋白质、脂肪、碳水化合物的代谢，具有维护皮肤和粘膜的生理功能。若机体缺乏核黄素，就会影响生物氧化作用，引起物质代谢紊乱，出现一系列病症，严重时会引起死亡。它作为常用临床药物，用于辅助治疗口角炎、眼角膜炎、白内障、眼角膜及口角血管增生等多种疾病。
核黄素主要生产方法为化学半合成法和微生物发酵法，其中，半合成法生产核黄素以D‐核糖为原料，纯度较高，但得率只有60％左右，原料浪费较大，而微生物发酵法生产核黄素则具有生产工艺简单、原料廉价、对环境无污染等优点，且只需要一步，目前已成为核黄素生产的主要方法。
用于核黄素发酵生产的菌株主要有酵母和基因工程菌两大类。1940年，利用阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)发酵生产核黄素首次获得了成功，产量为500微克/毫升；1946年，利用棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)也实现了在发酵液中积累少量的核黄素；1947年，以碎麦芽或乳清为原料，丙酮丁醇梭状杆菌(Clostridium acetobutylicum)发酵法被首次应用于商业化生产核黄素。利用真菌进行核黄素生产存在着诸如发酵周期过长、原料成分配比复杂、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素的产量等缺点。随着基因工程技术的发展，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和产氨棒状杆菌(Corynebactia aminogensis)等产核黄素工程菌相继构建成功，这些工程菌具有发酵周期短(2～3天)、原料要求简单、产量高等优点，在核黄素的微生物发酵生产中显示了强大的生命力。特别是相继构建成功的Bacillus subtilis等产核黄素工程菌，最高报道在三天时间内可达到20～27g/L。
目前生产上应用的产核黄素枯草芽孢杆菌多为通过多轮理化诱变之后筛选到的，由于随机诱变引入突变点的不确定性，这些生产菌株往往具有比较复杂的遗传背景，使得通过代谢工程进一步合理改进这些工业菌株面临着较大的挑战和困难。同时，大量未知突变的存在也使得对进一步合理改进的解释和评估变得更为复杂了。另外，由于诱变的随机性，这些高产菌株在逐渐积累和目标产品高产相关的正突变的过程中也不可避免的积累了一些不利突变点以及一些与目标表型无关的突变点。同野生菌株相比，它们大都在菌体生长速度、底物利用种类、对不利环境的耐受性或遗传稳定性等方面存在缺陷。由于和这些不良性状相关的基因型通常非常复杂，通过代谢工程方法消除这些不良性状也面临着很大的困难。
大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。
经检索，目前未见有使用代谢工程同时改造大肠杆菌pfkA、edd和eda基因，并且应用发酵法生产核黄素的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株。
本发明的第二个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基。
本发明的第四个目的是提供一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的补料培养基。
本发明的第五个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵方法。
本发明的第六个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的构建方法，包括如下步骤：
(1)获得rib-int段：
以SEQ ID No.4所示rib-F和以SEQ ID No.5所示rib-R为引物，以p20C_EC10为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.1所示rib-int片段；
(2)构建pLS01质粒：
以SEQ ID No.6所示Cat-F和以SEQ ID No.7所示Cat-R为引物，以pCas9为模板，通过PCR扩增，得到氯霉素乙酰转移酶基因，将氯霉素乙酰转移酶基因命名为Cat基因，通过CEPC组装技术，将Cat基因和来自于pTKRed质粒上的pSC101复制子组装成质粒pRB 01；将步骤(1)获得的rib-int片段通过酶切连接的方法，连接到pRB 01质粒上面，得到质粒命名为pLR 01；
(3)构建EC-rib 01菌株：
将步骤(2)获得的pLR 01质粒转入大肠杆菌E.coli MG1655，得到菌株EC-Rib 01；
(4)构建EC-Rib 02菌株：
敲除步骤(3)所获得的菌株EC-Rib 01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC-Rib 02。
上述方法构建的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02。
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有：葡萄糖5-30g，酵母抽提物1-15g，硫酸铵0.5-5g，硫酸镁0.05-1g，磷酸氢二钠1-10g，磷酸二氢钾1-10g，尿素1-10g，柠檬酸铁胺10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0.1mg，氯化锰0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化钴0.01-0.1mg，硫酸铜0.01-0.1mg，氯化镍0.01-0.1mg，钼酸钠0.01-0.1mg，余量为水。
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有：葡萄糖500-800g，酵母抽提物5-20g，硫酸铵1-10g，硫酸镁0.1-5g，磷酸氢二钠2-5g，磷酸二氢钾2-15g，柠檬酸铁胺10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0.1mg，氯化锰0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化钴0.01-0.1mg，硫酸铜0.01-0.1mg，氯化镍0.01-0.1mg，钼酸钠0.01-0.1mg，余量为水。
一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划线，37℃培养10-20h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，32-37℃，180-240rpm培养10-20h，然后将所得菌液按照体积比为1％-10％的接种量接种到一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，32-37℃，180-240rpm培养10-20h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为1％-10％的比例接种到装有2-3L一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉素，使浓度为5-40ug/L，在35-37℃，pH＝6.5-7.3，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到1-2g/L以下时，采用连续补料的方式补充一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基；补料速度为0.1-0.5ml/min，当溶氧水平降至10％以下时，增加发酵罐的压力至0.02-0.1MPa；当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。
发酵参数的测定以及记录：在发酵过程中，每2-8h取一次样，分别测定发酵液中的菌体浓度，发酵液中残糖浓度以及发酵液中核黄素浓度，并记录。
一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02发酵生产核黄素的用途。
本发明的优点：
本发明的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02核黄素产量达到10.47g/L，是目前大肠杆菌生产核黄素的最高产量。
本发明的用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基和用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基利于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02核黄素的发酵，提高了核黄素的产量。
本发明的高产核黄素大肠杆菌EC-Rib 02菌株的生产周期为60-80h，比现有常用的核黄素工程菌株(枯草芽孢杆菌，酵母等生产周期普遍在100h以上)生产周期短，节省能源。
附图说明
图1为用SEQ ID No.3所示pLR 01质粒的示意图。
图2为用SEQ ID No.2所示pRB 01载体的示意图。
图3为pfkA基因敲除后，琼脂糖凝胶电泳示意图。
图4为生物反应器发酵EC-rib 02菌株，核黄素产量示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的原始菌株E.coli MG1655购自CGSC(Coli Genetic StockCenter，http://cgsc.biology.yale.edu/)。
原始质粒pTKRed和pCas9和pTKS/CS来源为Addgene(https://www.addgene.org/)。
原始质粒p20C_EC10来源于如下文章：Lin,Z.,et al.,Metabolic engineeringof Escherichia coli for the production of riboflavin.Microb Cell Fact,2014.13(1):p.104.
所用限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶等分子生物学试剂购买自thermo公司(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
所用发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司(http://www.blbio.com/)。
所用PCR仪和电转仪购自Bio-Rad(
所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)购买。
LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂0.8％-2％)余量是水。
LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L)余量是水。
实施例1
以SEQ ID No.6所示Cat-F引物和以SEQ ID No.7所示Cat-R为引物，以pCas9为模板，通过PCR扩增氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因，然后通过CEPC组装技术，将Cat基因和来自于pTKRed质粒上的pSC101复制子组装成全新的质粒pRB 01，如图2所示。
实施例2
以SEQ ID No.4所示rib-F引物和以SEQ ID No.5所示rib-R为引物，以p20C_EC10为模板，通过PCR扩增的方法得到以SEQ ID No.1所示的片段rib-int。以ScaⅠ和HindⅢ两种限制性内切酶切割pRB 01质粒，酶切产物经过纯化，和rib-int通过T4DNA连接酶，连接成新的质粒pLR 01，如图1所示。
实施例3
挑取E.coli MG1655至LB液体培养基，37℃，200rpm培养，当菌体浓度介于0.4-0.6(以600nm吸光值表示)之间时，做成感受态。然后通过电转化，将pLR 01质粒导入到E.coliMG1655，通过氯霉素筛选出阳性转化子，得到菌株命名为EC-rib 01.
实施例4
以pfkA 1F(SEQ ID No.8)和pfkA 1R(SEQ ID No.9)为引物，以MG1655基因组为模板，通过PCR反应，得到pfkA-U(SEQ ID No.16)。以pfkA 2F(SEQ ID No.10)和pfkA 2R(SEQID No.11)为引物，以pTKS/CS为模板，通过PCR反应，得到pfkA-tet-U(SEQ ID No.17)。以pfkA 3F(SEQ ID No.12)和pfkA 3R(SEQ ID No.13)为引物，以pTKS/CS为模板，通过PCR反应，得到pfkA-tet-L(SEQ ID No.18)。以pfkA 4F(SEQ ID No.14)和pfkA 4R(SEQ IDNo.15)为引物，以MG1655基因组为模板，通过PCR反应，得到pfkA-L(SEQ ID No.19)。然后将上诉PCR产物pfkA-U(SEQ ID No.16),pfkA-tet-U(SEQ ID No.17),pfkA-tet-L(SEQ IDNo.18),pfkA-L(SEQ ID No.19)通过融合PCR的方法，融合成一个片段pfkA-tet(SEQ IDNo.20)。
将pTKRed质粒通过电转化导入到大肠杆菌E.coli MG1655，然后制作成感受态，利用电转化的方法，将片段pfkA-tet(SEQ ID No.20)导入，利用四环素筛选出阳性克隆，并进行菌落PCR进行验证。验证正确的菌株通过诱导归巢核酸内切酶I-sceI的表达，将四环素抗性删除,并用菌落PCR验证，PCR结果用琼脂糖凝胶电泳来显示，核酸大小如图3所示。应用同样的方法，继续敲除eda基因和edd基因，最终获得的菌株基因型为E.coli MG1655,ΔpfkA，Δedd，Δeda命名为EC-Rib 02。
实施例5
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有：葡萄糖5g，酵母抽提物1g，硫酸铵0.5g，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钾1g，尿素1g，柠檬酸铁胺10mg，氯化钙10mg，硫酸锌0.01mg，氯化锰0.01mg，硼酸0.01mg，氯化钴0.01mg，硫酸铜0.01mg，氯化镍0.01mg，钼酸钠0.01mg，余量为水。
实施例6
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有：葡萄糖30g，酵母抽提物15g，硫酸铵5g，硫酸镁1g，磷酸氢二钠10g，磷酸二氢钾10g，尿素10g，柠檬酸铁胺100mg，氯化钙100mg，硫酸锌0.1mg，氯化锰0.1mg，硼酸0.1mg，氯化钴0.1mg，硫酸铜0.1mg，氯化镍0.1mg，钼酸钠0.1mg，余量为水。
实施例7
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵培养基，以每1L计含有：葡萄糖10g，酵母抽提物5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钾2.5g，尿素3g，柠檬酸铁胺20mg，氯化钙30mg，硫酸锌0.05mg，氯化锰0.05mg，硼酸0.04mg，氯化钴0.05mg，硫酸铜0.03mg，氯化镍0.04mg，钼酸钠0.03mg，余量为水。
实施例8
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有：葡萄糖500g，酵母抽提物5g，硫酸铵1g，硫酸镁0.1g，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸铁胺10mg，氯化钙10mg，硫酸锌0.01mg，氯化锰0.01mg，硼酸0.01mg，氯化钴0.01mg，硫酸铜0.01mg，氯化镍0.01mg，钼酸钠0.01mg，余量为水。
实施例9
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有：葡萄糖800g，酵母抽提物20g，硫酸铵10g，硫酸镁5g，磷酸氢二钠5g，磷酸二氢钾15g，柠檬酸铁胺100mg，氯化钙100mg，硫酸锌0.1mg，氯化锰0.1mg，硼酸0.1mg，氯化钴0.1mg，硫酸铜0.1mg，氯化镍0.1mg，钼酸钠0.1mg，余量为水。
实施例10
一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基，以每1L计含有：葡萄糖700g，酵母抽提物10g，硫酸铵5g，硫酸镁3g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾8g，柠檬酸铁胺40mg，氯化钙50mg，硫酸锌0.06mg，氯化锰0.07mg，硼酸0.05mg，氯化钴0.07mg，硫酸铜0.03mg，氯化镍0.03mg，钼酸钠0.05mg，余量为水。
实施例11
一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划线，37℃培养10h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，32℃，240rpm培养20h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到实施例6制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，32℃，240rpm培养10h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为10％的比例接种到装有2L实施例6制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉素，使浓度为5ug/L，在35℃，pH＝6.5，0-20h期间搅拌转速300rpm，20h以后搅拌转速调整为800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到2g/L以下时，采用连续补料的方式补充实施例8制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基；补料速度为0.1ml/min，当溶氧水平降至10％以下时，增加发酵罐的压力至0.1MPa；当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。经过77h发酵，核黄素产量达到10.60g/L。
实施例12
一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划线，37℃培养20h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，37℃，180rpm培养10h，然后将所得菌液按照体积比为10％的接种量接种到一种实施例5制备的用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，37℃，180rpm培养20h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为1％的比例接种到装有3L实施例5制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉素，使浓度为40ug/L，在37℃，pH＝7.3，0-18h期间搅拌转速300rpm，20h以后搅拌转速调整为800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到1g/L以下时，采用连续补料的方式补充实施例9制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基；补料速度为0.5ml/min，当溶氧水平降至10％以下时，增加发酵罐的压力至0.02MPa；当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。经过80h发酵，核黄素产量达到10.73g/L。
实施例13
一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划线，37℃培养15h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，35℃，200rpm培养15h，然后将所得菌液按照体积比为5％的接种量接种到实施例7制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基中，35℃，200rpm培养15h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有2.5L实施例7制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株的发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉素，使浓度为20ug/L，在36℃，pH＝6.8，0-20h期间搅拌转速300rpm，20h以后搅拌转速调整为800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到2g/L以下时，采用连续补料的方式补充实施例10制备的一种用于高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的补料培养基；补料速度为0.3ml/min，当溶氧水平降至10％以下时，增加发酵罐的压力至0.06MPa；当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。经过83h发酵，核黄素产量达到10.47g/L。发酵结果见图4。
一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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