专利摘要

本发明公开了一株产抗菌肽的海洋芽孢杆菌及其发酵方法和应用，该海洋芽孢杆菌是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的枯草芽孢杆菌M252，其对溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌均具有明显的抑制效果，保藏编号为CCTCCNO：M2020057，该枯草芽孢杆菌M252通过液体发酵和固体发酵可以制备得到固液粉三种不同使用状态的抗菌肽制品，发酵制品多元化，可应用至水产养殖、动物饲料、作物肥料等不同领域，另外，该枯草芽孢杆菌M252在发酵过程中所用到的培养基成分均来源于成本较低的原料，在保证了发酵效率的同时降低了发酵成本，更适应于工业化生产应用。

权利要求

1.一株产抗菌肽的海洋芽孢杆菌，其特征在于，该海洋芽孢杆菌是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的枯草芽孢杆菌M252，其对溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌均具有明显的抑制效果，保藏编号为CCTCC NO：M2020057，保藏日期为2020 年03月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉。

2.权利要求1所述的产抗菌肽的海洋芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌M252纯化后接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；

步骤2：将一级种子液接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、玉米浆5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、氯化钙1g/L、用净化的海水配制，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；

步骤3：将二级种子液接入固体发酵罐中，固体发酵罐中的培养基的配方为：氯化钠5g/kg、磷酸二氢钾2g/kg、硫酸铵2g/kg、余量为麸皮、米糠或豆粕、含水量控制在20-40%，控制湿度30%，35℃、8rpm培养56h，然后低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂。

3.采用权利要求2所述的发酵方法发酵得到的抗菌肽固剂的应用，其特征在于，作为饲料添加剂使用。

4.权利要求1所述的产抗菌肽的海洋芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌M252纯化后接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；

步骤2：将一级种子液接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、玉米浆5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、氯化钙1g/L、用净化的海水配制，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；

步骤3：将二级种子液接入液体发酵罐中，液体发酵罐中的培养基的配方为：氯化铵1g/L、醋酸钠3g/L、氯化镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、氯化钠1g/L、酵母膏2g/L、葡萄糖2g/L、用净化的海水配制，设置温度35℃、转速400rpm、通风量0.75vvm、DO值25%，控制发酵液pH 7-8，手动添加消泡剂，发酵56h，得发酵液，将发酵液于4℃、4000rpm离心，将所得上清液用旋转蒸发仪浓缩10倍，浓缩液通过 0.22μm 滤膜除去菌体及沉淀物，得抗菌肽液剂；

或者，将二级种子液接入固体发酵罐中，固体发酵罐中的培养基的配方为：氯化钠5g/kg、磷酸二氢钾2g/kg、硫酸铵2g/kg、余量为麸皮、米糠或豆粕、含水量控制在20-40%，控制湿度30%，35℃、8rpm培养56h，然后低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂，之后向抗菌肽固剂中按重量比10：1加入无菌净化水，180rpm浸提2h，浸提液离心浓缩、0.22μm滤膜除菌，得抗菌肽液剂。

5.采用权利要求4所述的发酵方法发酵得到的抗菌肽液剂的应用，其特征在于，作为对虾、水产鱼类养殖的功能肥料使用，直接投施至养殖池塘中。

6.权利要求1所述的产抗菌肽的海洋芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌M252纯化后接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；

步骤2：将一级种子液接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、玉米浆5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、氯化钙1g/L、用净化的海水配制，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；

步骤3：将二级种子液接入液体发酵罐中，液体发酵罐中的培养基的配方为：氯化铵1g/L、醋酸钠3g/L、氯化镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、氯化钠1g/L、酵母膏2g/L、葡萄糖2g/L、用净化的海水配制，设置温度35℃、转速400rpm、通风量0.75vvm、DO值25%，控制发酵液pH 7-8，手动添加消泡剂，发酵56h，得发酵液，将发酵液于4℃、4000rpm离心，将所得上清液用旋转蒸发仪浓缩10倍，浓缩液通过 0.22μm 滤膜除去菌体及沉淀物，得抗菌肽液剂；

或者，将二级种子液接入固体发酵罐中，固体发酵罐中的培养基的配方为：氯化钠5g/kg、磷酸二氢钾2g/kg、硫酸铵2g/kg、余量为麸皮、米糠或豆粕、含水量控制在20-40%，控制湿度30%，35℃、8rpm培养56h，然后低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂，之后向抗菌肽固剂中按重量比10：1加入无菌净化水，180rpm浸提2h，浸提液离心浓缩、0.22μm滤膜除菌，得抗菌肽液剂；

步骤4：将抗菌肽液剂的pH调至2.0，4℃静置12h，然后4℃、10000rpm离心得到沉淀，将所得沉淀用90%乙醇溶解并搅拌均匀，将溶液的pH调至7.0，室温静置3h，然后4℃、10000rpm离心得提取液，将提取液用旋转蒸发仪浓缩，之后将浓缩液冷冻干燥，即得抗菌肽粉剂。

7.采用权利要求6所述的发酵方法发酵得到的抗菌肽粉剂的应用，其特征在于，作为海参养殖的功能肥料使用，配制成溶液后投施至养殖池塘中。

说明书

技术领域

本发明涉及一株菌株及其发酵方法和应用，具体涉及一株产抗菌肽的海洋芽孢杆菌及其发酵方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

在抗击致病菌的战争中，抗生素一直是人类所掌握的最重要的武器。但随着抗生素在医疗、饲料添加剂等方面的大量使用，使得许多致病菌进化出多种机制得以在诸多抗生素中存活，抗生素耐药性也成为当今社会面临的最严峻挑战之一。耐药性和药物残留问题日益严重，影响着人类健康。因此，寻找抗生素的替代物十分紧迫。

筛选可以有效抵抗病原体的化学物质一直是生命科学领域研究的热点。抗菌肽又叫宿主防御肽，通常是由7-100个氨基酸组成的小分子多肽，是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分，也是各种生物抵御入侵病原体的第一道防线，作为一种可从自然来源中提取并用于对抗抗生素耐药细菌的潜在候选物，已引起了广泛关注。抗菌肽具有广谱抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗原虫、甚至抗肿瘤细胞等活性，另外抗菌肽还表现出了促进机体组织愈合及调节体内免疫系统等活性。

以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等为代表的大多数芽孢杆菌生长迅速、营养要求简单、抗逆性强，均可产生多肽类抗菌素以及具有溶菌作用的酶类。作为自然界中广泛存在的非致病菌，绝大多数芽孢杆菌对人畜无害且不会造成环境污染。因此，芽孢杆菌及其抗菌肽等代谢产物是控制病原菌病害最为安全有效和最具应用前景的天然生物制剂。

在现有技术中，通过陆源芽孢杆菌产抗菌肽的应用较为普遍。综合考虑生产成本与作用效果，将产抗菌肽微生物及其代谢产物直接固载制成微生物菌剂的应用越来越多。在海洋水产品养殖中应用各种抗菌肽，可以提高水产动物的生产性能、消化酶活性、抗氧化和免疫功能，但在应用微生物菌剂时则需考虑海水环境的特殊性。所以，选育一株产抗菌肽的海洋微生物，通过发酵获得抗菌肽或制备微生物菌剂并进行应用，研究开发安全无毒、无耐药性、高效的饲用抗生素替代品，是水产养殖和畜牧养殖饲料生产的关键环节，更是控制食品质量安全的源头。

发明内容

本发明的目的在于：考虑在海洋水产品养殖中海水环境的特殊性，筛选一株产抗菌肽的海洋微生物，并提供该产抗菌肽的海洋微生物的发酵方法，同时提供一种针对由上述产抗菌肽的海洋微生物发酵制成的微生物菌剂的应用方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一株产抗菌肽的海洋芽孢杆菌，其特征在于，该海洋芽孢杆菌是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的枯草芽孢杆菌M252，其对溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌均具有明显的抑制效果，保藏编号为CCTCC NO：M2020057，保藏日期为2020 年03月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉。

前述的产抗菌肽的海洋芽孢杆菌的第一种发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌M252纯化后接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；

步骤2：将一级种子液接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、玉米浆5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、氯化钙1g/L、用净化的海水配制，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；

步骤3：将二级种子液接入固体发酵罐中，固体发酵罐中的培养基的配方为：氯化钠5g/kg、磷酸二氢钾2g/kg、硫酸铵2g/kg、余量为麸皮、米糠或豆粕、含水量控制在20-40%，控制湿度30%，35℃、8rpm培养56h，然后低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂。

采用前述的第一种发酵方法发酵得到的抗菌肽固剂的应用，其特征在于，作为饲料添加剂使用。

前述的产抗菌肽的海洋芽孢杆菌的第二种发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌M252纯化后接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；

步骤2：将一级种子液接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、玉米浆5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、氯化钙1g/L、用净化的海水配制，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；

步骤3：将二级种子液接入液体发酵罐中，液体发酵罐中的培养基的配方为：氯化铵1g/L、醋酸钠3g/L、氯化镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、氯化钠1g/L、酵母膏2g/L、葡萄糖2g/L、用净化的海水配制，设置温度35℃、转速400rpm、通风量0.75vvm、DO值25%，控制发酵液pH 7-8，手动添加消泡剂，发酵56h，得发酵液，将发酵液于4℃、4000rpm离心，将所得上清液用旋转蒸发仪浓缩10倍，浓缩液通过 0.22μm 滤膜除去菌体及沉淀物，得抗菌肽液剂；

或者，将二级种子液接入固体发酵罐中，固体发酵罐中的培养基的配方为：氯化钠5g/kg、磷酸二氢钾2g/kg、硫酸铵2g/kg、余量为麸皮、米糠或豆粕、含水量控制在20-40%，控制湿度30%，35℃、8rpm培养56h，然后低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂，之后向抗菌肽固剂中按重量比10：1加入无菌净化水，180rpm浸提2h，浸提液离心浓缩、0.22μm滤膜除菌，得抗菌肽液剂。

采用前述的第二种发酵方法发酵得到的抗菌肽液剂的应用，其特征在于，作为对虾、水产鱼类养殖的功能肥料使用，直接投施至养殖池塘中。

前述的产抗菌肽的海洋芽孢杆菌的第三种发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将枯草芽孢杆菌M252纯化后接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；

步骤2：将一级种子液接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、玉米浆5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、氯化钙1g/L、用净化的海水配制，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；

步骤3：将二级种子液接入液体发酵罐中，液体发酵罐中的培养基的配方为：氯化铵1g/L、醋酸钠3g/L、氯化镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、氯化钠1g/L、酵母膏2g/L、葡萄糖2g/L、用净化的海水配制，设置温度35℃、转速400rpm、通风量0.75vvm、DO值25%，控制发酵液pH 7-8，手动添加消泡剂，发酵56h，得发酵液，将发酵液于4℃、4000rpm离心，将所得上清液用旋转蒸发仪浓缩10倍，浓缩液通过 0.22μm 滤膜除去菌体及沉淀物，得抗菌肽液剂；或者，将二级种子液接入固体发酵罐中，固体发酵罐中的培养基的配方为：氯化钠5g/kg、磷酸二氢钾2g/kg、硫酸铵2g/kg、余量为麸皮、米糠或豆粕、含水量控制在20-40%，控制湿度30%，35℃、8rpm培养56h，然后低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂，之后向抗菌肽固剂中按重量比10：1加入无菌净化水，180rpm浸提2h，浸提液离心浓缩、0.22μm滤膜除菌，得抗菌肽液剂；

步骤4：将抗菌肽液剂的pH调至2.0，4℃静置12h，然后4℃、10000rpm离心得到沉淀，将所得沉淀用90%乙醇溶解并搅拌均匀，将溶液的pH调至7.0，室温静置3h，然后4℃、10000rpm离心得提取液，将提取液用旋转蒸发仪浓缩，之后将浓缩液冷冻干燥，即得抗菌肽粉剂。

采用前述的第三种发酵方法发酵得到的抗菌肽粉剂的应用，其特征在于，作为海参养殖的功能肥料使用，配制成溶液后投施至养殖池塘中。

本发明的有益之处在于：

1、本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌M252，分离自水产养殖池底泥，对溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌均具有明显的抑制效果，另外，该枯草芽孢杆菌M252易培养、繁殖速度快，在菌种混合培养时属于优势菌种；

2、由本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌M252发酵所制备的各抗菌肽制品，均有显著的抑制溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌等病原菌的效果；

3、由本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌M252发酵所制备的各抗菌肽制品，包含固（抗菌肽固剂B1）液（抗菌肽液剂A2、抗菌肽液剂B2）粉（抗菌肽粉剂A3、抗菌肽粉剂B3）三种不同的使用状态，发酵制品多元化，可应用至水产养殖、动物饲料、作物肥料等不同领域；

4、本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌M252在发酵过程中所用到的培养基成分，均来源于成本较低的原料，在保证了发酵效率的同时降低了发酵成本，更适应于工业化生产应用。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌M252的培养周期与抑菌性的关联图；

图2是枯草芽孢杆菌M252所产的抗菌肽的相对活力与作用温度之间的变化曲线图；

图3是枯草芽孢杆菌M252所产的抗菌肽的相对活力与作用pH之间的变化曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、枯草芽孢杆菌M252的分离、纯化及鉴定

1、枯草芽孢杆菌M252的分离、纯化

本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌M252是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的，分离、纯化的过程具体如下：

（1）取10g采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品，然后将该底泥样品加入到100ml 浓度为0.85%的NaCl无菌溶液中，制成浑浊液。

（2）将制备得到的浑浊液进行梯度稀释，然后取100μl稀释10000倍的浑浊液，以平板涂布的方式涂布至蛋白胨培养基上，蛋白胨培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、琼脂15g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，这一步共涂3个平板，之后将3个涂布了浑浊液的平板置于37℃培养箱中倒置培养24h，此时每个平板上长出了大约60-90个单菌落。

（3）从每个平板上随机挑取3个单菌落至新的蛋白胨培养基上，采用平板划线的方式纯化单菌落，划线完毕后将该9个平板置于37℃培养箱中倒置培养24h，此时每个平板上长出了大约50个单菌落，最后随机保存一个菌落形态为圆形、边缘不规则、表面有褶皱、不透明、色泽微黄的单菌落，该单菌落即为本发明最终筛选所得单菌落，相应的，该单菌落中的菌株即为本发明最终筛选所得菌株。

2、枯草芽孢杆菌M252的鉴定

（1）观察菌落形态

将本发明最终筛选所得菌株以平板涂布的方式涂布至蛋白胨培养基上，37℃培养箱中倒置培养24h，此时该平板上长出了大约100个单菌落，这些菌落呈圆形，边缘不规则，表面有褶皱，不透明，色泽微黄。

（2）凝胶电泳检测

将本发明最终筛选所得菌株接种至LB液体培养基中，37℃、 150rpm培养12h，得到菌液。

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述菌液中的细菌的DNA，然后以所提DNA为模板、以27F（序列为AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG）为上游引物、以ITS1（序列为TCCGTAGGTGAACCTGCGG）为下游引物进行序列扩增。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，31个循环；72℃5 min。

扩增结束后，用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。检测结果表明：通用引物PCR扩增成功。

（3）16S rRNA鉴定

将本发明最终筛选所得菌株送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行16S rRNA序列测定，并将测得的该菌株的16S rRNA序列在Gen Bank中进行同源序列比对检索，比对检索的结果显示：该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）相似度达到了100%。

最终，鉴定本发明最终筛选所得菌株为枯草芽孢杆菌，记为枯草芽孢杆菌M252。

二、抑菌效果的测定方法

以溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌为指示菌，以牛津杯平板扩散法测定待测液的抑菌效果。

制作抑菌板：向熔融的LB固体培养基中分别添加溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌，添加浓度均为1%（v/v），然后分别倒入不同的培养皿中，冷却后即得相应的抑菌板。

抑菌板制作完成后，在每个抑菌板上放4个牛津杯，其中1个牛津杯作为空白对照组，其余3个牛津杯作为平行实验组，向空白对照组中的牛津杯中加入100μl无菌水，向平行实验组中的每个牛津杯中各加入100μl待测液，于35℃正置培养24h，之后测量和记录各抑菌板上抑菌圈的直径（mm）。

三、研究枯草芽孢杆菌M252的液态发酵抑菌性

将枯草芽孢杆菌M252纯化后按5%接种量接入一级种子罐中，一级种子罐中培养基的配方为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠1g/L、用净化的海水配制，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；然后将一级种子液按5%接种量接入二级种子罐中，二级种子罐中培养基的配方为：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、玉米浆5g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、氯化钙1g/L、用净化的海水配制，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；之后将二级种子液按5%接种量接入液体发酵罐中，液体发酵罐中培养基的配方为：氯化铵1g/L、醋酸钠3g/L、氯化镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、氯化钠1g/L、酵母膏2g/L、葡萄糖2g/L、用净化的海水配制，设置温度35℃、转速500rpm、通风量0.75vvm、DO值25%，控制发酵液pH 7-8，手动添加消泡剂，发酵70h，得发酵液A1。

在整个发酵过程中，我们定期取样，测发酵液的OD600nm和抑菌圈直径（以溶藻弧菌作为指示菌的代表），将枯草芽孢杆菌M252的培养周期与抑菌性进行关联，最终我们得到如图1所示的枯草芽孢杆菌M252的培养周期与抑菌性的关联图，由图1可知：

（1）枯草芽孢杆菌M252在生长旺盛期内仍能继续产生并积累抗菌肽，抗菌肽积累越多，抑菌效果越明显；

（2）在发酵的第56h，发酵液的抑菌圈直径即达到最大（即抗菌肽活性最大），随后减小，最优的发酵时间是56h。

随后，取适量发酵液A1于4℃、4000rpm离心30min，将所得上清液用旋转蒸发仪浓缩10倍，浓缩液通过 0.22μm 滤膜除去菌体及沉淀物，得抗菌肽液剂A2。

检测抗菌肽液剂A2的抑菌效果，具体结果详见表1。

表1 枯草芽孢杆菌M252液态发酵抑菌效果

由表1可知，由枯草芽孢杆菌M252经液态发酵制得的抗菌肽液剂A2对溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌均具有明显的抑制效果，其中，对海水致病菌溶藻弧菌的抑制效果最明显，对大肠杆菌的抑制效果相对较弱，这可能是由于枯草芽孢杆菌M252来源于海洋，其代谢所产生的抗菌肽对海水微生物具有更高作用特异性所致。

四、研究枯草芽孢杆菌M252的固态发酵抑菌性

将枯草芽孢杆菌M252纯化后按5%接种量接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基同上，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；然后将一级种子液按5%接种量接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基同上，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；之后将二级种子液按5%接种量接入固体发酵罐中，固体发酵罐中培养基的配方为：氯化钠5g/kg、磷酸二氢钾2g/kg、硫酸铵2g/kg、余量为麸皮、米糠或豆粕（本实施例采用的是麸皮）、含水量控制在20-40%，控制湿度30%，35℃、8rpm培养64h，低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂B1；随后，取适量上述抗菌肽固剂B1按重量比10：1加入无菌净化水，180rpm浸提2h，浸提液离心浓缩、0.22μm滤膜除菌，最终得抗菌肽液剂B2。

检测抗菌肽固剂B1和抗菌肽液剂B2的抑菌效果，具体结果详见表2。

表2抗菌肽固剂B1和抗菌肽液剂B2的抑菌效果

由表2可知，由枯草芽孢杆菌M252经固态发酵制得的抗菌肽固剂B1和抗菌肽液剂B2对溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和大肠杆菌均具有明显的抑制效果，但相比抗菌肽液剂A2，抗菌肽固剂B1和抗菌肽液剂B2的抑制效果相对较弱，这可能是由于枯草芽孢杆菌M252发酵产抗菌肽时所用的培养基不同导致的，液态发酵培养基物质组分较固态发酵培养基物质组分更为丰富，也更有利于微生物的发酵代谢活动。

五、制备粉态的抗菌肽（即抗菌肽粉剂）并研究其抑菌性

取适量上述抗菌肽液剂A2和抗菌肽液剂B2，分别用3mol/L HCl调pH至2.0，然后4℃静置12h，4℃、10000 rpm离心20min 得到沉淀，将所得沉淀用90%乙醇溶解并搅拌均匀，用3mol/L NaOH调pH至7.0，室温静置3h，4℃、10000rpm离心10min得提取液，将提取液用旋转蒸发仪浓缩，之后将浓缩液冷冻干燥，即得抗菌肽粉剂A3和抗菌肽粉剂B3。

将抗菌肽粉剂A3和抗菌肽粉剂B3分别加无菌水配成浓度为25%（w/v）的抗菌肽溶液，然后检测两种抗菌肽溶液的抑菌效果，具体结果详见表3。

表3 抗菌肽粉剂A3和抗菌肽粉剂B3的抑菌结果

由表3可知，与抗菌肽液剂A2和抗菌肽液剂B2相比，抗菌肽粉剂A3和抗菌肽粉剂B3对指示菌的抑制效果更为明显，表明通过酸沉淀法从抗菌肽液剂A2和抗菌肽液剂B2中制备得到了抗菌肽，说明不管是液态的发酵培养基还是固态的发酵培养基，枯草芽孢杆菌M252发酵后所产生的有效成分均为多肽类物质，这些多肽类物质对各指示菌均有较明显的抑菌效果。

六、抗菌肽活力的测定方法

抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，其本身是一类由氨基酸残基组成的具有抗菌能力的肽类。对于生物酶的定义则是一类具有生物特异性的高效催化剂，生物酶本身就是一种蛋白质，而蛋白质是由多肽组成。目前普遍认为，抗菌肽的抑菌机理在于其作用于细胞膜并形成跨膜的离子通道，破坏了膜的完整性，造成细胞内容物泄漏，从而杀死细胞。因此本发明将枯草芽孢杆菌M252所产的抗菌肽类比生物溶菌酶测定的方法对抗菌肽进行活力特性分析。

采用比浊法对抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂进行抗菌肽活力测定。以溶壁微球菌为底物，依据菌悬液浊度的变化分别测定抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂的活力。

1、制备溶壁微球菌菌悬液

将溶壁微球菌接种于LB液体培养基中，在30℃、160rpm下培养至指数期，然后5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用无菌水洗涤，之后用0.1mol/L磷酸缓冲液调至溶壁微球菌菌悬液A450=1.0。

2、将抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂分别制成合适浓度的溶液

使用无菌水将抗菌肽固剂溶解，配制成浓度为40%（w/v）的抗菌肽溶液。

使用无菌水将抗菌肽液剂稀释，配制成浓度为30%（v/v）的抗菌肽溶液。

使用无菌水将抗菌肽粉剂溶解，配制成浓度为20%（w/v）的抗菌肽溶液。

3、比浊法测定抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂的活力

将溶壁微球菌菌悬液以及抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂对应的抗菌肽溶液放置于25℃水浴锅中水浴20min，准备多支比色管，先向每支比色管中各加入3mL溶壁微球菌菌悬液，测定此时每支比色管的A450值，然后向每支比色管中分别加入0.2mL抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂对应的抗菌肽溶液，迅速摇匀，之后每30s记录一次每支比色管的A450值。

活力单位定义：在25℃、pH为7的条件下，A450值每60s下降0.001即为１个活力单位，即1U，由此得到抗菌肽活力的计算公式如下：

（1）抗菌肽液剂的活力的计算公式

每1mL抗菌肽活力单位=［A450（0s）- A450（60s）］×1000／样品毫升数。

（2）抗菌肽固剂和抗菌肽粉剂的活力的计算公式

每1mg抗菌肽活力单位=［A450（0s）- A450（60s）］×1000／样品毫克数。

七、验证枯草芽孢杆菌M252的发酵效果及发酵性能

实施例1：液态发酵

将枯草芽孢杆菌M252纯化后按5%接种量接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基同上，培养基的用量为1L，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；然后将一级种子液按5%接种量接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基同上，培养基的用量为5L，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；之后将二级种子液按5%接种量接入液体发酵罐中，液体发酵罐中的培养基同上，培养基的用量为50L，设置温度35℃、转速400rpm、通风量0.75vvm、DO值25%，控制发酵液pH 7-8，手动添加消泡剂，发酵56h，得发酵液A1’；最后，取适量发酵液A1’于4℃、4000rpm离心30min，将所得上清液用旋转蒸发仪浓缩10倍，浓缩液通过 0.22μm 滤膜除去菌体及沉淀物，得抗菌肽液剂A2’，取0.5L上述抗菌肽液剂A2’，用3mol/L HCl调pH至2.0， 4℃静置12h，然后4℃、10000rpm离心20min 得到沉淀，将所得沉淀用90%乙醇溶解并搅拌均匀，用3mol/L NaOH调pH至7.0，室温静置3h，4℃、10000rpm离心10min得提取液，将提取液用旋转蒸发仪浓缩，之后将浓缩液冷冻干燥，即得抗菌肽粉剂A3’。

实施例2：固态发酵

将枯草芽孢杆菌M252纯化后按5%接种量接入一级种子罐中，一级种子罐中的培养基同上，培养基的用量为1L，35℃、200rpm培养40h，得一级种子液；然后将一级种子液按5%接种量接入二级种子罐中，二级种子罐中的培养基同上，培养基的用量为5L，35℃、300rpm培养20h，得二级种子液；之后将二级种子液按5%接种量接入固体发酵罐中，固体发酵罐中的培养基同上，培养基的用量为50L，控制湿度30%，35℃、8rpm培养56h，然后低温鼓风干燥，得抗菌肽固剂B1’；最后，取1kg上述抗菌肽固剂B1’按重量比10：1加入无菌净化水，180rpm浸提2h，浸提液离心浓缩、0.22μm滤膜除菌，最终得抗菌肽液剂B2’；取0.5L上述抗菌肽液剂B2’，用3mol/L HCl调pH至2.0，4℃静置12h，然后4℃、10000rpm离心20min 得到沉淀，将所得沉淀用90%乙醇溶解并搅拌均匀，用3mol/L NaOH调pH至7.0，室温静置3h，4℃、10000rpm离心10min得提取液，将提取液用旋转蒸发仪浓缩，之后将浓缩液冷冻干燥，即得抗菌肽粉剂B3’。

分别检测抗菌肽固剂B1’、抗菌肽液剂A2’、抗菌肽液剂B2’抗菌肽粉剂A3’和抗菌肽粉剂B3’的浓度（使用考马斯亮蓝法测定多肽含量）以及活力。检测结果见表4、表5和表6。

表4 抗菌肽固剂B1’的浓度以及活力

表5 抗菌肽液剂A2’和抗菌肽液剂B2’的浓度以及活力

表6 抗菌肽粉剂A3’和抗菌肽粉剂B3’的浓度以及活力

由表4、表5和表6可知，枯草芽孢杆菌M252不仅能发酵产生高浓度、高活力的抗菌肽，而且其发酵性能以及其所产抗菌肽活力都具有显著的稳定性。

八、抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂的最适作用温度和最适作用pH

1、抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂的最适作用温度

在pH值为7的条件下，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃测定抗菌肽固剂B1’、抗菌肽液剂A2’、抗菌肽液剂B2’、抗菌肽粉剂A3’和抗菌肽粉剂B3’的活力，然后计算相对活力（相对活力即比活力，即每毫克或每毫升酶蛋白所具有的酶活力单位数），之后绘制抗菌肽相对活力与温度之间的变化曲线，得到的变化曲线如图2所示。

由图2可知，抗菌肽固剂B1’的最适作用温度为35℃，抗菌肽液剂A2’ 和抗菌肽液剂B2’的最适作用温度为30℃，抗菌肽粉剂A3’和抗菌肽粉剂B3’的最适作用温度为35℃。

2、抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂的最适作用pH

在35℃的条件下，分别于不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）下测定抗菌肽固剂B1’、抗菌肽液剂A2’、抗菌肽液剂B2’、抗菌肽粉剂A3’和抗菌肽粉剂B3’的活力，然后计算相对活力，之后绘制抗菌肽相对活力与pH值之间的变化曲线，得到的变化曲线如图3所示。

由图3可知，抗菌肽固剂B1’的最适作用pH为8.0，抗菌肽液剂A2’和抗菌肽液剂B2’的最适作用pH为7.5-8.0，抗菌肽粉剂A3’和抗菌肽粉剂B3’的最适作用pH为8.0。

九、抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂的使用方法及效果

1、抗菌肽固剂的使用方法及使用效果

将抗菌肽固剂作为饲料添加剂使用，使用方法如下：

将抗菌肽固剂B1’按40%（w/w）的添加量添加至鸡场肉鸡饲料中喂养施用，以肉鸡7周养殖周期计算，1、2、3号鸡棚投喂添加抗菌肽固剂B1’的饲料，4号鸡棚投喂正常饲料作为对照。

7周养殖周期结束后，各鸡棚肉鸡平均体重变化情况见表7。

表7 各鸡棚肉鸡的平均体重变化情况

由表7知，抗菌肽固剂作为饲料添加剂喂养肉鸡时，不仅能显著提升肉鸡的增长速率，而且还能有效提升肉鸡的出栏率。

2、抗菌肽液剂的使用方法及使用效果

将抗菌肽液剂作为对虾、水产鱼类等池塘养殖功能肥料使用，使用方法如下：

将抗菌肽液剂A2’和抗菌肽液剂B2’按1kg/亩剂量分别直接投施至1号对虾养殖池塘和2号对虾养殖池塘中，3号对虾养殖池塘作为对照不投放抗菌肽液剂。各养殖池塘中对虾的体重变化情况见表8。

表8 养殖池塘中对虾的体重变化情况

由表8知，抗菌肽液剂作为对虾养殖时的功能肥料投施时，能显著提升对虾的增长速率。

3、抗菌肽粉剂的使用方法及使用效果

将抗菌肽粉剂作为海参养殖的功能肥料使用，使用方法如下：

将抗菌肽粉剂A3’和抗菌肽粉剂B3’用纯净水溶解，配制成浓度为20%（w/v）的抗菌肽溶液，分别记为抗菌肽溶液A3’’和抗菌肽溶液B3’’，然后按1kg抗菌肽溶液/5亩剂量投施至海参养殖池塘中。

选取同一区域内5个20亩海参养殖池塘，分别记为池塘1、池塘2、池塘3、池塘4和池塘5，向池塘1和池塘2分别投施4kg抗菌肽溶液A3’’，向池塘3和池塘4分别投施4kg抗菌肽溶液B3’’，剩下的池塘5不投施任何微生物菌剂（对照组），之后每7d增投抗菌肽溶液A3’’和抗菌肽溶液B3’’一次，每次投施2kg，连续投施6w，对照组始终不投施任何微生物菌剂。

每7d观察并记录每个养殖池塘的海参体重变化情况，具体结果详见表9。

表9各养殖池塘的海参体重变化情况

6周后，观察每个养殖池塘内的水质情况，具体结果详见表10。

表10 各养殖池塘内的水质情况

池塘1池塘2池塘3池塘4池塘5投施前好好好好好6周后较好较好较好较好较差

由表9和表10知，抗菌肽粉剂不仅能显著提升海参的增长率，而且还能有效改善海参养殖过程中养殖池塘内的水质。

十、保藏枯草芽孢杆菌M252

由前面提供的利用枯草芽孢杆菌M252制备得到的抗菌肽固剂、抗菌肽液剂和抗菌肽粉剂的使用效果可知，本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌M252在家禽养殖、水产养殖方面都具有非常高的实际应用价值，所以我们对该枯草芽孢杆菌M252进行了菌种保藏，保藏信息具体如下：

保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020 年03月24日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020057，保藏地址为中国武汉。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

一株产抗菌肽的海洋芽孢杆菌及其发酵方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。