专利摘要

本发明公开了一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法。利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的多肽展示在噬菌体的衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，形成矿化型噬菌体溶液；扩增、纯化、浓缩矿化型噬菌体溶液；将矿化型噬菌体溶液加入到丝素蛋白溶液中进行组装，即得改性后的丝素蛋白。本发明获得的改性后的丝素蛋白比未改善的丝素蛋白具有更优异的调控矿化物成核与生长的能力，改性方法操作简单有效，改性工艺高效，生产周期大为缩短，可大规模获取的优势。

权利要求

1.一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的多肽展示在噬菌体的衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，形成矿化型噬菌体溶液；

所述的矿化调控功能的多肽为釉原蛋白核心多肽、牙本质蛋白核心多肽、牙本质基质蛋白1核心多肽，所述多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

（2）扩增、纯化、浓缩矿化型噬菌体溶液；

（3）将矿化型噬菌体溶液加入到丝素蛋白溶液中进行组装，即得改性后的丝素蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述的矿化调控功能的多肽为来源于人体、动物或者微生物中具有生物矿化功能的蛋白片段序列。

3.根据权利要求1所述的一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法，其特征在于：所述步骤（3）中丝素蛋白种类是家蚕丝素蛋白、野蚕丝素蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，矿化型噬菌体溶液的噬菌体添加浓度为1011 pfu/mL～1016 pfu/mL。

5.根据权利要求1所述的一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，噬菌体与丝素蛋白的组装方式是充分混合或者将噬菌体与丝素蛋白进行化学交联。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种生物材料的加工方法，具体是涉及了一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法。

背景技术

骨是动物体中最坚硬的一种结缔组织，主要由无机矿物羟基磷灰石(HA)晶体和有机物I型胶原纤维等在生物体内通过矿化过程生成的硬组织。生物矿化是一种普遍的生命现象，在生物体内矿化过程中，骨桥蛋白、骨钙素、牙本质基质蛋白等矿化调控蛋白对HA晶体的晶体取向、尺寸及形貌起着重要的调控作用。

骨缺损及骨损伤是常见的疾病，每年患者多达数千万人，对患者的正常生命活动和身心健康构成严重威胁。骨组织的损伤修复是临床医学难题之一，其局限性在于体内骨组织为高度分化的组织，相关骨细胞再生能力很弱，普通手术治疗不能满足功能修复的需要。

羟基磷灰石具有良好的生物相容性，是构成人体骨骼和牙齿的主要无机成分。因此，模拟自然界的生物矿化过程，以天然高分子材料为模板，诱导羟基磷灰石的成核与生长，能够制备出与骨组织成分相近的支架材料，可用于体内缺损骨组织的修复。家蚕丝素蛋白、野蚕丝素蛋白(柞蚕丝和天蚕丝等)等丝纤维蛋白是丝蛋白中产量最丰富的一种蛋白，属于天然高分子材料，具有很强的机械强度，作为丝绸原料的使用已经有五千年的历史。此外，丝素蛋白还具有良好的生物相容性和可降解性，其降解产物对细胞或者机体无毒副作用，也很少产生严重的免疫排斥或者炎症反应。由于上述的优点，越来越多的研究将丝素蛋白用于科学研究和临床应用。然而与含有较多酸性氨基酸的丝胶蛋白相比，丝素蛋白中酸性氨基酸占比少，研究上普遍认为丝素蛋白的生物矿化功能很弱，限制了其在生物矿化领域的应用。有研究发现：只有丝素蛋白肽链的非结晶区序列能在矿化液中能诱导磷灰石晶体的生长，并且需要较长的矿化时间(7天)；而丝素蛋白肽链的的结晶区由于含有较多的非极性氨基酸，对盐离子的吸附或螯合能力较低，所以在矿化液中诱导生成羟基磷灰石的能力很弱，因此综合表现为丝素蛋白诱导羟基磷灰石的能力很弱，即使能够诱导羟基磷灰石的生成，也需要很长的矿化时间和苛刻的仿生矿化步骤。这一缺陷限制了丝素生物材料综合性能的发挥以及在骨组织工程中的应用。

综上所述，目前还没有一种工序简单，操作容易，生物安全高的方法能够促进丝素蛋白的仿生矿化能力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，利用噬菌体展示技术在噬菌体衣壳蛋白表面展示矿化调控肽。由于噬菌体衣壳蛋白与丝素蛋白有天然的相似性，根据相似相容原理，噬菌体与丝素蛋白能够均匀混合。再通过仿生矿化技术，以丝素蛋白/噬菌体为生长模板，诱导羟基磷灰石在其表面快速成核与生长，从而发明出一种显著改善丝素蛋白生物矿化功能的新型改性方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是如下：

(1)利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的核心肽展示在噬菌体的衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，形成矿化型噬菌体溶液，称为矿化型噬菌体；

(2)扩增、纯化、浓缩矿化型噬菌体溶液；

(3)将矿化型噬菌体溶液加入到丝素蛋白溶液中进行组装，即得改善后的丝素蛋白；

作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中，所述的矿化调控功能的多肽序列来源于人体、动物或者微生物中具有生物矿化功能的蛋白片段。

作为进一步地改进，本发明所述步骤(3)中丝素蛋白种类是家蚕丝素蛋白、野蚕丝素蛋白。

作为进一步地改进，本发明所述步骤(3)中，噬菌体的添加浓度为0pfu/mL～10¹⁶pfu/mL。

所述步骤(3)中，噬菌体与丝素蛋白的组装方式是简单的充分混合步骤或者将噬菌体与丝素蛋白进行化学交联即可。

本发明通过仿生矿化技术，改性后的丝素蛋白比未改善的丝素蛋白具有更优异的调控矿化物成核与生长的能力。

本发明所述的方法工艺简单，制备周期短，生物相容性好。通过噬菌体改性，使得丝素蛋白具有优异的矿化能力。再通过常规的仿生矿化法，盐离子能快速附着在改性丝素蛋白的表面，从而引发生物矿化反应，促进羟基磷灰石在改性丝素蛋白上的成核与快速生长。这种方法不仅可用于家蚕、野蚕(柞蚕丝和天蚕丝等)和蜘蛛等丝蛋白的矿化能力的提高，还可以可用于其它大分子材料(如胶原蛋白、聚乳酸、聚乙二醇等)仿生矿化能力的提高。本发明制备的改性丝素溶液具有优良的水溶性和生物相容性。因此，此发明丰富了生物矿化调控方法的类型，为生物材料和组织工程领域提供新思路，具有广阔的应用前景。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有以下突出特点：

(1)与未改性的丝素蛋白相比，噬菌体改性能显著提高丝素蛋白的生物矿化能力，从而达到生物医学材料改性和材料制备的要求。

(2)与传统矿化改性技术相比，此发明提供的改性方法操作简单，提取工艺高效，没有复杂繁琐的制备过程，只需将功能化噬菌体与丝素蛋白溶液进行充分混合或者将功能化噬菌体与丝素蛋白溶液进行化学交联既制备得到改性的丝素蛋白，生产周期大为缩短。

(3)与传统基因重组技术获得的矿化调控蛋白相比，噬菌体衣壳蛋白上展示的矿化调控肽具有价格低廉，可大规模获取的优势。

附图说明

图1-为实施例3中构建的矿化型噬菌体基因测序结果，其基因序列对应编码的多肽序列为：QESQSEQD。

图2-为实施例3中构建的改性丝素蛋白进行仿生矿化后的TEM图，显示改性后的丝素蛋白纳米纤维表面被一层矿化物晶体所覆盖。

图3-为实施例4中构建的改性丝素蛋白与未改性丝素蛋白进行仿生矿化后的XRD分析，显示改性丝素蛋白能够诱导羟基磷灰石晶体的生成，而丝素蛋白表面生成的矿化物结晶性很低，为弱磷灰石结晶成分。

图4-为改性丝素蛋白在模拟体液中矿化后的SEM图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

本发明的实施例如下：

实施例1

本实施例依次包括如下步骤：

(1)利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的釉原蛋白核心多肽片段氨基酸基序列Thr-Lys-Arg-Glu-Glu-Val-Asp(如SEQ ID NO.1)展示在噬菌体的P3衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，称为釉原蛋白型噬菌体；

(2)将步骤1)中的釉原蛋白型噬菌体和10mL过夜扩摇的大肠杆菌加入到500mL的LB液体培养基中在37℃培养24小时。之后使用4500g的高速离心转速收集上清去除大肠杆菌。再使用PEG/NaCl混合溶液沉淀噬菌体，4度过夜，之后8000g离心收集沉淀得到富集后的釉原蛋白型噬菌体颗粒，重复该沉淀-离心步骤2次，使得收集得到的釉原蛋白型噬菌体纯度提高，然后将釉原蛋白型噬菌体在10mL去离子水中溶解分散，得到釉原蛋白型噬菌体水溶液，通过UV光谱计算噬菌体数量。

(3)将步骤2)中的1mL的矿化型噬菌体溶液与质量分数为1％的丝素蛋白溶液混合，孵育2h，即得改性后的丝素蛋白溶液；

实施例2

本实施例依次包括如下步骤：

(1)利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的牙本质蛋白核心多肽片段氨基酸基序列Glu-Glu–Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu(如SEQ ID NO.2)展示在噬菌体的P6衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，称为牙本质蛋白型噬菌体；

(2)将步骤1)中的牙本质蛋白型噬菌体和5mL过夜扩摇的大肠杆菌加入到100mL的LB液体培养基中在37℃培养12小时。之后使用4500g的高速离心转速收集上清去除大肠杆菌。再使用PEG/NaCl混合溶液沉淀噬菌体，4度过夜，之后8000g离心收集沉淀得到富集后的牙本质蛋白型噬菌体颗粒，重复该沉淀-离心步骤2次，使得收集得到的牙本质蛋白型噬菌体纯度提高，然后将牙本质蛋白型噬菌体在5mL去离子水中溶解分散，得到牙本质蛋白型噬菌体水溶液，通过UV光谱计算噬菌体数量。

(3)将步骤2)中的2mL的矿化型噬菌体溶液与质量分数为0.1％的丝素蛋白溶液混合，孵育2h，即得改性后的丝素蛋白溶液；

实施例3

本实施例依次包括如下步骤：

(1)利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的牙本质基质蛋白1核心多肽片段氨基酸基序列Gln-Glu-Ser-Gln-Ser-Glu-Gln-Asp-Ser(如SEQ ID NO.3，序列测序结果见图3)展示在噬菌体的P8衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，称为牙本质基质蛋白1型噬菌体，测序结果如图1所示；

(2)将步骤1)中的牙本质蛋白型噬菌体和4mL过夜扩摇的大肠杆菌加入到100mL的LB液体培养基中在37℃培养16小时。之后使用4500g的高速离心转速收集上清去除大肠杆菌。再使用PEG/NaCl混合溶液沉淀噬菌体，4度过夜，之后8000g离心收集沉淀得到富集后的牙本质基质蛋白1型噬菌体颗粒，重复该沉淀-离心步骤2次，使得收集得到的牙本质蛋白型噬菌体纯度提高，然后将牙本质蛋白型噬菌体在5mL去离子水中溶解分散，得到牙本质基质蛋白1型噬菌体水溶液，通过UV光谱计算噬菌体数量。

(3)将步骤2)中的2mL浓度为10¹¹pfu/mL的矿化型噬菌体溶液与10mL质量分数为0.1％的丝素蛋白溶液混合，孵育2h，即得改性后的丝素蛋白溶液；

(4)将步骤3)中的改性后的丝素蛋白溶液加入到分子截留量为3000D的透析膜中，然后在模拟体液(SBF)中进行浸泡处理，模拟体液(SBF)和人体血浆化学成分相似(含有氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾、三水.磷酸氢二钾、六水.氯化镁、氯化钙、硫酸钠、三羟甲基胺烷等成分，用1M的HCl将pH调节到7.2)，在37℃，转速为120rpm的矿化3天，每天更换一次SBF，矿化结束后5000g离心，收集沉淀，用同体积乙醇浸泡清洗沉淀物，之后5000g离心，干燥，TEM观察改性后丝素蛋白的矿化形貌(如图2所示)，SEM图如图4所示，证明改性后的丝素蛋白能够促进矿化物的生长。

实施例4

本实施例依次包括如下步骤：

(1)利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的牙本质基质蛋白1核心多肽片段氨基酸基序列Gln-Glu-Ser-Gln-Ser-Glu-Gln-Asp-Ser(如SEQ ID NO.3)展示在噬菌体的P8衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，称为牙本质基质蛋白1型噬菌体；

(2)将步骤1)中的牙本质蛋白型噬菌体和4mL过夜扩摇的大肠杆菌加入到100mL的LB液体培养基中在37℃培养16小时。之后使用4500g的高速离心转速收集上清去除大肠杆菌。再使用PEG/NaCl混合溶液沉淀噬菌体，4度过夜，之后8000g离心收集沉淀得到富集后的牙本质基质蛋白1型噬菌体颗粒，重复该沉淀-离心步骤2次，使得收集得到的牙本质蛋白型噬菌体纯度提高，然后将牙本质蛋白型噬菌体在0.5mL去离子水中溶解分散，得到牙本质基质蛋白1型噬菌体水溶液，通过UV光谱计算噬菌体数量。

(3)将步骤2)中的0.1mL浓度为10¹⁵pfu/mL的矿化型噬菌体溶液与10mL质量分数为0.1％的丝素蛋白溶液混合，孵育2h，即得改性后的丝素蛋白溶液；

(4)将步骤3)中的改性后的丝素蛋白溶液或者单纯的丝素蛋白分别加入到50mL含有10mM CaCl₂、120mM NaCl、20mM HEPES、pH＝7.4的水溶液中进行孵育，再将50mL含有6mMNa₂HPO₄、120mM NaCl、20mM HEPES通过蠕动泵滴加到上述溶液中，流速2mL/h，滴加完全后再陈化6h，矿化结束后4000g离心，收集沉淀，用同体积乙醇浸泡清洗沉淀物，之后5000g离心，干燥，进行成分和元素分析，图3为改性后的丝素蛋白溶液或者单纯的丝素蛋白矿化后的XRD图，证明改性后的丝素蛋白能够在段时间内(约12h)诱导羟基磷灰石晶体的生长。

实施例5

本实施例依次包括如下步骤：

(1)利用噬菌体展示技术将矿化调控功能的牙本质基质蛋白1核心多肽片段氨基酸基序列Gln-Glu-Ser-Gln-Ser-Glu-Gln-Asp-Ser(如SEQ ID NO.3)展示在噬菌体的P8衣壳蛋白表面，制备出展示有诱导矿化功能的噬菌体纳米纤维，称为牙本质基质蛋白1型噬菌体；

(2)将步骤1)中的牙本质蛋白型噬菌体和4mL过夜扩摇的大肠杆菌加入到100mL的LB液体培养基中在37℃培养16小时。之后使用4500g的高速离心转速收集上清去除大肠杆菌。再使用PEG/NaCl混合溶液沉淀噬菌体，4度过夜，之后8000g离心收集沉淀得到富集后的牙本质基质蛋白1型噬菌体颗粒，重复该沉淀-离心步骤2次，使得收集得到的牙本质蛋白型噬菌体纯度提高，然后将牙本质蛋白型噬菌体在0.5mL去离子水中溶解分散，得到牙本质基质蛋白1型噬菌体水溶液，通过UV光谱计算噬菌体数量。

(3)将步骤2)中的0.1mL浓度为10¹²pfu/mL的矿化型噬菌体溶液与10mL质量分数为0.4％的丝素蛋白溶液混合，加入12mg的N-羟基琥珀酰亚胺酯和18mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行化学交联，分子截留量为8000Da的透析袋中透析12h，即得改性后的丝素蛋白溶液；

(4)将步骤3)中的改性后的丝素蛋白溶液或者单纯的丝素蛋白分别加入到50mL含有10mM CaCl₂、120mM NaCl、20mM HEPES、pH＝7.4的水溶液中进行孵育，再将50mL含有6mMNa₂HPO₄、120mM NaCl、20mM HEPES通过蠕动泵滴加到上述溶液中，流速10mL/h，滴加完全后再陈化6h，矿化结束后4000g离心，收集沉淀，用同体积乙醇浸泡清洗沉淀物，之后5000g离心，干燥。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

本发明涉及的序列如下：

SEQ ID NO.1：釉原蛋白核心多肽片段氨基酸基序列

来源：釉原蛋白

Thr-Lys-Arg-Glu-Glu-Val-Asp

SEQ ID NO.2：牙本质蛋白核心多肽片段氨基酸基序列

来源：牙本质蛋白

Glu-Glu–Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu

SEQ ID NO.3：牙本质基质蛋白1核心多肽片段氨基酸基序列

来源：牙本质基质蛋白

Gln-Glu-Ser-Gln-Ser-Glu-Gln-Asp-Ser。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 釉原蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Thr Leu Ala Gly Gly Val Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 牙本质蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 牙本质基质蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ser

1 5

一种改善丝素蛋白生物矿化能力的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。