专利摘要

本发明涉及微生物技术领域，提供了一种娄地青霉(Penicilliumroqueforti)，保藏编号为CGMCCNo.14140。本发明提供的娄地青霉来源于黄草乌根部，是黄草乌的内生真菌。本发明所述娄地青霉的代谢产物中含有一种具有新颖的5/6/5/6/5五环系新骨架结构的二倍半萜类化合物peniroquesineA，有显著的抗炎活性。采用本发明提供的娄地青霉能够简单、高效的制备二倍半萜类化合物peniroquesineA，用于制备抗炎药物。微生物发酵制备二倍半萜类化合物具有周期短、培养条件温和、副产物少、立体选择性强、成本低的优点。

权利要求

1.一种娄地青霉(Penicillium roqueforti)，保藏编号为CGMCC No.14140。

2.权利要求1所述娄地青霉在制备抗炎活性化合物peniroquesineA中的应用，其特征在于，所述抗炎活性化合物peniroquesineA具有式I所示的结构：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述娄地青霉发酵培养得到娄地青霉发酵产物，色谱分离所述娄地青霉发酵产物，即得抗炎活性化合物peniroquesineA。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述娄地青霉发酵所用的发酵培养基包括马铃薯或大米。

5.权利要求1所述娄地青霉在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，所述抗炎药物的活性成分包括由娄地青霉发酵得到的抗炎活性化合物peniroquesineA和一种或多种药用辅料。

所述抗炎活性化合物peniroquesineA具有式I所示的结构：

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制备的抗炎药物中，抗炎活性化合物peniroquesineA含量为1～99％。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物的剂型为片剂、胶囊剂、溶液剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、针剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂或靶向制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种用于制备抗炎活性化合物peniroquesine A的娄地青霉及其应用。

背景技术

植物内生菌(endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。植物内生菌是能在健康植物组织内栖居而对植物不造成实质性危害，且与植物建立了和谐共生关系的微生物，一部分植物内生菌还能使植物获益。

萜类化合物(terpenes)——分子式为异戊二烯单位的倍数的烃类及其含氧衍生物，是具有高度多样性的一大类天然产物，包括单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜等等。许多萜类衍生物已被发展为治疗癌症、细菌感染、疟疾和其他各种人类疾病的重要药物，因此萜类的合成就显得非常的重要。但由于生源合成途径仍未完全阐明、萜类化合物具有非模块化的结构、没有普适的统一的合成策略等因素，因而萜类化合物的来源途径依赖于天然产物的提取。

二倍半萜类化合物(sesterterpenes)大部分属于海洋中各种海绵和藻类植物及其内生真菌的次级代谢产物，在陆生植物中极为罕见，以往的研究发现有极少数的微生物能够产生此类化合物。据文献报道，二倍半萜类化合物具有抗炎、抗细胞毒、抗肿瘤以及抗菌等多种生物活性。

由于从海洋生物中提取二倍半萜化合物的成本高、周期长，使得二倍半萜类化合物的抗炎活性难以被充分利用，为了进一步推广二倍半萜化合物，需要寻找更简便的二倍半萜化合物产生途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备新的二倍半萜类化合物peniroquesine A的微生物。

本发明提供了一种娄地青霉(Penicillium roqueforti)，保藏编号为CGMCCNo.14140。

本发明的目的还在于提供上述技术方案所述娄地青霉在制备抗炎活性化合物peniroquesine A中的应用，所述抗炎活性化合物peniroquesine A具有式I所示的结构：

优选的，将所述娄地青霉发酵培养得到娄地青霉发酵产物，色谱分离所述娄地青霉发酵产物，即得抗炎活性化合物peniroquesine A。

优选的，所述娄地青霉发酵所用的发酵培养基包括马铃薯或大米。

本发明还提供了一种前述技术方案所述娄地青霉在制备抗炎药物中的应用，所述抗炎药物的活性成分包括由娄地青霉发酵得到的抗炎活性化合物peniroquesine A和一种或多种药用辅料；

所述抗炎活性化合物peniroquesine A具有式I所示的结构：

优选的，所述制备的抗炎药物中，抗炎活性化合物peniroquesine A含量为1～99％。

优选的，所述抗炎药物的剂型为片剂、胶囊剂、溶液剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、针剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂或靶向制剂。

本发明提供了一种娄地青霉(Penicillium roqueforti)，保藏编号为CGMCCNo.14140。本发明提供的娄地青霉来源于黄草乌根部，是黄草乌的内生真菌。本发明所述娄地青霉的代谢产物中含有一种具有新颖的[5,6,5,6,5]五环系新骨架结构的二倍半萜类化合物peniroquesine A，有显著的抗炎活性，即采用本发明提供的娄地青霉能够制备得到一种新的二倍半萜类化合物。

采用本发明提供的娄地青霉能够简单、高效的制备二倍半萜类化合物，微生物发酵制备二倍半萜类化合物具有周期短、培养条件温和、副产物少、立体选择性强、成本低的优点；相比于现有技术中主要以海洋生物提取二倍半萜类化合物而言具有更高的经济价值，成本低、操作简便，易于大规模生产，为二倍半萜类化合物的量产提供新途径。

本发明提供的娄地青霉可以应用于制备抗炎药物，制备包括抗炎活性化合物peniroquesine A为活性成分的抗炎药物，为开发抗炎药物提供新的选择。

生物保藏说明：

娄地青霉(Penicillium roqueforti)，于2017年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；生物保藏编号为CGMCC No.14140。

附图说明

图1为本发明所述抗炎活性化合物peniroquesine A的HR-ESI-MS谱；

图2为本发明所述抗炎活性化合物peniroquesine A的HR-ESI-MS谱检测结果；

图3为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的¹H-NMR谱；

图4为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的¹³C-NMR和DEPT谱；

图5为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的HMBC谱；

图6为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的HSQC谱；

图7为本发明中抗炎活性化合物peniroquesine A的¹H-¹H COSY谱。

具体实施方式

本发明提供了一种娄地青霉(Penicillium roqueforti)，保藏编号为CGMCCNo.14140。

本发明所述的娄地青霉(Penicillium roqueforti)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14140。该娄地青霉来源于黄草乌，是黄草乌(Aconitum vilmorinianum Kom.)的内生真菌，更具体来说所述娄地青霉从黄草乌根部分离得到。

具体的，本发明所述娄地青霉(Penicillium roqueforti)的获得方法为：

S1、取洗净的黄草乌根部，用质量分数45～55％的次氯酸钠溶液浸泡0.5～5min，清洗后再用质量体积分数75％的乙醇溶液进行0.5～5min，清洗，干燥表面水分；

S2、将经过S1步骤消毒处理的黄草乌根部去皮，分成长不超过5mm的碎根，将碎根接种于PDA培养基上，26～30℃恒温培养；

S3、每隔20～30h观察1次，将接种后PDA培养基中颜色形态纯正的菌落挑出，转接到新的PDA培养基中划线培养，直至获得单一菌落；

S4、将S3步骤分离得到的各单一菌落分别接种于PDA培养基中24～27℃恒温培养5～8d，选取菌落边缘为浅黄色绒状、其余为绿色，背面为黄褐色的菌落，送至昆明硕擎生物科技有限公司鉴定为娄地青霉，即得本发明提供的娄地青霉。

在本发明中，所述娄底青霉在PDA培养基上，培养1d后可观察到接种点有白色点状绒状菌丝体；培养3d后可观察到围绕接种点形成圆形直径2cm左右的白色绒状体，菌落表面较为平坦，反面靠近中心部位为浅黄色，边缘为无色；培养5d后围绕接种点形成圆形直径约4cm的菌落，菌落表面有突起，菌落中心含绿色颗粒状，边缘为浅黄色绒状，背面为黄褐色，边缘无色；培养7d后菌落边缘为浅黄色绒状，其余为绿色，背面为黄褐色。

本发明还提供了上述技术方案所述娄地青霉在制备抗炎活性化合物peniroquesine A中的应用，所述抗炎活性化合物peniroquesine A具有式I所示的结构：

式I所示的抗炎活性化合物peniroquesine A为上述技术方案所述娄地青霉的代谢产物，是一种二倍半萜类化合物，具有一个新颖的5/6/5/6/5五环系新骨架结构。

所述抗炎活性化合物peniroquesine A分子式为C₂₅H₄₀O₂，如附图1所示的抗炎活性化合物peniroquesine A的HR-ESI-MS(高分辨电喷雾电离质谱)谱图，m/z 395.2923[M+Na]⁺。本发明通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS对抗炎活性化合物peniroquesine A结构进行鉴定，¹H、¹³C、HMBC、HSQC和¹H-¹H COSY核磁数据见附图3～7，可以确定其结构如式I所示，其化学名称为：

(1S,4R,8aS,10R,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-hexamethyl-2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-hexadecahydro-1H-dicyclopenta[a,g]fluorene-4,10-diol；

即：(1S,4R,8aS,10R,10aS,11bR)-1,6,6,8a,10a,11b-六甲基-2,3,3a,4,5,5a,5b,5c,6,7,8,8a,9,10,10a,11b-十六氢-1H-双环戊[a,g]芴-4,10-二醇。

在本发明中，所述娄地青霉制备抗炎化合物peniroquesine A的方法，包括以下步骤：

(1)将娄地青霉接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物；

所述娄地青霉的保藏编号为CGMCC NO.14140；

(2)将所述步骤(1)得到的娄地青霉发酵物与醇混合后超声提取，得到peniroquesine A粗提物；

(3)将peniroquesine A粗提物经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesineA。

本发明将保藏编号为CGMCCNO.14140的娄地青霉菌种以1％的接种量接种于发酵培养基中发酵，得到娄地青霉发酵物。所述发酵温度优选为20～28℃，更优选为25～27℃。在本发明中，所述发酵时间为25～32d，优选为30d。本发明对娄地青霉在发酵培养基上的接种量无特殊限定，挑取所述娄地青霉菌种接入即可。

在本发明中，所述发酵培养基的制作原料中优选的包括马铃薯或大米，更优选为以马铃薯为原料制作的发酵培养基。本发明所述发酵培养基能够使娄地青霉生长繁殖即可。

在本发明中，所述娄地青霉的发酵方式优选为固体发酵，娄地青霉在液体发酵中的代谢时间较长，本发明采用固体发酵方式能够缩短发酵时间。在本发明中，所述固体发酵温度为20～30℃，优选为26～28℃；所述固体发酵时间优选为25～35d，优选为28～30d。在本发明中，所述娄地青霉的发酵过程为好氧发酵。

得到所述娄地青霉发酵物后，本发明将娄地青霉发酵物与醇溶液混合后超声提取，过滤，除去得到的滤液中的溶剂，得到peniroquesine A粗提物。

在本发明中，娄地青霉发酵物与醇的质量体积比为(30～80)g:(50～150)mL，更优选为40～60g:80～120mL，最优选为50g:100mL。本发明所述的醇优选为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。本发明采用醇为溶剂将抗炎化合物peniroquesine A从娄地青霉发酵物中分离出来。

在本发明中，所述超声时间优选为20～40min，更优选为30min；所述超声功率优选为250W～350W，更优选为300W。

本发明优选的采用减压蒸馏的方式去除滤液中的溶剂；具体的，本发明将滤液减压浓缩至无醇味。所述减压浓缩的压力为10～15kPa，优选为13kPa；所述减压浓缩的温度为48～55℃，优选为50℃。

得到所述peniroquesine A粗提物后，本发明将peniroquesine A粗提物纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesine A。具体的，本发明以硅胶柱色谱洗脱peniroquesine A粗提物，洗脱液经色谱纯化，得到抗炎活性化合物peniroquesine A。优选的，本发明采用凝胶柱色谱对洗脱液进行纯化。

本发明优选的采用梯度洗脱法洗脱peniroquesine A粗提物，所述洗脱剂优选为体积比100:0～20:1的氯仿-甲醇溶液。

具体的，本发明用氯仿-甲醇溶液将peniroquesine A粗提物溶解，与peniroquesine A粗提物干重质量0.8～1.5倍的硅胶混合，去除溶剂，装柱，依次用体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱，分别得到体积比为100:0、100:1、50:1、10:1、5:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分；取体积比为100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分，以体积比200:1～80:1的石油醚:丙酮为溶剂过硅胶柱层析洗脱，得到洗脱液。化合物peniroquesine A主要集中于选取的洗脱部分。

在本发明中，所述去除溶剂的方法为减压蒸馏法；所述减压浓缩的温度为48～55℃，优选为50℃。

在本发明中，所述用于溶解peniroquesine A粗提物的氯仿-乙醇溶液为任意体积比的洗脱剂。本发明优选的采用200-300目硅胶进行洗脱。

本发明对所获得的100:1的氯仿-甲醇溶液洗脱部分进行硅胶柱层析洗脱时，所述洗脱时的洗脱溶剂流速优选为2～4mL/min，更优选为3mL/min；所述洗脱溶剂优选为石油醚-丙酮体系。具体的，本发明采用硅胶柱层析对洗脱时，先用石油醚：丙酮(200:1)洗脱300mL以除去硅胶杂质，再用石油醚：丙酮(120:1)洗脱300mL以除去主点上方量较少的杂质，最后用石油醚：丙酮(80:1)洗脱约200mL目标化合物开始流出，继续用石油醚：丙酮(80:1)冲洗至目标化合物消失为止，将含目标化合物较纯的洗脱液合并。

得到所述洗脱液后，发明对所述洗脱液进行凝胶柱色谱纯化，得到抗炎化合物peniroquesine A。在本发明中，所述凝胶柱色谱优选为葡聚糖凝胶柱色谱。所述凝胶柱色谱纯化时的溶剂优选为甲醇。

经凝胶柱色谱纯化的溶剂优选为甲醇；本发明优选的采用葡聚糖凝胶柱对化合物进行纯化。所述甲醇流速优选为0.4～0.6mL/min，更优选为0.5mL/min。

本发明还提供了前述技术方案所述娄地青霉在制备抗炎药物中的应用，所述抗炎药物的活性成分包括抗炎活性化合物peniroquesine A。抗炎活性化合物peniroquesine A的结构及其制备方法不在赘述。

在本发明中，所述娄地青霉制备得到的抗炎药物中优选的包括质量百分数1～99％的抗炎化合物peniroquesine A，更优选为55～90％。本发明所述含有抗炎化合物peniroquesine A的抗炎药物中还可以包括一种或多种药用辅料，所述药物辅料包括药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂中的一种或多种，具体的可以包括药用防腐剂、抗氧化剂、填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂或等渗和吸收延缓剂等；所述药物载体包括但不限于脂质体、醇质体、聚合物胶束、纳米结构脂质载体、固体脂质纳米载体、介孔二氧化硅纳米粒等。

所述含有抗炎化合物peniroquesine A的药物采用本领域熟知的制备方法制成片剂、胶囊剂、溶液剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、针剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂或靶向制剂；具体的，所述片剂包括但不限于糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含片等；所述溶液剂包括但不限于注射剂、口服液；所述胶囊剂包括但不限于硬胶囊剂、软胶囊剂等。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1分离娄地青霉

将黄草乌根部洗净后置于质量分数50％的次氯酸钠溶液中浸泡1min，然后用灭菌后的UP水冲洗三遍，再置于75％的乙醇溶液中浸泡1min，取出后同样用灭菌后的UP水冲洗三遍，用滤纸将附子表面的水吸干。

将经过上述消毒处理的黄草乌根去皮，剪成长不超过5mm的碎根，将碎根按照5块/个接种于PDA平板上，封口膜将培养皿边缘封口，置于GSP-9160MBE隔水式恒温培养箱中28℃恒温培养孵化。

培养过程中每隔24h观察一次，将颜色形态纯正的菌落挑出置于新的PDA平板培养皿表面，划线纯化重复上述步骤，直到得到菌落形态单一的菌落为止。将菌落形态单一的菌株接种至PDA斜面培养基上25℃培养7d，观察菌落形态。

将收集得到的各单一形态菌落送至昆明硕擎生物科技有限公司进行鉴定，鉴定得到娄地青霉在4℃下保存备用。该娄地青霉于2017年7月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；生物保藏编号为CGMCC No.14140。

实施例2娄地青霉的菌落形态观察

将保藏编号为CGMCC NO.14140的娄地青霉接种于PDA培养基中，27℃恒温培养，分别在1d、3d、5d、7d观察菌落形态变化。

娄地青霉在PDA平板培养基上27℃培养，1d后在接种点正面可观察到有白色点状绒状菌丝体；培养3d后围绕着接种点成圆形直径约2cm的白色绒状体，菌落表面较为平坦，反面靠近中心部位为浅黄色，边缘为无色；培养5d后围绕着接种点成圆形直径约4cm的菌落，菌落表面有突起，菌落中心含绿色颗粒状，边缘为浅黄色绒状，背面为黄褐色，边缘无色；7d后菌落边缘为浅黄色绒状，其余为绿色，背面为黄褐色。

实施例3制备抗炎化合物peniroquesine A

1、菌种活化：将娄地青霉(保藏编号为CGMCC NO.14140)接种到PDA斜面培养基上，28℃恒温培养3～7d后，置于4℃冰箱中储存备用。

2、发酵培养基的制备：取洗净的土豆，分成直径1cm的土豆块置于组织培养瓶中，50g/瓶，组织培养瓶加盖后在120℃下高温灭菌30min，冷却，即得发酵培养基。

3、将步骤1活化的娄地青霉按照1％的接种量接种到步骤2制得的发酵培养基，加盖后在28℃下恒温培养30d，得到娄地青霉发酵物。

4、取50g步骤3得到的娄地青霉发酵物与100mL甲醇按照质量体积比混合，混合溶液在40kHz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压浓缩至无醇味，得到25.0g含peniroquesine A的粗提物。

5、用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液30mL溶解25.0g的peniroquesine A粗提物，再与25.0g硅胶(200目)混合，减压浓缩去除溶剂，装柱；依次以体积比100:0，100:1，50:1，10:1，5:1的氯仿:甲醇进行梯度洗脱，合并各洗脱段得到5个部分：Fr1～Fr5，取其中Fr2部分(100:1的氯仿；甲醇)；Fr2部分经硅胶柱层析，先用石油醚：丙酮(体积比200:1)洗脱300mL以除去硅胶杂质，再用石油醚：丙酮(体积比120:1)洗脱300mL以除去主点上方量较少的杂质，最后用石油醚：丙酮(体积比80:1)洗脱约200mL目标化合物开始流出，继续用石油醚：丙酮(体积比80:1)冲洗至目标化合物消失为止，将含目标化合物较纯的洗脱液合并，即得含有peniroquesine A的洗脱液。以甲醇为溶剂，对洗脱液进行葡聚糖凝胶柱色谱纯化，干燥，得到1.2g抗炎化合物peniroquesine A。

实施例4结构的鉴定

取实施例3制备得到的抗炎化合物peniroquesine A，通过1D/2D NMR(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)以及HR-ESI-MS(高分辨电喷雾电离质谱)鉴定得到的化合物peniroquesine A及其结构。

(1)peniroquesine A的HR-ESI-MS图谱见附图1，结果见附图2：

根据附图1和附图2所示可以看出该化合物的分子式为C₂₅H₄₀O₂(m/z:395.2923[M+Na]⁺,计算值：395.2926),不饱和度为6。

(2)1D/2DNMR检测的结果如附图3～7所示。

由附图3、4可以看出该化合物的¹H和¹³C NMR数据显示其含有一个双键(δ_H：5.57s,1H；δ_C：135.5d)，提示该化合物含有五个环。其¹³C NMR显示该化合物共有25个碳，包括6个CH₃(δ_C：14.0q,19.1q,21.0q,24.9q,30.6q,33.3q)，6个CH₂(δ_C：26.0t,31.0t,40.9t,42.7t,43.5t,45.5t)，8个CH(δ_C：40.0d,53.0d,54.6d,57.4d,58.7d,72.8d,75.0d,135.5d)和5个季碳(δ_C：43.7s,44.4s,48.3s,50.5s,147.9s)。

由HSQC谱(图6)可以得到化合物peniroquesine A的H和与之相连接的C的化学位移δ归属如表1：

表1化合物peniroquesine A的¹H NMR(600MHz)和¹³C NMR(150MHz)

由HMBC(图5)谱和¹H-¹H COSY谱(图7)中CH₃-20(δ_H 0.84s)与C-1(δ_C 40.0d)，C-2(δ_C 31.0t)和C-9(δ_C 48.3s)相关，CH₃-21(δ_H 0.95s)与C-1和C-9的相关表明CH₃-20与CH₃-21分别与C-1和C-9相连，¹H-¹H COSY谱中CH₃-20与H-1(δ_H 1.84s)，H-1与H-2(δ_H 1.39,d,J＝13.6Hz；1.97,d,J＝13.6Hz)，H-2与H-3(δ_H 1.89m)，H-3与H-4(δ_H 1.46m)，H-4与H-5(δ_H3.36m)，H-5与H-6(δ_H 0.91,d,J＝10.4Hz；2.19,d,J＝10.4Hz)，H-6与H-7(δ_H 2.40m)，H-7与H-12(δH 1.61s)，H-12与H-13(δ_H 1.30,d,J＝2.0Hz)的相关确定了C₍₂₀₎-C₍₁₎-C₍₂₎-C₍₃₎-C₍₄₎-C₍₅₎-C₍₆₎-C₍₇₎-C₍₁₂₎-C₍₁₃₎的连接骨架。HMBC谱中CH₃-21与C-4(δ_C 57.4d)的相关确定了C₍₄₎-C₍₉₎键的存在，CH₃-21与C-8(δ_C 147.9s)的相关确定了C₍₈₎-C₍₉₎键的连接，H-7与C-8和C-10(δ_C 135.5d)同时存在HMBC相关表明C-7(δ_C 53.0d)与双键碳C-8相连，至此确定了peniroquesine A的A环和B环。HMBC谱中CH₃-22(δ_H 1.13s)与C-10，C-11(δ_C 50.5s)和C-12(δ_C 54.6d)的相关确定了C₍₁₀₎-C₍₁₁₎-C₍₁₂₎的结构连接片段，至此确定了peniroquesine A的C环。HMBC谱中CH₃-23(δ_H 1.18s)与C-14(δ_C 43.7s)和C-13(δ_C 58.7d)的相关,确定了C₍₁₃₎-C₍₁₄₎键的存在，CH₃-24(δ_H 0.98s)和CH₃-25(δ_H 0.92s)与C-19(δ_C 44.4s)和C-13(δ_C 58.7d)的相关确定了C₍₁₃₎-C₍₁₉₎键的连接。同样，CH₃-24和CH₃-25与C-18(δ_C 40.9t)的HMBC相关，CH₃-23与C-17(δ_C 42.7t)的HMBC相关，H-17(δ_H 1.58,d,J＝8.0Hz；1.70,m)与H-18(δ_H1.47m)的¹H-¹H COSY相关，确定了C₍₁₉₎-C₍₁₈₎-C₍₁₇₎-C₍₁₄₎的连接骨架，至此确定了peniroquesine A的F环。CH₃-23与C-15(δ_C 45.5t)的HMBC相关，CH₃-22与C-16(δ_C 75.0d)的HMBC相关，以及H-17与H-18的¹H-¹H COSY相关，表明存在C₍₁₁₎-C₍₁₆₎-C₍₁₅₎-C₍₁₄₎的结构片段，至此确定了peniroquesine A的E环,至此也确定了该化合物的结构。

综上所述，可以确定实施例3制备得到的化合物peniroquesine A结构式为：

实施例5化合物peniroquesine A的抗炎活性

一氧化氮(nitric oxide，NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，产生NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。

(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(购自中科院上海细胞库)，用1μg/mLLPS进行诱导刺激，同时加入实施例3制备得到的化合物peniroquesine A处理，化合物peniroquesine A的终浓度依次为3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM和50μM五个梯度，每个梯度设置三个平行样，25℃条件下培养。

设置不含药物组和L-NMMA(总NOS抑制剂)阳性药物组按照上述相同步骤进行处理，作为对照。

(2)细胞过夜(10h)培养后，在570nm处检测各组的NO生成量；向过夜培养得到的培养液中加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物对细胞的毒性影响。

NO生成抑制率(％)＝(不含药物组OD_570nm-药物组OD_570nm)/不含药物组OD_570nm×100％；

IC₅₀(半数抑制浓度)按Reed&Muench法计算，得到化合物peniroquesine A的NO抑制活性的IC₅₀为：20.69±1.61μM。

经计算可知，在对化合物peniroquesine A的NO抑制活性(阳性对照为：L-NMMA)筛选试验中，化合物peniroquesine A对一氧化氮(NO)的生成表现出了明显的抑制活性，其半数抑制率(IC₅₀值)为：20.69±1.61μM。而阳性对照L-NMMA对一氧化氮(NO)的半数抑制率(IC₅₀值)为：32.88±2.59μM。化合物peniroquesine A对一氧化氮(NO)的生成抑制率要明显强于阳性对照L-NMMA。因此，peniroquesine A具有作为先导化合物开发抗炎药物的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的产生抗炎化合物peniroquesine A的方法，不仅可以现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期该抗炎化合物工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础，具有显著的应用价值。

实施例6

1、菌种活化：将娄地青霉(保藏编号为CGMCC NO.14140)接种到PDA斜面培养基上，28℃恒温培养3～7d后，置于4℃冰箱中储存备用。

2、发酵培养基的制备：取50g大米浸泡在40mL水中12h，取出大米置于组织培养瓶中，50g/瓶，组织培养瓶加盖后在120℃下高温灭菌30min，冷却，即得发酵培养基。

3、将步骤1活化的娄地青霉按照1％的接种量接种到步骤2制得的发酵培养基，加盖后在26℃下恒温培养25d，得到娄地青霉发酵物。

4、取45g步骤3得到的娄地青霉发酵物与120mL甲醇按照质量体积比混合，混合溶液在40kHz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压浓缩至无醇味，得到peniroquesine A粗提物。

5、用体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液30mL溶解25.0g的peniroquesine A粗提物，再与25.0g硅胶(300目)混合，减压浓缩去除溶剂，装柱；分别以体积比100:0，100:1，50:1，10:1，5:1的氯仿：甲醇进行梯度洗脱，合并各洗脱段得到5个部分：Fr1～Fr5，取其中Fr2部分(100:1的氯仿:甲醇)；Fr2部分经硅胶柱层析，先用石油醚：丙酮(体积比200:1)洗脱300mL以除去硅胶杂质，再用石油醚：丙酮(体积比120:1)洗脱300mL以除去主点上方量较少的杂质，最后用石油醚：丙酮(体积比80:1)洗脱约200mL目标化合物开始流出，继续用石油醚：丙酮(体积比80:1)冲洗至目标化合物消失为止，将含目标化合物较纯的洗脱液合并，即得含有peniroquesine A的洗脱液。以甲醇为溶剂，对洗脱液进行葡聚糖凝胶柱色谱纯化，干燥，得到抗炎化合物peniroquesine A。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种用于制备抗炎活性化合物peniroquesineA的娄地青霉及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。