专利摘要

本发明涉及一种来源于扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)的D‑乳酸氧化酶基因的获得及其克隆表达，属于生物工程领域。公开了其底物特异性，同时该D‑乳酸氧化酶可以氧化(R)‑α‑羟酸酯，可应用于光学纯(S)‑α‑羟酸酯的制备。

权利要求

1.一种来源于扩展短杆菌(Brevibacterium linens)的D-乳酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的D-乳酸氧化酶，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的D-乳酸氧化酶，其最适反应温度为40℃，最适反应pH为8。

4.根据权利要求1所述的D-乳酸氧化酶，可氧化D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素，生成对应的酮酸。

5.根据权利要求1所述的D-乳酸氧化酶，可氧化外消旋α-羟酸酯中的(R)-α-羟酸酯，拆分制备得到相应的光学纯(S)-α-羟酸酯及α-酮酸酯，所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、乳酸冰片酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。

说明书

技术领域

本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。

背景技术

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)

目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)

本发明首次从扩展短杆菌(Brevibacterium linens)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。

发明内容

本发明从扩展短杆菌(Brevibacterium linens)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。

本发明的技术方案如下：

1、菌株

本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Brevibacterium linens ATCC 8377，购自美国ATCC菌种库。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Brevibacterium linens ATCC 8377菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。

3、D-乳酸氧化酶表达与纯化

将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。

4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析

以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。

酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯

拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。

产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：

对映体过量值％e.e＝[(_SS-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R为反应后(R)-对映体的峰面积，S_S为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S₀为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。

产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。

所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。

所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本发表明的有益之处：从Brevibacterium linens ATCC 8377中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。

具体实施方式

实施例1

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。

1、Brevibacterium linens ATCC 8377DNA的提取

将Brevibacterium linens ATCC 8377菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。

2、大肠杆菌感受态制备

(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。

(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约0.6(约2～3h)。

(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。

(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。

(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物设计

设计引物序列为：

引物1：5'GCCGGGATCC ATGTTCGGACGACAGCGTCAGCACC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGACAGGCCCAGTTCTTGTGCGGTGAG 3'

(2)PCR扩增

用以上合成的两条引物，以Brevibacterium linens ATCC 8377的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

本步骤中扩增体系为：

扩增程序为：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环

72℃，10min

PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)双酶切和连接

将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。

(4)转化

步骤：

1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。

2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。

5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。

6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。

实施例2

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。

1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。

实施例3

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为8.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为40℃。

实施例4

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，40℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 8.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。

实施例5

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表2中。

表2 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性

实施例6

根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：

表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果

由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种氧化酶及其应用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> Brevibacterium linens ATCC 8377

<400> 1

atgttcggac gacagcgtca gcaccaatca caggcggtca gcgccttcat cgacatcatg 60

ggcagtcgtc atgtgctcac ctccgcccgg gcgacggagc ccttcgccaa aggcaatcgc 120

ttcggcggcg gcagtgtgct cgcggtcctc aagccgggca gccttgtcga tatgtggcgg 180

gctctgcagg tctgcgtcga tcacgatctc atcgtcatcc cacagtcggc gaacaccggc 240

ctgaccggag gttcgggtcc cggcgatcag gactacgatc gtgagatcgt catcatctcc 300

accctgcgca tcaaccagat ccatctcatc aacgatgctc gtgaggccgt gtgtctggcc 360

ggatccacgc tgtacgaact cgatgacaag ctggcacctc acgggcgtga acctcattcg 420

gtgatcggtt cgtcgtcgat cggtgcttcg gtcgtcggcg gcatcgcgaa caactccggc 480

ggcagccaga ttcgcaaggg cccggccttc acgaagcacg cgatcttcgc ccgggtcgat 540

gacgagggca aggtcgaact cgtcaatcac ctgggcatca gcctcggcga tgatccggcc 600

catatcctcg acagactcca acgcggcgaa tgggacgaag ccgatgtcac gccgcccccg 660

gaagacagtc tcgataccga atacagcgag cacgtccgcg aaatcaccga ttctcctgcc 720

cgctacaacg ccaacccgaa gttcctccac gaggcgtcag ggtcggccgg caagctcatg 780

gtcttcgccg tgcgcacgcg gaccttcccc aagcagaagg attcgacgac cttctacgtg 840

ggcaccaaca gccccgccga gctcgaggcc ctgcgccggg cgatcctgac ttcggacatg 900

ccgctgccga tctccggtga gtacatggga cggccctcct tcgaccttgc cgagaagtac 960

ggcaaggaca cgttcgtctc cgtcaagcac gccggcagcc gcgaacagat caagctcttc 1020

gcgttgaaga actgggcgaa cggggtgttc gcgaagctgc ccttcttcgg acagaccgtt 1080

gccgattcca ttgcgcaggg tgccttcagc ttgctgccgc agcagctgcc ggaccgcatg 1140

cttgagtacc gcgatcgctt tgaacaccat ctgctcctcg tcgtcagcgg cgaccagaag 1200

cagaggaccg aggagttcct cacgaccttc ttcgccgagg tggggcatga cggtgacttc 1260

ttcatctgca ctgccgatga agctcagtcc gccatgctcc accgcttcgg tgccgccagt 1320

gccgccacac gctacttcaa tctccaccgt gacgagtcct cggagatgat caccttcgac 1380

gttgcgctga cacgcgatga cgaggattgg ctcgaggtgc tgccaacgga gatctcagac 1440

cagctgcaca tcagttccta ttacggccac ttcttctgcc acgtcctcca tcaggaccat 1500

gtggcgaaga agggtgttga cccggtggcg ttgaaaaagc agatgatggc gctgctcgag 1560

gaacgtggag ccgccgtgcc cgccgagcac aactatggtc gcctctacca ggtgcctccg 1620

gagatggagg ctcacttcaa ggagctcgac ccgtgcaacg tcttcaaccc gggggtcggc 1680

gagacctcac cgcacaagaa ctgggcctga1710

<210> 2

<211> 569

<212> PRT

<213> Brevibacterium linens ATCC 8377

<400> 2

Met Phe Gly Arg Gln Arg Gln His Gln Ser Gln Ala Val Ser Ala Phe

1 5 1015

Ile Asp Ile Met Gly Ser Arg His Val Leu Thr Ser Ala Arg Ala Thr

202530

Glu Pro Phe Ala Lys Gly Asn Arg Phe Gly Gly Gly Ser Val Leu Ala

354045

Val Leu Lys Pro Gly Ser Leu Val Asp Met Trp Arg Ala Leu Gln Val

505560

Cys Val Asp His Asp Leu Ile Val Ile Pro Gln Ser Ala Asn Thr Gly

65707580

Leu Thr Gly Gly Ser Gly Pro Gly Asp Gln Asp Tyr Asp Arg Glu Ile

859095

Val Ile Ile Ser Thr Leu Arg Ile Asn Gln Ile His Leu Ile Asn Asp

100 105 110

Ala Arg Glu Ala Val Cys Leu Ala Gly Ser Thr Leu Tyr Glu Leu Asp

115 120 125

Asp Lys Leu Ala Pro His Gly Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Ile Gly Ala Ser Val Val Gly Gly Ile Ala Asn Asn Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Ile Arg Lys Gly Pro Ala Phe Thr Lys His Ala Ile Phe

165 170 175

Ala Arg Val Asp Asp Glu Gly Lys Val Glu Leu Val Asn His Leu Gly

180 185 190

Ile Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ala His Ile Leu Asp Arg Leu Gln Arg

195 200 205

Gly Glu Trp Asp Glu Ala Asp Val Thr Pro Pro Pro Glu Asp Ser Leu

210 215 220

Asp Thr Glu Tyr Ser Glu His Val Arg Glu Ile Thr Asp Ser Pro Ala

225 230 235 240

Arg Tyr Asn Ala Asn Pro Lys Phe Leu His Glu Ala Ser Gly Ser Ala

245 250 255

Gly Lys Leu Met Val Phe Ala Val Arg Thr Arg Thr Phe Pro Lys Gln

260 265 270

Lys Asp Ser Thr Thr Phe Tyr Val Gly Thr Asn Ser Pro Ala Glu Leu

275 280 285

Glu Ala Leu Arg Arg Ala Ile Leu Thr Ser Asp Met Pro Leu Pro Ile

290 295 300

Ser Gly Glu Tyr Met Gly Arg Pro Ser Phe Asp Leu Ala Glu Lys Tyr

305 310 315 320

Gly Lys Asp Thr Phe Val Ser Val Lys His Ala Gly Ser Arg Glu Gln

325 330 335

Ile Lys Leu Phe Ala Leu Lys Asn Trp Ala Asn Gly Val Phe Ala Lys

340 345 350

Leu Pro Phe Phe Gly Gln Thr Val Ala Asp Ser Ile Ala Gln Gly Ala

355 360 365

Phe Ser Leu Leu Pro Gln Gln Leu Pro Asp Arg Met Leu Glu Tyr Arg

370 375 380

Asp Arg Phe Glu His His Leu Leu Leu Val Val Ser Gly Asp Gln Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Glu Glu Phe Leu Thr Thr Phe Phe Ala Glu Val Gly His

405 410 415

Asp Gly Asp Phe Phe Ile Cys Thr Ala Asp Glu Ala Gln Ser Ala Met

420 425 430

Leu His Arg Phe Gly Ala Ala Ser Ala Ala Thr Arg Tyr Phe Asn Leu

435 440 445

His Arg Asp Glu Ser Ser Glu Met Ile Thr Phe Asp Val Ala Leu Thr

450 455 460

Arg Asp Asp Glu Asp Trp Leu Glu Val Leu Pro Thr Glu Ile Ser Asp

465 470 475 480

Gln Leu His Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly His Phe Phe Cys His Val Leu

485 490 495

His Gln Asp His Val Ala Lys Lys Gly Val Asp Pro Val Ala Leu Lys

500 505 510

Lys Gln Met Met Ala Leu Leu Glu Glu Arg Gly Ala Ala Val Pro Ala

515 520 525

Glu His Asn Tyr Gly Arg Leu Tyr Gln Val Pro Pro Glu Met Glu Ala

530 535 540

His Phe Lys Glu Leu Asp Pro Cys Asn Val Phe Asn Pro Gly Val Gly

545 550 555 560

Glu Thr Ser Pro His Lys Asn Trp Ala

565

一种氧化酶及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。