专利摘要

本发明公开了一种其上设置有定位分子的器件及其制备方法。制备具有选定的活性化学区域的基板的方法，该方法包括采用有助于活性化学基团定位在基板期望区域中的基板元件。该方法可包括用于对选定区域中的化学基团进行沉积、去除、激活和/或灭活的光学、化学和/或机械过程，以提供选择的基板活性区域。

说明书

技术领域

本发明涉及产生具有选定的活性化学区域的基板的方法，通过利用基板的各元件来帮助活性化学基团在期望的基板区域中的定位。描述了各种方法，包括用于沉积、去除、激活和/或灭活在基板选定区域中的化学基团的光学、化学和/或机械过程，以提供基板的选定活性区域。

背景技术

许多分析操作都会受益于对单个分子、相对少量分子、或较低浓度分子的反应进行分析的能力。已描述了许多方法用于提供这些散在的反应混合物。例如，在核酸测序领域，许多研究者建议联合聚合酶的作用下的核酸的模板依赖性合成，由单个分子或低浓度方法来获取序列信息。

这些测序技术的各种不同方法提供了一次监测仅仅一种或很少的合成反应的不同方法。例如，在一些情况下，将反应混合物分配成包含低浓度反应物的液滴。在其他应用中，将一些反应物固定在表面上，从而监测它们而不会受到溶液中其他反应组分的干扰。在另一种方法中，采用光学限制技术，在光限制区域内，仅由相对少量的反应(例如单个分子)来探究信号信息。尽管可获得上述技术，仍然存在需要进一步提高用于分析的反应组分的选择性的情况。本发明满足了这些和许多需要。

发明内容

本发明一般提供了在基板的选定区域内提供功能性表面修饰(例如活性化学基团)的方法，提供了由此制备的基板以及这种基板的应用。

第一方面，本发明提供了制备其上具有选定活性区域的基板。该方法包括提供其上具有许多纳米结构的基板，其中，每个纳米结构限制第一激活控制剂在基板表面的选定部分上提供活性化学基团的能力。然后使该基板与至少第一激活控制剂接触，以在基板表面的选定部分上选择性地提供活性化学基团。活性化学基团包括例如化学官能团，活性分子(例如酶)以及偶联基团或结合基团。

在另一相关方面，本发明提供了制备其上具有选定活性区域的分析用基板的方法。该方法包括提供其上设置有光学分析结构的基板，所述光学分析结构提供通往基板选定区域的增强的光学通路。然后提供能够通过第一电磁辐射被激活或灭活的表面官能团，所述电磁辐射导向基板，从而使光学分析结构介导电磁辐射，以选择性地激活或灭活在基板选定区域中的表面官能团以选择性地提供基板活性区域。

本发明另一方面的特征在于提供一种方法，该方法提供活性化学表面基本上在波导的底部的零模式波导。该方法包括提供设置在基板中的零模式波导，提供在零模式波导表面上的化学官能团，以及使零模式波导表面上的第一部分而非第二部分与激活控制剂接触，所述激活剂选择性地激活或灭活在第一部分上的化学官能团，以提供基本上在零模式波导底部的活性化学表面。

本发明还提供了采用这种方法制备的基板和装置，其包括零模式波导阵列，该阵列包括许多位于包层中的零模式波导芯体以及基本上只位于芯体中的化学活性表面，所述各芯体具有底面。

本发明还提供了产生其上设置有选定活性区域的基板的方法，该方法包括提供其上具有光学增强结构的基板，所述光学增强结构能够导入电磁辐射，以在基板的选定区域近端提供增强的电磁场，足以在选定区域近端产生俘获力(trapping force)。电磁辐射导向基板以在选定区域提供增强的电磁场，该电磁场足以对选定区域近端的活性分子产生俘获力。然后活性分子偶联于该选定区域。

本发明还提供了制备其上设置有选定活性区域的基板的方法，该方法包括提供表面具有化学官能团和许多离散的纳米级反应区域的基板，和使一个或多个化学官能团或激活控制剂在选定区域的表面上图案化，以提供基本上仅在离散的纳米级反应区域中的化学功能性区域。

本发明的另一方面提供了鉴别核酸分子序列的方法。该方法包括在基板上的离散观察区域内提供多种核酸聚合酶/模板/引物复合物，以及以模板依赖性方式检测核苷酸或核苷酸类似物的序列增加，以鉴别结合到多个观察区域中的核苷酸或核苷酸类似物的序列。在该方法中，基板被构造成能显著减少观察区域之外的区域中的聚合酶活性、聚合酶存在、模板存在及引物存在中的一种或多种情况。

相关地，本发明提供了鉴别核酸分子序列的方法，该方法包括在基板表面离散的观察区域内提供多种核酸聚合酶/模板/引物复合物，以及以模板依赖性方式检测核苷酸或核苷酸类似物的序列增加，以鉴别结合到多个观察区域中的核苷酸或核苷酸类似物的序列。在该方法中，基板表面上至少第一和第二离散观察区域之间提供观察区域内屏障，以基本上避免一种或多种反应物或产物在观察区域内扩散。

本发明还提供了使期望的分子优先定位在基板上设置的光限制区内的方法。该方法包括将期望的分子沉积在基板表面上，和选择性地去除不在光限制区内的基板表面上的期望分子。一方面，基板包括不透明(非透明性)层和透明层，光限制区包括设置穿过不透明层至透明层的零模式波导。

从基板不在光限制区内的表面选择性地去除期望分子任选地包括使所述基板与偶联排他性组分(exclusionary component)的灭活组分相接触，所述排他性组分至少部分地被排斥而不能进入光限制区。灭活组分去除可从表面(例如零模式波导芯体的上表面和上壁)接近的分子；由于排他性组分而不能进入光限制区，或光限制区实体。

在一类实施方式中，灭活组分包括酶，例如蛋白酶(例如非特异性和位点特异性蛋白酶)、核酶或糖酶。排他性组分任选地是大颗粒如珠、大分子、或刚性或半刚性的长形聚合物。在一类实施方式中，排他性组分包括双链核酸分子，例如偶联于蛋白酶灭活组分的双链DNA分子。

能选择性地固定的期望分子可以是基本上任何分子，例如活性分子如酶(例如，核酸聚合酶)或包含结合或偶联部分的分子(例如生物素分子)，又可利用这些分子来固定其他分子。

进一步提供了将分子定位到设置在基板上的光限制区内的方法，该方法包括在基板表面上，包括光限制区内提供光活化的偶联基团。然后使活化辐射导向基板，其中，光限制区使活化辐射仅入射在光限制区内。然后，分子与光活化偶联基团偶联。

本发明的另一方面提供了将感兴趣的分子选择性地固定在基板上的方法。该方法包括：提供基板，它具有第一表面组分和第二表面组分，所述第一和第二表面组分具有不同的表面特征，以及基于第一表面组分的表面特征与第二表面组分的表面特征之间的差异，使感兴趣的分子选择性地偶联于第一表面组分。

在一类实施方式中，不同的表面特征包括表面电荷或表面上的静电相互作用。例如，第一表面组分具有或获得负表面电荷，而第二表面组分为正表面电荷(反之亦然)。另一个例子中，表面组分具有不同的表面化学吸附特征；例如，第二表面组分对特定基团(例如，膦酸盐/酯(phosphonate)或磷酸盐/酯(phosphate)基团)具有强化学亲和力，而第一表面组分对该基团没有强的亲和力。

可采用该方法将感兴趣的分子选择性地固定在诸如ZMW或其他复合基板(hybrid substrate)上。因此，例如，基板可任选地包括在第一表面组分层上的第二表面组分层，设置的零模式波导穿过第二表面组分层到达第一表面组分层。在这种实施方式中(及其他)，第一表面组分可包括SiO₂和/或第二表面组分可包括金属或金属氧化物(例如，铝或氧化铝)。在复合基板与溶液相接触的实施方式中，基板可包括：第一表面组分和/或第二表面组分，第一表面组分的材料的零电荷点在溶液的pH以下(例如，SiO₂的pH＞2)，第二表面组分包括金属氧化物，其零电荷点在溶液的pH之上(例如氧化铝pH＜8；中性pH下带正电的其他金属氧化物，包括但不限于：氧化铊、氧化铁、氧化钇、氧化锌、氧化镧和氧化镁)。

在某些实施方式中，感兴趣的分子优选与第一表面组分缔合。例如，正电荷的聚合酶分子优先与负电荷硅酸盐缔合而不是正电荷金属表面。在其他实施方式中，基板与第一组合物相接触，基于第一和第二表面组分的表面特征之间的差异，第一组合物选择性地与第一表面组分缔合。第一组合物可起阻断作用，或者它可直接或间接与感兴趣的分子缔合。因此，例如，在一类实施方式中，第一组合物包含第一偶联基团，使感兴趣的分子选择性地偶联于第一表面组分包括使感兴趣的分子与第一偶联基团(例如，化学官能团、结合基团如生物素等)偶联。

在一类实施方式中，第一组合物包含硅烷，例如用于选择性地与硅酸盐第一表面组分缔合。示例性的硅烷包括但不限于生物素-PEG-硅烷。在另一类实施方式中，第一组合物包含磷脂。在另一类实施方式中，第一组合物包含多聚赖氨酸-PEG或多聚赖氨酸-PEG-生物素。

该方法任选地包括使基板与第二组合物相接触，根据第一表面组分和第二表面组分的表面特征之间的差异，第二组合物选择性地与第二表面组分缔合。用第二组合物处理可任选地在使感兴趣的分子与第一表面组分偶联之前或之后进行，包括用任何第一组合物处理之前或之后。在一些实施方式中，第二组合物包含通常不同于任何第一偶联基团的第二偶联基团。示例性的第二组合物包括例如聚电解质和聚电解质-PEG-共聚物。该方法任选地包括在第二表面组分上沉积聚电解质的多层。

其他示例性的第二组合物包括包含一种或多种膦酸或一种或多种磷酸盐/酯基团的化合物。例如，第二组合物可包含聚乙烯基膦酸；2-羧乙基膦酸；氨基三(亚甲基膦酸)；1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸；六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)；二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)；乙二胺四(亚甲基膦酸)；二(六亚甲基三胺五(亚甲基膦酸))；2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸；或单乙醇胺二膦酸酯。作为其他例子，第二组合物可包括磷酸烷基酯或膦酸烷基酯，例如辛基膦酸、癸基膦酸、十二烷基膦酸、十六烷基膦酸、十八烷基膦酸、二十二烷基膦酸、羟基-十二烷基膦酸、羟基-十一烷基-膦酸、癸二基二(膦酸)、磷酸十二烷基酯或羟基-磷酸十二烷基酯。

这两种表面组分可通过不同组合物进行差异性改性。因此，在一类实施方式中，该方法包括使基板与能够选择性地缔合第一表面组分的第一组合物接触，并使感兴趣的分子偶联于第一组合物，以使感兴趣的分子与第一表面组分选择性地偶联，和使基板与能够选择性地缔合第二表面组分的第二组合物相接触(在感兴趣的分子偶联或第一组合物沉积之前或之后)。

在另一方面，本发明提供了将感兴趣的分子选择性地沉积在基板的选定区域上的方法，该方法包括提供具有第一组分和第二组分的基板，第一组分包括导电材料，第二组分包括绝缘体；和对第一组分施加电势以增加或减少感兴趣的分子与第一组分表面的缔合。

附图说明

图1显示了应用中的零模式波导(ZMW)的示意图。

图2提供了本发明光导向表面活化过程的示意图。

图3提供了在光限制区如ZMW的光学相关部分中提供活性表面的过程是示意图。

图4提供了两个独立的活化阶段中，表面活性水平随距ZMW底面的距离变化的模拟图。

图5提供了使用两步活化过程的交替光活化方案的示意图。

图6提供了在限制结构内提供活性表面的扩散限制性过程的示意图。

图7提供了在基板的非相关表面上提供印刷的掩蔽层的过程的示意图。

图8提供了从基板表面的非相关部分除去活性基团的光致开裂过程的示意图。

图9示意性地显示了从基板表面的非相关部分除去感兴趣的分子的基于尺寸排阻颗粒的过程。

图10显示了使用电驱动系统来选择性固定感兴趣的分子。

图11示意性地显示了使用夹带基质(entraining matrix)然后通过顶离(lift-off)发射技术从基板的非相关表面除去分子的过程。

图12显示了具体使用尺寸排阻颗粒过程的本发明选择性固定过程的效果。

图13示意性地显示了使用交替排他性过程来选择性定位分子的过程。

图14示意性地显示了使用排他性过程来选择性定位分子的示例过程，其中，位点特异性灭活组分从基板去除感兴趣的分子。

图15示意性地显示了使用排他性过程来选择性定位分子的示例过程，其中，位点特异性灭活组分从基板去除偶联部分。

图16示意性地显示了利用复合基板如ZMW中不同材料的不同表面特征并用PE-PEG共聚物钝化来选择性固定感兴趣的分子。

图17示意性地显示了聚电解质多层的形成。

图18示意性地显示了利用复合基板如ZMW中不同材料的不同表面特征并用聚电解质多层钝化来选择性固定感兴趣的分子。

图19显示了核苷酸类似物与聚电解质多层处理和等离子体-PDMS处理(非偏置处理)表面结合的比较。

图20显示了聚合酶与聚电解质多层处理的和未处理的铝表面结合的比较。

图21显示了具体使用选择性硅烷化和聚电解质多层钝化过程的本发明选择性固定过程的效果。

图22显示了具体使用选择性硅烷化和聚电解质多层钝化过程的本发明选择性固定过程的效果。

图23显示了中性亲和素(neutravidin)涂覆的荧光珠与经膦酸酯-处理的ZMW和未处理的ZMW结合的比较。

图24显示了核苷酸类似物与经膦酸酯-处理的ZMW和未处理的ZMW结合的比较。

示意图不是按比例绘制的。

具体实施方式

I.本发明的一般描述

本发明一般涉及在基板上或设定容积内的预先选择的位置或区域中提供期望分子的方法和过程，涉及该方法或过程制备的制品，具体地，涉及光限制区内期望的低浓度或单个分子。在特别优选的方面，本发明涉及使单个分子定位在特定空间或容积内的方法，从而利用分子的空间个体性，例如化学、光学、电学等性质。本发明还提供了由上述过程制备的基板、装置、接受器等，例如光限制区。虽然本发明的方法可广泛地用于在多种给定的期望空间或容积类型的任一种内提供单个分子，在特别优选的方面，该方法可用于使期望分子(例如酶)选择性地沉积或固定在光限制区的光可到达部分，特别是零模式波导(ZMW)内。

通常，可采用光限制区从只有非常小的空间或体积提供电磁辐射或产生这种辐射。这种光限制区可包括结构限制区，例如孔、凹陷、管等，或者它们可包括结合其他组分的光过程，以向只有非常小的体积提供光照或从只有非常小的体积产生发射的辐射。这种光限制的例子包括使用如基于光系统的全内反射(TIR)的系统，从而将光以一定角度导向通过透明基板，在基板内产生全内反射。虽然产生TIR，但还有一些小部分的光将穿透基板外表面，并根据距基板表面的距离而快速衰减，导致在表面上非常小体积的光照。类似地，可采用ZMW结构，该结构利用沿包层设置的窄芯体，例如10-100纳米，所述芯体的尺寸能够避免期望的电磁辐射传播通过芯体。结果，辐射从芯体开口处起只透入芯体中非常短的距离，因而仅仅光照在芯体内非常小的体积。考虑了许多其他的光限制技术，包括例如通过尖锐金属尖端的场增强，纳米管限制区、薄狭缝限制区、近场共振能传递限制区、近场孔限制区、衍射限制的光限制区和刺激发射损耗限制区，以及在待批的美国专利申请序列第10/944,106号和第09/572,530号以及美国专利6,917,726中描述的所有其他限制区，这些申请的内容全文纳入本文作为参考。

零模式波导(ZMW)的一般特征在于，存在被包层包围的芯体，其中，芯体的尺寸能够阻止显著量的超出截止频率的电磁辐射传播通过芯体。结果，当用频率低于截止频率的光进行光照时，光仅能透入芯体中很短的距离，只能对芯体体积的小部分进行有效光照。根据本发明，芯体包括被包层包围的空的空穴或优选填充流体的空穴。该芯体提供其中可发生化学、生物化学和/或生物学反应的区域或体积，特征在于具有极小的体积，并且在一些情况下足以包括仅仅单个分子或一组反应分子。ZMW、其制造、结构以及在分析操作中的应用的详细内容参见美国专利6,917,726和Levene等人的Science 299(5607)：609-764(2003)，其全部内容纳入本文作为参考。

在ZMW及其他光限制内的化学和生物化学分析的情况下，显然需要确保关注的反应在所述限制的光学询问部分内以最小程度进行，优选在单独的限制的询问部分内仅进行单个的反应。通常可采用许多方法在观察容积内提供单独的分子。2005年9月30日提交的美国专利申请第11/240,662号描述了许多这种方法，其内容被纳入本文作为参考，该申请描述了设计改性的表面，将单独的分子以所需密度固定到表面上，使大约一个、两个、三个或一些其他选定数量的分子能够落在指定的观察体积内。典型地，这类方法采用稀释技术，在表面上提供相对低密度的偶联基团，即通过稀释表面上的这些基团或者稀释与关注的分子相互作用的中间基团或最终偶联基团，或者这两种方式的组合。

在一些情况下，还希望从观察体积外的其他区域，例如观察体积之内和之外在总的基板外壳ZMW上、包层上等减少或者甚至消除关注的反应。具体说，在询问范围之外的反应可能影响关注的反应或该对反应的监测，这种影响是通过反应物的损耗影响反应动力学，增加产物浓度，有利于信号本底噪声能级发生的，例如通过产生产物或消耗反应物，这样可能干扰被询问的反应，或者提供扩散进入或者离开波导的询问区的过度可检测的背景产物水平。因此，将反应组分选择性和优选沉积和/或固定在观察区内对本发明尤其有益。这些通常适合用作上文所述的低浓度沉积方法的替代方式，优选用作除该方法之外的额外方式。在上述内容中，感兴趣的分子可优先位于特定区域中，或基本上定位在给定的区域中。应理解，使用该术语优先表示该分子以超过非优先定位的其他位置的浓度或表面密度定位在给定位置中。因此，第一区域中给定分子的优先固定表示该分子在该区域中的密度或浓度比其他区域更高。这些区域中的密度比其他区域中的浓度或密度高20％以上、30％以上、50％以上、100％以上、或高达200％、一直到1000％或更高，在一些情况下，在100倍以上、1000倍以上或更高。类似的涵义通常适用于表示给定分子基本上仅位于给定区域中。

例如在用于单个分子酶分析的ZMW的情况下，希望在波导光照区内提供单个酶分子，优选在波导的底部或底面上。如上所述，进一步希望确保除底面之外的其他表面上，例如芯体的壁和/或不是芯体部分的包层表面上等不存在额外的酶分子。

本发明方法制备的基板尤其有价值的应用是在称为“单个分子测序应用”的过程中。通过例子的方式，监测模板核酸、引物序列和聚合酶的复合物，基于单个分子，观察新生链的模板依赖性合成过程中每个额外的核苷酸的结合。通过鉴别各个增加的碱基，可鉴别模板中的互补碱基，因而读取该模板的序列信息。在ZMW的情况下，在ZMW观察体积内提供单独聚合酶/模板/引物复合物。随着四种标记(例如荧光)的核苷酸或核苷酸类似物中的每一种掺入合成链，通过相关的光学检测系统将观察到这种核苷酸或核苷酸类似物上标记的延长存在。这种测序过程和检测系统在2005年8月11日提交的美国专利申请第2003/0044781号和待批的美国专利申请第11/201,768号中描述，将其全部内容纳入本文作为参考。认为单个分子的测序应用将受益于本文所述的方法，所述方法包括将聚合酶、模板或引物或这些物质中的任一种或所有物质的复合物优先选择性地固定在基板的选定区域内，和/或基本上不在基板的其他部分上。

通常，在给定位置，例如ZMW的光照体积内，选择性提供感兴趣的分子可采用加法或减法过程来实现。加法过程通常表示，将单个分子定位或沉积在期望的位置上而不是其他位置。相反，减法过程表示，感兴趣的分子无所不在且非选择性地沉积在(例如)整个基板表面上，然后从不期望的位置选择性地去除感兴趣的分子。虽然这些描述提供了描述各种过程的便利，但应理解，一个过程的结果与另一过程的结果没有区别。还应理解，许多过程可包括加法、减法或这两种方法所述的步骤。虽然一般在酶或其他大分子基团的定位方面进行描述，但为本发明的目的，感兴趣的分子可以是希望提供空间个体性或提高定位的各种不同的官能性分子中的任一种。这些基团包括活性分子，例如催化分子如酶，而且包括具有更多钝态官能的分子，例如非催化基团，例如结合或偶联基团、疏水或亲水基团、结构增强基团如促进粘合的基团、可活化或可灭活的基团等。结合或偶联基团可包括小分子偶联基团或者它们可包括大分子偶联基团，例如抗体、抗体片段、特异性结合对如亲和素/生物素、结合肽、凝集素、互补核酸、或各种其他结合基团中的任一种。催化活性分子通常包括希望具有空间个体性的催化活性分子，例如用于单个分子分析中等。

至少一方面，本发明涉及提高离散反应区和/或观察区域的隔离。这不仅提供了这些区域间的光学隔离，而且提供了这些区域的化学隔离和/或环境隔离。广义上，这可通过在反应区域和/或观察区域之间提供阻挡或区域来实现，可以基本上防止反应物和/或产物从特定反应区外扩散进入并且潜在地干扰特定反应区内进行的反应，或者该区域的观察。提供必要隔离时，关注以下一点或两点：(1)在相邻反应区/观察区域之间提供足够的分离/隔离；和(2)从相邻区域间的间隔内消除任何潜在的干扰组分，例如清除该间隔内的任何反应物、产物和/或酶，并在观察区之间产生一种“非武装区域(demilitarizedzone)”。

提供增强的隔离通常涉及在观察区之间提供一定形式的阻挡。通常，这种阻挡可简单地包括在流体系统中的足够的距离，使反应物和产物不能从一个反应区扩散进入特定的观察区域，不论反应是在观察区域附近或是位于其他一些位置。提供的距离可跨平面基板或者可以通过在基板上提供结构化或轮廓化的表面来增加有效扩散距离。例如，在尤其优选的方面，可以在纳米孔内提供离散反应区/观察区域，以有效增加所述区域间的距离，并且处理或产生这种基板，以降低或消除选定区域之间的间隔或区域中，例如纳米孔底面处或面向纳米孔底面之外的表面中存在或正在产生的任何反应物和/或产物。

II.加法过程

如上所述，在至少一个方面，采用加法过程来提供本发明期望的固定化分子。该加法过程通常依赖于在期望位置选择性地提供结合或偶联基团，然后使感兴趣的分子沉积。同样，沉积也可以是加法或减法过程的结果。

至少在第一方面，本发明加法过程通常包括使偶联基团沉积在基板表面上，偶联基团只在表面的期望的区域内(例如光限制如ZMW的观察区域内)选择性地结合感兴趣的分子。官能基团(包括可活化的官能团)与表面的偶联通常可通过本领域已知的各种方法中的任一种来实现。例如，在基于二氧化硅的基板的情况下，例如玻璃、石英、熔融二氧化硅、硅等，可利用充分表征的硅烷化学将其他基团偶联于表面。这些其他基团包括官能团、可活化的基团和/或这两种基团任一个的连接分子、或意图用于表面最终应用中的实际感兴趣的分子。在其他基板类型例如聚合物材料、金属等的情况下，可采用其他过程，例如使用杂化聚合物表面，该表面具有与其偶联或从其延伸的官能团，使用如具有与其偶联的官能团的共聚物、金属缔合性基团(即螯合剂)、巯基化合物等。

至少在本发明的第一方面，仅在期望的区域内提供感兴趣的分子的偶联通常是通过以下方式进行，即提供与整个基板的表面偶联的可活化的偶联基团，该基团只在期望的区域内选择性活化，或者使用可选择性灭活的偶联基团并在除期望区域之外的所有区域内选择性地灭活该基团。只在期望的区域选择性地提供活性偶联基团的方式，使感兴趣的分子能够基本上仅在期望区域内选择性地沉积和偶联。为了便于描述，对于给定应用希望选择性地提供感兴趣分子的表面或基板部分在这里称为“期望的区域”，而这些区域之外的区域则称为非期望区域。这种期望和非期望的区域可包括平面或者可包括三维结构，如孔、凹陷、表面不规则、支柱、柱、沟渠、凹槽、通道、毛细管、多孔材料等。

许多不同的可活化偶联基团可与本发明该方面联用。通常，这些基团包括用可选择性去除的基团封端或保护的偶联基团。这些基团包括热可变基团，例如不耐热的保护基团，化学可变基团，例如酸或碱不稳定的保护基团，以及光可变基团，例如光分解或可去除的保护基团。

对在例如非期望区域中的偶联基团灭活包括使用可直接选择性灭活的基团，例如通过使用能俘获官能团或导致官能团去除的热、化学或光诱导的化学，即通过光诱导的交联、光致裂解等。或者，在某些优选的方面，这种灭活方法采用选择性活化在非期望区域中的偶联基团，然后用中性或惰性的封闭基团(blocking group)例如基本上不能与感兴趣的分子偶联的基团，或者中间连接分子来保护或封端所得活性偶联基团，然后在偶联条件下使所述基团偶联于期望的区域。这种随后加入的封闭基团是不可逆的或是可逆的。然而，这种封端的可逆性如果存在，通常将涉及不同于潜在的可活化偶联基团的机制，以避免在非期望区域中的封端基团再活化，同时活化期望的区域中潜在的可活化基团。例如，采用光活化方案来选择性地激活在期望的区域中的基团时，应用于非期望区域的封端基团通常不会光活化，或因为应用中表面接触的任何条件而活化。

将非期望区域中的偶联基团封端之后，期望的区域或感兴趣的区域内的偶联基团可选择性地活化而与感兴趣的分子偶联。为了便于讨论，无论光活化涉及封闭基团的光致裂解还是通过改变化学结构而不去除较大的封闭基团本身，例如导致改性的基团或其他基团的加入，来实现光活化，在这里都将通常称为活化，例如光活化。

在至少一个尤其优选的方面，使用光致活化的偶联基团以将感兴趣的分子选择性地沉积在期望区域中，例如采用能够用光不稳定的保护基团封端的化学活性偶联基团。这种光致活化的偶联机制尤其适用于采用光限制的系统，使得用于观察最终关注的反应和用于活化偶联基团的光只能照射在期望的区域，例如最接近芯体开口处的ZMW区域，光通过该开口光照该芯体。具体说，因为导向ZMW的激活光将只能照射有限的区域，例如光照区，所以感兴趣的分子将基本上只在光照体积内选择性地偶联。需要重申的是，相同的光限制效应过去仅用于监测光照体积的小限制区(在设置ZMW的可应用的分析操作中通常基本上限定出的观察区)内的反应，类似地只允许在ZMW的相同限制体积或部分内的活化(及后续偶联)。应理解，通过调制活化辐射，可以将活化期间的光照体积进一步控制在比应用期间的光照体积要小的体积。具体说，通过应用较低能量的光照，采用比光照/问询光更长波长的活化光，可以对光照的分子进行光照、活化，并使其只偶联于在最终的应用中最终位于光照体积内的表面子集。

在本发明的许多具体方面，通常优选采用能使电磁辐射选择性地导向期望区域的基板，在该基板的最终应用方面，例如在这些基板上查询化学、生物化学和/或生物学反应，以及提供选择性活化表面用于感兴趣的分子在所述分析期间选择性地固定在利用区域。总之，采用最终应用中使用的基板的基础功能，并利用该功能来改善所述应用中基板的制造和加工。在定向辐射的内容中，使用相同的辐射导向性质，对用于使辐射聚焦在期望区域以查询该区域内的反应的基板进行产率，使该期望的区域选择性地功能化。

根据后续沉积在基板上和偶联于基板的感兴趣的分子的性质，本发明可使用许多不同的偶联基团。例如，偶联基团可包括功能性化学部分，例如胺、羧基、羟基、巯基、金属、螯合剂等。可选地或额外地，可包括特定的结合元件，例如生物素、亲和素、抗生物素蛋白链菌素、中性亲和素、凝集素、SNAP-标签TM或底物(考凡利生物科学AG公司(Covalys Biosciences AG)；SNAP-标签TM是一种基于哺乳动物O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶的多肽，SNAP-标签底物是苄基嘌呤和嘧啶的衍生物)、缔合或结合的肽或蛋白质、抗体或抗体片段、核酸或核酸类似物等。此外或可选地，偶联基团可用于与感兴趣的分子偶联或结合的其他基团偶联，在一些情况下这些其他基团包括化学官能团和特定的结合元件。通过例子的方式，使光致活化的偶联基团，例如光致活化的生物素沉积在基板表面上并在给定区域中选择性地激活。然后，中间结合剂，例如抗生物素蛋白链菌素可与第一偶联基团偶联。然后，感兴趣的分子(在具体的例子是生物素化的)偶联于抗生物素蛋白链菌素。

本发明该方面中采用的光不稳定的保护基团可包括多种已知的可光致裂解的保护基团，包括例如：硝基藜芦基、1-芘基甲基、6-硝基藜芦氧基羰基、二甲基二甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、甲基、甲基-6-硝基胡椒氧基羰基、2-氧亚甲基蒽醌、二甲氧基苄氧基羰基、5-溴-7-硝基二氢吲哚基、o-羟基-α-甲基肉桂酰基以及它们的混合物，如美国专利5,412,087和5,143,854所述，将其内容全部纳入本文作为参考。

光致活化的偶联基团与感兴趣的表面的偶联可通过许多本领域已知的方法来实现。例如，光保护或可活化的基团可包括羧基，它通过表面上的羟基发生偶联或者通过连接基团(例如PEG分子)与表面相连。或者，光致活化的基团上的胺基可偶联于结合环氧基的表面。或者，预先与连接分子(例如PEG基团)偶联的可活化的基团可通过已知方法进行硅烷化并直接附连于表面。

下面显示了上述偶联方案中使用的化合物的例子，例如使用MeNPOC保护的生物素：

其他光敏感保护基团包括用于偶联胺的基团，例如三甲基苯氧基羰基(TMPOC)，用于偶联酸的基团，例如苯甲酰甲酯(313nm裂解)、α-苯甲酰甲酯、二苯乙酮酯(350nm)、二(o-硝基苯基)甲酯(320nm)、1-芘基甲酯(340nm)、N-8-硝基-1，2，3，4-四氢喹啉酰胺(350nm)，以及以下化合物的酯：

对于本发明那些使用较长波长进行活化或脱保护的方面，可使用合适的长波长不稳定基团，例如溴化7-羟基香豆素(hydroxyxoumarin)-4-基-甲基，它在约740nm为光不稳定。其他这类基团是本领域技术人员已知的。

有用的还有用于偶联醇的光不稳定基团，包括例如，一些如上所述的基团，以及对硝基苄氧基甲基醚、对甲氧基苄基醚、对硝基苄基醚、单、二或三甲氧基三苯甲基、二苯基甲基甲硅烷基醚、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基醚(sisyl ether)、3’，5’-二甲氧基苯偶姻碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯等。这些和许多其他光致裂解的基团可与本发明的该方面联用，参见例如《有机光化学的CRC手册》(CRC Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology)，第二版和《有机合成中的保护基》(Protective Groups in Organic Synthesis)(T.W.Greene和P.G.Wuts，第三版，John Wiley & Sons，1999)，将其全部内容纳入本文作为参考。

除使用前述较大的光可去除的保护基团之外或可选地，本发明除了通过去除这类封闭基团之外，还包括使用光致活化的基团，例如化学改变的基团。例如，乙烯基或烯丙基可与表面偶联，同时光照并与含有例如巯基的合适的待偶联基团进行偶联，例如直接偶联或通过连接分子偶联的具有巯基的生物素，它们与活化的乙烯基或烯丙基反应而与表面偶联。或者，可采用其他基团如硝基芳基叠氮基作为可活化的偶联基团。类似地也可使用许多其他光致活化的化合物，例如硝基螺环吡喃基团(参见Blonder等，J.Am.Chem.Soc.1997，119：10467-10478和Blonder等，J.Am.Chem.Soc.1997，119：11747-11757)。

一方面，采用能够在530nm的波长处引发自由基反应的光引发剂(例如长波长光引发剂)，例如Irgacure 784(双(η5-2，4-环戊二烯-1-基)二[2，6-二氟-3-(1H-吡咯-1-基)苯基]钛；塞霸专业化学品公司(Ciba Specialty Chemicals))。这种长波长光引发剂具有许多应用。例如，用乙烯基-烷基-膦酸酯涂覆表面(例如金属氧化物表面)。在Irgacure 784和生物素-PEG-SH的存在下，使期望的表面区域在530nm激光下曝光，导致在该区域中形成生物素-PEG-烷基-膦酸酯。然后，可采用生物素将感兴趣的分子固定至期望的区域。

在相关的方面，光致活化组分可以溶液形式提供，并在需要定位的表面区域近端活化。例如，将可活化的结合组分或其他感兴趣的分子接枝在活性硅烷表面上。这种系统的一个例子包括光致活化的补骨脂素-生物素化合物(从如安碧恩有限公司(Ambion，Inc.)获得)，该化合物在紫外光下活化而与硅烷化表面，例如三甲氧基硅烷改性的表面偶联。

本发明的这些方面包括使用选择性表面活化的加法过程，通常包括在期望位置中选择性活化的许多不同的方案。这些方案可包括单个活化步骤，多个活化步骤的过程，包括活化和灭活步骤的多步过程，等等。为便于讨论，参考光活化和/或光灭活过程来描述多步过程，但是应理解，类似地可采用其他非光驱动的过程。

至少在第一相对简单的方面，对在期望区域中的光致活化的偶联基团进行选择性活化涉及在期望区域中进行活化辐射并使感兴趣的分子与位于其上的活化偶联基团偶联的单个步骤。如上所述，在光限制的情况下，希望将感兴趣的分子(例如酶)定位在光照体积内，单个步骤的光驱动的活化应导致基本上只在光照体积内的偶联。而且，如上所述，通过调制活化辐射，可以将活化进一步聚焦在最终应用期间(例如使用固定化聚合酶的核酸序列测定)问询的光照区子集内，从而实现感兴趣的基团的偶联。

ZMW结构的基本功能结构在图1中示意性地所示。如图所示，提供的ZMW结构100，其包括沉积在透明基层104上的包层102。芯体106被设置成穿过包层而接触下方的透明层104。芯体的尺寸能提供光限制区，能够防止截止频率以下的电磁辐射传播通过芯体。相反，光只能透芯体中很短的距离，光照了相对较小的体积，由虚线108限定表示。通过在观察体积内提供感兴趣的反应物，例如酶110和底物112，可以选择性地观察其运作而不会干扰观察体积之外(例如线108上方)的反应物(例如底物114)。

如前所述，通常希望在进行分子分析(例如酶分析)的过程中，优先在光照或观察体积内提供感兴趣的分子。因此，参考图1，图2示意性地显示了简单的活化方案，例如ZMW的活化方案。如图所示，首先处理ZMW结构100，以提供可活化的表面，例如实线202所示。如图所示，处理步骤是非选择性的，因为在结构的整个表面(包括包层102)上提供可活化的表面。然后，使光照体积内(例如虚线108所示)的可活化的基团进行活化(如虚线204所示)。在ZMW结构的内容中，通常涉及使可活化基团暴露于通过透明基层104的活化辐射，如波浪箭头206所示。应理解，超出光照体积的活化辐射显著衰减，因此，基本上只活化在光照区内的基团，如虚线108下方的基团。然后，在观察体积内而不是表面上的其他地方，感兴趣的分子(例如酶或酶特异性偶联基团)与活化的基团偶联。应理解，将对光照体积的标注简化为良好限定的边界只是为了便于讨论，而光照通过ZMW芯体的衰减并且不是如此突然的。结果，照度和光照导致的光活化表面水平，将随着距波导芯体光照端距离的增加而降低。辐射衰减的速率以及活化水平可以不同的速率降低，取决于活化过程的性质，例如在任何点的饱和，以及活化过程是单或多光子的过程。

在另一种过程中，可采用额外的活化步骤来进一步选择偶联的感兴趣分子的区域。具体说，在光限制(例如ZMW)内给定的辐射步骤中，如图1和2所示，光照通常产生在所述限制内的活化谱，照度最强处例如波导的底面存在更多的活化基团。当光照因进一步透入波导而降低时，活化水平或活化效率将根据可活化基团的特性、光照强度以及曝光时间量而降低。这将导致在光穿透降低的光照区部分中活化可能性下降，因而照度变小。然后通过用第二光可去除的基团对这些活化基团封端，并重复该活化步骤，类似地限制了远离高照度的基团被活化的可能性，但可应用于的基团数量较少。这可通过下面的例子进一步证明：如果可用第一波长的光活化的光致活化基团均匀分布在ZMW结构中，则在距波导底部特定距离，所有存在的可活化基团中的一半被激活。然后，用在不同波长处激活的第二光致活化基团对所述活性基团封端，这些基团的活化再次使在特定距离处存在的可活化基团中仅一半，即最初可活化基团的四分之一的基团活化。应用于活化谱时的结果是接近波导结构底部的更集中聚焦的活化/偶联区域。

图3提供了双活化方法的示意图。根据双活化方法，提供波导结构300，其表面上具有均匀涂布的光致活化基团的表面涂层(如图片I所示，以黑色菱形302表示)。第一步活化(图片II)用于激活波导内的可活化基团(如空心菱形304所示)，例如将活化光导入穿过波导300的底面306。代替感兴趣的分子与那些活化的基团偶联，而是第二可活化基团(如图片III中黑色圆圈308所示)被用于对活化基团304进行封端的不同波长的光活化。然后，后续活化步骤(图片IV)将新封端的基团(如空心圆圈310所示)的子集活化，感兴趣的分子(未示出)与这些新活化的基团偶联。图4提供了第一和第二活化步骤的表面活化(活化的表面基团的浓度)与距ZMW底面距离的示例性模拟图。如图所示，预计第一活化步骤产生的活化曲线中，活化随着离开ZMW底面的活化光的衰减速率而下降。用第二光可去除的基团封端之后，在不同的波长处再次活化，预计类似的衰减曲线，但是仅基于先前已活化的基团。结果，活化的基团可更多地聚焦在波导的底面而不是仅仅以一个活化步骤活化那样。虽然以两步法进行描述，但是应理解也可进行更多步以使活化区进一步聚焦在所述表面上。

除非另有特殊说明，如本文所述，封端通常是指将其他基团偶联于反应性基团，使所得化合物对进一步应用的偶联或其他感兴趣的反应没有活性。这些封端分子通常包括将与露出的偶联基团进行偶联而对期望的反应是自然发生的基团，并将根据被封端基团的性质而变化。这些基团包括用于封端硅醇表面基团的中性硅烷基团，或者可包括其他非反应性物质，例如非反应性有机物质，例如醇、烷基、烯基等。这些封端基团可以是小分子或者可包括较大的聚合物或大分子结构，例如聚乙二醇(PEG)等。封端化学广泛应用于表面改性、衍生化和钝化过程，例如参见《分析中的固定化生物分子：实践方法》(Immobilized Biomolecules in Analysis：A Practical Approach)(Cass和Ligler编)Oxford University Press，1998和Hermansonn等，《固定化亲和配体技术》(Immobilized Affinity Ligand Techniques)，Academic Press，Inc.1992，将这些文献的全部内容纳入本文作为参考。

在另一多步方法中，采用反复的激活和灭活步骤以聚焦感兴趣的分子的偶联。如前所述，根据上文所述的灭活方案可采用光致活化基团，例如在除期望的区域之外的其他区域进行活化和封端或保护，然后在感兴趣的区域内进行活化并使感兴趣的分子偶联。该方法更适用于基于ZMW的应用。具体说，通过从波导开放端的光照，通常不仅将包层上表面上的可活化基团，而且将波导芯体壁上的可活化基团的一些部分活化，然后封端。然后，从芯体底部或闭合端的后续活化将只能活化尚未封端的那些可活化基团。在一定程度上，活化辐射透入芯体长度的一半以上，这将导致更多的活化选择，用于沉积在ZMW底部或面向ZMW底部。该方法示意性地示出在图5中。

具体说，在具有光限制(例如ZMW500)的基板上，可在整个表面上，例如在限制的内部和外部(步骤I)提供包括光致活化的偶联基团(实心菱形502)的均匀表面。在后续步骤中(步骤II)，该表面暴露于来自顶侧(例如在远离希望固定感兴趣的分子的区域的一侧)的活化辐射。然后通过用另一保护基团(实心圆圈506)(例如非可去除的保护基团)进行封端来灭活活化的基团(空心菱形504)。然后，从底部光照ZMW，使得光照体积包括期望的区域和在该区域中活化的偶联基团(步骤IV，空心菱形508)。然后感兴趣的分子偶联于这些活化的基团。通过控制最初的活化照度，可以有效控制后续活化步骤之前封端的可活化基团的量。具体说，在第一活化步骤中，通过使用活化辐射，或允许活化辐射有效传播超出波导芯一半以上的波导几何形状或其他曝光条件，在第一活化和封端步骤中可以有效封端一半以上的可活化基团。然后从底侧导入活化辐射，基本上所有剩余的可活化基团(原来主要面向在第一步中尚未活化和封端的芯体底部定位)被活化而能够与感兴趣的分子偶联。应理解，上述各种方法可组合以进一步提高选择性。

在类似于上述光致活化方法的另一种方法中，可采用深度紫外蚀刻方法在所需区域中(例如，在ZMW的底面上)产生活化表面。具体说，使用深度UV曝光，例如不到200nm光照，即使用深度UV激光，深度UV灯，例如Xeradex激基灯，在真空下选择性降解表面结合的有机和无机物质，例如这种UV曝光能够直接裂解化学键，而不需要该过程期间可能形成的氧自由基(oxygen radical)的帮助，氧自由基可能导致过度蚀刻。由于氧自由基能够接触和蚀刻其他表面，通过在真空下或其他限制条件下进行这种曝光，可能照射并从选定的基板区域最终可控地去除有机和无机物质。

在本发明有关表面的内容中，例如，ZMW基板可具有第一阻挡层，该层对另外的偶联基团基本上惰性，例如，对最终使感兴趣的分子与表面连接中所采用的偶联方案是非反应性的。因此，原来表面上的官能团被该阻挡层有效阻断。阻挡层的例子包括有机硅烷，例如PEG-硅烷、深度UV阻抗、或其他长链有机硅烷。波导自底部或基板侧面暴露于深度UV辐射，使波导内的阻挡层，优选在波导底面的阻挡层降解。

在曝光或蚀刻过程期间，希望限制氧自由基与表面其他部分，例如ZMW之外或面向ZMW底部的观察区之外的部分接触的能力。在这种情况下，系统可在真空下运行，或者可选地或除此外，在ZMW上提供密封层。这种密封层可包括刚性层，例如玻璃或硅晶片，或较柔性的材料，例如聚合物片，例如PDMS、PTFE、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯或能够密封波导结构的各种聚合物材料中的任一种，优选不会过度脱气或导致波导中不期望的化学残留物。

曝光之后，基板与包含有用于与感兴趣的分子偶联的官能团的材料相接触，优先结合于未阻挡的区域，例如通过“蚀刻”过程裸露的硅醇基团。这种附加的材料可以只包括官能化基团，或者可以包括官能化基团和惰性基团的混合物以控制官能团的密度，并最终控制在波导结构内的感兴趣的分子的密度。这种官能化基团可以是反应性化学基团和/或特异性结合的分子，例如亲和素、生物素等。

一旦适当密度的偶联基团沉积在期望区域中，例如波导结构的底面，感兴趣的分子可与偶联基团偶联，例如通过反应性基团或通过附连的生物素或亲和素基团或其他特异性结合部分，与偶联基团或与该偶联基团连接的基团进行偶联。

在类似于上文所述光致活化方法的另一种过程中，使用柔性连接(tether)或接枝的光引发剂。尤其感兴趣的是光引发-转移-终止剂，如二硫代氨基甲酸酯(DTC)，它能够引发并控制丙烯酸酯、烯烃的自由基聚合或封端剂与用于对感兴趣的分子特异性固定的配体的终止自由基加成。对涂覆光引发剂表面的期望区域进行光照，只在该区域中引发反应。例如，羟基化的硅基板可用光引发-转移-终止剂，例如N，N-(二乙基氨基)二硫代氨甲酰基苄基(三甲氧基)-硅烷(SBDC)处理，在基板表面上形成自集结(self-assemble)的单层。然后提供甲基丙烯酸甲酯溶液，在表面的期望区域中的UV辐射仅在该期望区域中引发聚合反应，形成表面受限制的PMMA的聚合物丛(例如包括偶联基团)。

将感兴趣的分子选择性固定在基板表面的期望区域中的另一种方法包括在不同区域对具有不同特征的材料进行选择性图案化，依赖于在选择性固定过程中不同的表面特征。在本文所述的示例ZMW基板中(以及其他复合基板类型，例如依赖于表面上缔合的感兴趣的分子的基于金属或半导体的传感器，例如ChemFETS)，已经存在这种图案化的复合表面。具体说，ZMW基板典型地包括沉积在二氧化硅基(例如SiO₂)层上的金属包层，例如铝，该包层通常包括氧化铝表层，具有穿过包层在SiO₂层顶部的孔。所得波导结构包括金属或金属氧化物壁，例如具有SiO₂基底的Al₂O₃。氧化铝表面在水性溶液中通常具有较高的正电荷，而SiO₂表面基本上带负电荷。可容易地利用这种电荷差异将感兴趣的分子相对于其他表面选择性定位和固定在一个表面上。

通过例子的方式，DNA聚合酶通常具有相对较高水平的正电荷的表面残留物。因此，聚合酶通常被正电荷金属包层排斥，而对波导结构底部的负电荷的玻璃表面具有吸引和吸附作用。偶联基团可类似地沉积，然后聚合酶(或其他感兴趣的分子)与偶联基团偶联。通过以下方式可容易地调节不同表面的相对吸引/排斥作用，即通过调节环境性质以改变酶的电荷，例如离子强度、pH、添加剂等，通过对各表面改性以提高或降低表面上的电荷组分，或者使金属充电/放电，或者通过对酶、偶联反应物、或其他感兴趣的分子进行改性，以调节表面电荷水平，例如通过使酶突变或通过偶联带电基团，例如聚离子如聚赖氨酸、聚精氨酸等。一方面，聚合酶(或其他感兴趣的基团或分子)沉积到负电荷的表面上之后，用诸如牛血清白蛋白(例如乙酰化的BSA)、聚谷氨酸、聚电解质、聚电解质多层、聚电解质-PEG共聚物、膦酸酯、或磷酸酯等试剂涂覆，使正电荷的表面钝化，如下更详细所述。钝化作用可以例如在单分子核酸测序应用期间防止核苷酸类似物与ZMW芯体带正电荷的金属壁的非特异地结合。在相关方面，钝化在聚合酶(或其他感兴趣的基团或分子)沉积之前完成，通过阻断聚合酶与壁的结合能任选地促进选择性沉积。

如上所述，在一些实施方式中，材料表面电荷可为活性、可调特性，例如通过pH调节和/或通过表面的外部极化作用来解决。例如，可掺入氧化锡(透明材料)使其导电，将其表面电荷(极化作用)调制到期望值。

可类似地采用其他表面选择性化学。例如，在钙存在或不存在条件下，不同的磷脂组合物显示这种能力，即能够在金属氧化物表面和基于二氧化硅的表面上形成不同水平的负载性磷脂双层。通过选择脂质组合物以及钙的存在与否，可以将分子有目标地沉积在不同表面类型上，或作为封闭基团或作为偶联基团。例如，可以选择对金属氧化物表面具有高结合选择性的磷脂，并用其保护表面的金属部分。或者，可以使用具有适当偶联基团的磷脂，所述偶联基团对下面的玻璃基板具有高的结合选择性，因而能够使附加的基团选择性地偶联于透明基板。这些选择性磷脂组合物的例子例如参见Rossetti等，Langmuir.2005；21(14)：6443-50，将其全部内容纳入本文作为参考。简要地说，将DOPC(二油酰基磷脂酰基胆碱)中含50-20％DOPS(二油酰基磷脂酰基丝氨酸)的磷脂运载体加入混合的TiO₂/SiO₂表面，显示在没有钙的情况下，在SiO₂表面上选择性地形成脂质双层，而在钙的存在下则在TiO₂表面上形成双层。

应理解，可以使用玻璃选择性磷脂双层(或其他表面选择性组合物)作为偶联基团，或者可用作对后续阻挡层沉积到金属层上的掩蔽层。然后从玻璃基板去除脂质双层，然后将感兴趣的分子偶联。

或者，基于特异性选择的化学，不同表面间的物理/化学差异可进行不同的结合。例如，可利用与特定金属基团缔合的特定基团，将分子相对于其他选择性地定位在一个表面上，例如金/硫醇化学等。

另一个例子是，硅烷(例如甲氧基-硅烷反应物)与二氧化硅表面通过Si-O-Si键形成稳定的键，但在适当选择的反应条件(例如，气相有利于对二氧化硅表面的改性，溶液中的某些条件也是如此)下不会显著改变铝或氧化铝的表面)。硅烷，例如用结合酶或其他感兴趣的分子结合的偶联基团进行改进的硅烷(例如生物素-PEG-硅烷，如美国专利申请11/240,662所述的那些)能够用于对复合基板如含二氧化硅表面的ZMW进行图案化。预先用Al₂O₃改性的硅表面上的椭圆对称和接触角测量显示，不可检测量的硅烷反应物沉积。此外，生物素-PEG-硅烷沉积在滑片上之后，荧光标记的中性亲和素不会特异性结合经Al₂O₃改性的熔融二氧化硅滑片，相反，熔融二氧化硅滑片的生物素-PEG-硅烷改性(不是用Al₂O₃改性)会导致中性亲和素通过生物素配体以非常高的特异性结合。这种结果表明，使用甲氧基硅烷反应物，仅对ZMW或类似装置的熔融的二氧化硅底部进行改性的可行性，而几乎不会或绝对不会对装置的铝壁或顶面进行改性。

另一个例子是，通过吸附含正电荷聚电解质嵌段和PEG化(或类似防污(anti-fouling))嵌段的共聚物来选择性地改性负电荷表面。该聚阳离子嵌段结合在装置的负电区域，PEG组分提供排斥非特异性结合的非反应性表面。示例性的聚电解质-PEG共聚物包括PLL-PEG(聚(L-赖氨酸)-聚(乙二醇))。PEG或其子集可包括偶联基团，例如生物素或本文所述的其他基团(例如参见Hubbell等的美国专利申请公开2002/0128234“Multifunctional Polymeric Surface Coatings inAnalytic and Sensor Devices(分析和传感装置中的多功能聚合物表面涂层)”，Huang等(2002)“Biotin-Derivatized Poly(L-lysine))-g-Poly(ethylene glycol)：ANovel Polymeric Interface for Bioaffinity Sensing(生物素-衍生的聚(L-赖氨酸))-g-聚(乙二醇)：一种新的用于生物亲和感应的聚合界面)”Langmuir 18(1)：220-230)。因此，例如，可用PLL-PEG-生物素涂覆ZMW的SiO₂表面，然后生物素化的聚合酶通过与PLL-PEG-生物素结合的亲和素或抗生物素蛋白链菌素而偶联于ZMW的底部。

一方面，通过对另一种类型的材料进行改性可补充或促进将感兴趣的分子选择性地固定到复合基板(例如ZMW)中的一种类型材料上。例如，对于诸如单分子核酸测序等应用中使用的ZMW，希望将聚合酶选择性地固定到ZMW底部二氧化硅表面上，也希望对该装置的金属壁和顶面(在聚合酶固定之前或之后)钝化。未改性的铝或氧化铝ZMW表面，如上所述在水性溶液中倾向于带正电，这种表面显示对蛋白质(例如中性亲和素或抗生物素蛋白链菌素和聚合酶)、核苷酸类似物(例如，通过类似物的磷酸盐/酯基团)和染料(例如，带有磺酸或羧酸基团的染料)的不希望的非特异结合。如上所述，这种不期望的静电相互作用可通过在表面结合钝化剂来最小化；合适的钝化剂的其他例子包括但不限于：阴离子聚电解质如聚(苯乙烯磺酸酯)和聚(丙烯酸)和大分子如肝素和藻蛋白碱。

然而，在一些例子中，阴离子聚电解质吸附于正电荷表面可能导致表面净电荷的过度补偿，聚阴离子的吸附导致从净表面电荷正电到负电的转变。这种改变原则上使核苷酸类似物或其他负电荷化合物与表面间的非特异性吸附最小，但缺点是许多蛋白质(例如聚合酶)对负电表面具有亲和力。因此，这种过度补偿产生的负电表面可导致不希望的高水平的聚合酶非特异性结合。这个问题可通过采用高盐固定条件来解决；但是，高盐方案可引起聚电解质层的溶胀以及聚电解质的部分损失。此外，用聚电解质涂覆表面是一动态过程，聚合酶可能最终与聚电解质形成稳定的活性-封闭复合物。

任选地，代替通过阴离子聚电解质吸附来使正电荷表面钝化，采用通过使含聚电解质嵌段(负电)和PEG化嵌段的共聚物结构的结合来使正电荷表面钝化。共聚物的聚电解质嵌段使大分子吸附或锚定到装置的正电区域(例如，ZMW的铝或氧化铝区域)，PEG组分提供非离子缓冲垫以防止聚合酶与聚电解质嵌段的表面附连或复合。聚电解质(PE)-PEG共聚物可以是例如，双嵌段(PEG-PE)或多嵌段共聚物(例如，PE-PEG-PE或PEG-PE-PEG)以及分支共聚物、梳形聚合物(comb polymer)或树突样聚合物(dendron-like polymer)。一些示例性的线性或支化共聚物示意性地如图16的图片VI所示。显然，虽然在此所述的示例共聚物采用PEG，但可应用任何防污主链，例如聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖和聚丙烯酰胺。例如，参见美国专利申请公开2002/0128234，Voros等(2003)“Polymer Cushions to Analyze Genes and Proteins(分析基因和蛋白质的聚合物缓冲垫)”Bio World 2：16-17，Huang等(2002)Langmuir 18(1)：220-230，和Zoulalian等(2006)J.Phys.Chem.B 110(51)：25603-25605。

用对不同表面特征具有不同选择性的两种组合物对复合基板进行正交改性在如图16中示意地示出。如图片I所示，ZMW1600包括芯体1602，该芯体设置为穿过铝包层1604至透明二氧化硅基板1606。铝芯体的表面上具有氧化铝薄层1605。如图片II所示，ZMW的底面用生物素-PEG-硅烷1620和PEG-硅烷1622的混合物进行选择性地改性(例如，所选比率能提供在表面，任选每个芯体的一个表面上所需密度的生物素偶联基团，因此最终提供感兴趣的分子)。如图片III所示，然后用聚阴离子-PEG共聚物1630对装置的壁和顶面选择性改性。如图片V的放大图所示，共聚物1630包括聚阴离子(A)嵌段1631和PEG(B)嵌段1632。(应注意，铝表面的改性任选地在二氧化硅表面进行改性之前而不是之后进行)。然后，生物素化的聚合酶1608通过中性亲和素1609与生物素-PEG-硅烷1620上的生物素偶联基团结合，如图片IV所示。

一方面，用于使未结合感兴趣的分子的表面(例如，铝表面)钝化的组合物也可具有选定密度部分，该部分在该表面增加官能度。例如，在上述PE-PEG共聚物中，荧光淬灭部分1640可附连于PEG嵌段的官能端(图16的图片V)。作为另一个例子，可采用正交配体方案来附连蛋白质，与聚合酶或其他感兴趣的分子前后作用，例如，在利用生物素固定聚合酶1608的实施方式中，官能团1640可以是SNAP、HA、GST或类似的非生物素偶联基团，以结合适当改性的第二蛋白质。这些第二蛋白质可用于裂解新合成的DNA链，帮助从溶液中去除反应产物，帮助将反应物带到反应区域，帮助三联体淬灭剂的再生，等等。

作为另一个例子，可用聚电解质多层使未固定感兴趣的分子的复合基板表面钝化。聚电解质多层可通过相继沉积相反电荷的聚电解质交替层而方便地形成。例如参见Decher(1997)Science 277：1232。聚电解质多层的形成示意性示于图17。如图片I和II所示，步骤1中正电荷基板1705与聚阴离子1732相接触而吸附于基板表面。步骤2中冲掉过多的聚阴离子。步骤3中，将聚阳离子层1734沉积到步骤1形成的聚阴离子层1732上，步骤4中冲掉过多的聚阳离子。需要时可重复进行步骤1-2和/或3-4，以交替沉积带相反电荷的聚电解质层，并形成实际上任意所选厚度和所得表面电荷的多层(如果最后沉积聚阴离子则为负，或者如果最后沉积聚阳离子则为正)。图片III显示了示例性的聚阳离子聚(吖丙啶)和示例性的聚阴离子聚(丙烯酸)，任选地应用以形成聚电解质多层。

任选地，聚电解质多层中的最后一层包含聚电解质-PEG-共聚物，例如，上述包含聚电解质嵌段(正电荷或负电荷，取决于多层中前一层的电荷)和PEG化的嵌段的共聚物。仅仅作为一个例子，聚电解质多层中的聚(丙烯酸)层后是PLL-PEG或聚谷氨酸盐-PEG层，提供对PEG的修饰。显然，虽然本文所述的示例共聚物采用PEG，但可应用任何防污主链，例如聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖和聚丙烯酰胺。

用对不同表面特征具有不同选择性的两种组合物对复合基板进行差异性表面衍生化并形成聚电解质多层示意性地示于如图18。如图片I所示，ZMW1800包括芯体1802，该芯体设置为穿过铝包层1804至透明的熔凝二氧化硅层1806。铝壁表面上具有氧化铝薄层1805。如图片II所示，用生物素-PEG-硅烷1820和PEG-硅烷1822的混合物对ZMW的底面进行选择性地改性。如图片III所示，然后，将聚电解质多层1830沉积到装置的壁和顶面上。聚电解质多层可如图17所示沉积；例如，将聚阴离子层(例如聚(丙烯酸)沉积到带正电的氧化铝层1805上，然后沉积聚阳离子层(例如聚(吖丙啶))，再是另一层的聚阴离子等。对于单分子测序或类似的应用，聚电解质多层的最后一层通常为聚阴离子层，使得聚电解质多层的表面带负电以排斥核苷酸类似物(或任选地聚电解质-PEG共聚物或类似地提供与类似物低结合的表面)。如图片IV所示，生物素化的聚合酶1808通过中性亲和素1809与生物素-PEG-硅烷1820上的生物素偶联基团连接。利用构成ZMW的材料的表面性质上的差异，例如对玻璃底部的特异性硅烷化和用聚电解质多层对氧化铝侧面和顶面钝化以防止非特异性结合，能限制聚合酶聚集在ZMW底部，避免聚合酶占据侧壁和顶面，同时限制核苷酸类似物等物质的非特异结合。

在根据其不同表面特征对复合基板中的不同材料的差异改性的又一个例子中，采用磷酸盐/酯或磷酸化合物(也可采用显示表面特异性化学吸附和/或形成自集结单层的其他化合物)。磷酸盐/酯或磷酸部分与金属氧化物(例如氧化铝、氧化钛、氧化锆、氧化钽、氧化铌、氧化铁和氧化锡)牢固结合，但不与氧化硅牢固结合。因此，包含至少一个磷酸盐/酯基团(-OP(O)(OH)₂，无论是质子化、部分或完全去质子化、和/或部分或完全中和)或磷酸基团(-P(O)(OH)₂，无论是质子化、部分或完全去质子化、和/或部分或完全中和)的化合物可用于对ZMW或类似复合基板的氧化铝表面进行选择性改性。

例如，可用磷酸烷基酯或膦酸烷基酯对金属氧化物表面改性。(术语膦酸和膦酸盐/酯在这里可互换使用)。示例性的磷酸烷基酯和膦酸烷基酯包括但不限于：烷基是直链未取代烷基(例如具有1-26个碳，例如8-20个碳，例如12-18个碳的直链烷基)的磷酸烷基酯或膦酸烷基酯。其他示例性的磷酸烷基酯和膦酸烷基酯包括官能化的或取代的膦酸烷基酯和磷酸烷基酯，例如，官能化的X-烷基-膦酸酯和X-烷基-磷酸酯，其中X是包括以下基团的端基：乙烯基(CH₂)、甲基(CH₃)、胺(NH₂)、醇(CH₂OH)、环氧化物、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、硫醇、羧酸酯、活性酯(NHS-酯)、马来酰亚胺、卤化物、膦酸盐/酯或磷酸盐/酯基团、或乙二醇(EG)低聚物(EG4、EG6、EG8)或聚乙二醇(PEG)、光引发剂(例如，光引发-转移-终止剂，如二硫代氨基甲酸盐(DTC))、光俘获基团(photocaged group)、或光反应性基团(例如补骨脂素)。X-烷基-膦酸酯或X-烷基-磷酸酯分子中的烷基链的间隔基是任选地具有1-26个，优选8-20个，更优选12-18个亚甲基(CH₂)重复单元的疏水柔性连接基。烷基链可包含一个或多个(最多全部)氟化基团和/或可以是沿链长具有一个或多个双键或三键的烃链。而且，X-烷基-磷酸酯或X-烷基-膦酸酯层也可用作底物，以锚定表面堆叠的其他配体或组分，例如聚电解质多层或化学吸附多层。磷酸烷基酯/膦酸烷基酯可完成稳定的抗耐溶剂的自集结单层，该单层能保护下面的物质(例如铝)免于腐蚀等，上述结构中烷基柔性连接基的作用是增强化学吸附单层在水性环境时的侧向稳定性。在膦酸酯或磷酸酯包括不饱和烃链的实施方式中，双键或三键可用作侧向交联部分以稳定包含该化合物的自集结单层。

具体示例性的磷酸烷基酯和膦酸烷基酯包括但不限于：辛基膦酸、膦酸，癸基膦酸，十二烷基膦酸，十六烷基膦酸，十八烷基膦酸，二十二烷基膦酸(即C22膦酸)，羟基-十二烷基膦酸(HO(CH₂)₁₂P(O)(OH)₂)，羟基-十一烷基-膦酸，癸二基二(膦酸)，十二烷基磷酸酯和羟基-十二烷基磷酸酯。椭圆对称性和/或接触角测量显示，相对于Si/SiO₂表面，辛基膦酸、十八烷基膦酸，羟基-十二烷基膦酸和十二烷基膦酸对铝/氧化铝表面具有特异性。用上述磷酸酯或膦酸酯对金属氧化物改性已在Langmuir(2001)17：3428，Chem.Mater.(2004)16：5670；J.Phys.Chem.B(2005)109：1441，Langmuir(2006)22：6469，Langmuir(2006)22：9254，Langmuir(2006)22：3988，J.Phys.Chem.B(2003)107：11726，J.Phys.Chem.B(2003)107：5877，Langmuir(2001)17：462，J.Phys.Chem.B(2006)110：25603，Langmuir(2002)18：3957，Langmuir(2002)18：3537，and Langmuir(2001)17：4014中描述。

类似地，可用聚磷酸盐/酯或聚膦酸盐/酯对金属氧化物表面改性。例如聚膦酸酯的化学吸附不同于前述聚电解质吸附，因为配体(膦酸基团)与底物(例如氧化铝、氧化锆或氧化钛)形成化学配合物。这种相互作用比简单静电相互作用更强且盐交换的可逆性较低。例子包括但不限于：PEG-膦酸酯，例如Zoulalian等(2006)“Functionalization of titanium oxide surfaces by means ofpoly(alkyl-phosphonates)(通过聚(烷基-膦酸酯)方式使氧化钛表面功能化”J.Phys.Chem.B 110(51)：25603-25605所述，或PEG-聚乙烯(膦酸酯)共聚物。(通常，本文考虑包括化学吸附部分加上PEG或其他抗污基团的共聚物)。

其他合适的膦酸盐/酯包括高分子量聚合膦酸酯，例如聚乙烯膦酸(PVPA)

封端的膦酸盐如

(从罗迪亚(Rhodia)公司分别以 EC4020和 ESL购得)；和

共聚物，例如乙烯基膦酸-丙烯酸共聚物

(从罗迪亚公司(Rhodia)以Albritect^TM CP30购得)。

合适的膦酸酯还包括低分子量膦酸酯，例如2-羧乙基膦酸(也称为3-膦酰基丙酸；从罗迪亚公司以Albritect^TM PM2购得)以及表1所列的化合物(以 化合物形式从密苏里州圣路易斯的塞露迪亚公司(Solutia，Inc.，St.LouisMissouri)购得)。膦酸盐/酯化合物可以盐形式供应(例如，钠盐、钾盐、锂盐或铵盐)或者优选是游离酸形式。

表1：示例性的膦酸化合物

下面是膦酸盐/酯和磷酸盐/酯在ZMW处理方面的一些示例性应用，其中，将感兴趣的分子如聚合酶选择性地固定在ZMW波导芯体的二氧化硅底面上。显然，类似的考虑适用于对其他复合基板的处理。例如，可用膦酸盐/酯处理ZMW芯片以钝化ZMW的氧化铝表面，然后，带正电荷的聚合酶通过选择性结合于带负电荷的二氧化硅表面而固定。类似地，可用膦酸盐/酯处理ZMW芯片，用于后续固定聚合酶(例如亲和素)的俘获试剂通过与二氧化硅表面结合而固定，然后聚合酶通过与俘获试剂结合被固定。在这些例子中，膦酸盐/酯对氧化铝表面钝化，提供偏置(例如通过保护氧化铝)并提供与核苷酸类似物等物质低非特异结合的表面。在相关的例子中，聚合酶或俘获试剂固定之后，在氧化铝表面上形成聚电解质多层以钝化该表面。膦酸盐/酯和磷酸盐/酯也可与对ZMW二氧化硅表面选择性改性的化合物联用。因此，例如，氧化铝表面可用膦酸盐/酯进行钝化和/或保护，然后用硅烷试剂对二氧化硅表面改性(或反之亦然，先对二氧化硅表面改性再沉积膦酸盐/酯)。

在一类实施方式中，磷酸盐/酯或膦酸盐/酯化合物用作第一层，如上所述在该表面上例如通过相继沉积带相反电荷的聚电解质来建立聚电解质多层。在相关的一类实施方式中，在该表面上形成化学吸附的多层。化学吸附的多层可包括例如，含多种膦酸盐/酯的试剂(例如，二膦酸酯，如1，n-烷基二膦酸、或多聚膦酸酯，例如聚乙烯基膦酸酯)和锆(IV)配体的交替层。膦酸盐/酯的锆(IV)配基可通过前体如叔丁醇锆、乙酰丙酮酸锆、或乙醇锆提供，膦酸盐/酯从这些前体取代在锆周围的配基。多层可使用本领域公知的方法形成，例如通过将基板或表面交替浸渍到膦酸盐/酯溶液中和锆前体的溶液中(有中间加热退火步骤)，或者通过交替浸渍在膦酸盐/酯溶液中，和用机金属化学气相沉积(MOCVD)或快速热化学气相沉积(RT-CVD)锆(必要时采用退火步骤)形成。这种化学吸附的多层为牢固的，类似于聚电解质多层，但具有以下优点：在相邻层之间而不是物理静电层之间具有和在如聚电解质多层中等同的化学吸附“交联”。

另一方面，可采用限制的热力学或扩散过程对期望的或不期望的区域进行选择性活化和/或灭活。具体说，可将活性偶联基团设置到基板表面，包括在ZMW结构内，以活性形式提供。然后，通过使基板与封端基团或封闭基团接触随后选择性灭活，防止与这些基团的任何额外的偶联。因为偶联基团位于ZMW内的期望区域(例如底面)，封端剂或封闭剂向这些基团的扩散受到一定程度的限制。结果，这些偶联基团不太容易被封闭(很可能是最后被封闭的基团)，并可能用于将感兴趣的分子向着ZMW底面偶联。具体说，通过控制基板整体与封闭剂接触的时间，封闭剂的浓度以及封端反应的其他条件，例如温度等，则可以控制波导内偶联基团被保护或封端的程度。在本发明的该方面，应理解，封闭组分无需特异性结合特定的偶联基团以防止感兴趣的分子的偶联。在一些情况下，这些封闭或封端基团通过在波导内或表面其他区域内的存在来阻止这种结合。这可包括在表面上形成薄层或单层的疏水或亲水涂层材料，从而阻断所感兴趣的分子的结合，或者在给定的偶联基团处提供空间或立体阻挡，而实际上没有与偶联基团的活性偶联组分结合。

本发明的上述方面示意性示于图6。如图所示，波导结构600上设置有均匀的偶联基团602(以空白菱形表示)的涂层。整个结构与封端基团604(以实心圆圈表示)接触导致波导结构内扩散限制性封端，结果，面向波导结构底面留下较多活性(未封端)的偶联基团602，用于在后续接触步骤中与感兴趣的分子偶联。

应理解，如果仅仅希望将基团直接偶联于下表面，例如硅醇基团在玻璃基板上偶联，则可以避免在整个表面上提供活性偶联基团的初始步骤。具体说，通过初始封闭表面上任何活性偶联基团相对较短的时间，最容易到达的那些基团(例如，不位于ZMW底部区域)将首先被封闭。接着，部分封闭或封端的表面基团与能够和该表面基团结合的偶联基团较长时间的接触将导致这些偶联基团固定在波导结构的底部区域上。每一步骤的时间、浓度、温度和其他条件可以变化以提供对每一封闭步骤和偶联步骤的最佳条件，并可以根据容易鉴别的特征和简单的实验来确定。

在期望位置额外提供感兴趣的分子的另一种方式是通过例如使用光“镊(tweezer)”技术在期望位置中光学俘获分子。具体说，采用光限制(例如ZMW)内集中的激光能量来产生的高增强的电场，可以提高粒子如感兴趣的分子的浓度，或使它们富集到ZMW的聚焦区内，然后使其与该区域内的结合基团偶联。感兴趣的分子可与另外的基团，例如亲和素、抗生物素蛋白链菌素、中性亲和素、生物素、或颗粒如小珠，例如肝素离散珠等偶联，以提供足够大的颗粒用于俘获。这种光俘获/增强技术的使用已有详细描述，可用于对小到10nm的颗粒施加俘获力。例如，参见Novotny等，Phys.Rev.Letts.79(4)：645-648(July 1997)，将其内容纳入本文作为参考。

作为上文或下文所述的选择性激活/灭活过程的替代或另外的过程，本发明任选地或额外还包括初始图案化步骤，以在不希望偶联感兴趣的分子的区域提供中性或惰性基团。这种图案化通常提供对定位的粗略选择，因为并不是特意要产生最终的选择表面。例如，在有关微孔或纳米孔、或其他平面中所提供的其他结构的内容中，惰性基团可以在基板的上表面印压、施加或图案化，而不会将这些材料沉积到纳米结构(例如ZMW)中。先用惰性基团保护非相关的表面，然后将活性基团沉积和偶联在相关区域内。同样，在ZMW阵列的内容中，根据阵列密度，例如整个基板上被波导结构占据的百分比，显著量的非相关表面可被封闭，从而防止这些表面容纳感兴趣的分子，这些分子可能干扰装置

其上设置有定位分子的器件及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。