专利摘要

本发明公开了一种树脂固定海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法。本发明将海藻糖合酶用树脂进行固定实现重复利用。载体为带环氧基团的树脂，海藻糖合酶上氨基与树脂上的环氧基通过共价键结合。固定化酶初始转化率为58％左右，与游离酶基本一致，循环到18批时，转化率基本还可以保持在初始转化率的72％左右。循环到14批时，转化率基本还可以保持在初始转化率的80％左右。固定化酶催化质量百分比浓度为20％的麦芽糖底物生成海藻糖，该底物浓度较高，可工业化应用。固定化酶相比于游离酶，副产物葡萄糖量减少。固定化酶初始可达到与游离酶相同的转化率，另外可重复使用一定批次，节省成本，直接使用粗酶进行固定化，固定化方法简便易行，具有工业化应用前景。

权利要求

1.一种树脂固定海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)树脂的选择及预处理

载体为西安蓝晓公司的LX-1000EP带环氧基团的树脂；

称100g载体加入400ml，0.1M，pH为8的磷酸缓冲液，室温下200rpm搅拌15min，测pH值，维持pH在7.8-8.2，1h后过滤抽干得到活化后的树脂；

(2)酶的固定化

将带有海藻糖合酶目的基因的大肠杆菌进行发酵，离心后得到菌体，加入体积为发酵液体积1/5的PBS将菌体重悬，超声破碎后得到细胞破碎液，用细胞破碎液进行固定化；

固定化方法为：称取活化后的树脂0.4g，在10ml磷酸缓冲液体系中加入1ml细胞破碎液,，室温条件下，150rpm摇床振荡进行固定化；固定化5-6h后抽滤，固体物质即为固定化酶，负载量为70-80％；

(3)固定化酶反应

20ml的质量百分比浓度为20％的麦芽糖底物中加入0.4g固定化酶，在50℃摇床中150rpm反应24h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

固定化酶反应结束后进行抽滤，反应液用高效液相色谱检测其成分含量，流动相为乙腈：水＝87:13，流速为1ml/min，柱温为25℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

固定化酶反应结束抽滤后得到固定化酶，用去离子水冲洗后投入到新的20ml的质量百分比浓度为20％的麦芽糖底物中进行下一批反应，从而实现循环利用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用海藻糖合酶序列为NO.1。

说明书

技术领域

本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及的是一种带环氧基的树脂固定海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的新方法。该固定化方法简便易行，直接使用粗酶进行固定化，且无需添加交联剂。固定化酶可适应高浓度底物并可在50℃的条件中连续反应14-18天，大大提高了酶的稳定性。另外，相比于游离酶，副产物葡萄糖减少，具有很好的工业化应用前景。

背景技术

海藻糖是由两分子葡萄糖以1，1-糖苷键连接而成的非还原性双糖，对生物体具有非常重要的生物学意义，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂。又因为海藻糖具有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性等特殊性质，因此被广泛应用于食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业中。

在海藻糖的工业生产中，海藻糖合酶与其它海藻糖合成酶相比具有更大的优势，只需要一种酶一步反应就能够获得海藻糖，简单，快捷，而且其生产原料为更加廉价的麦芽糖，有一部分副产物为葡萄糖。目前实验室自产海藻糖合酶生产海藻糖已实现工业化，酶应用形式为游离酶。但游离状态的海藻糖合成酶稳定性差，易失活，不能重复利用，且反应后也不易与产品分离。

固定化酶在工业生产中具有重要的应用意义，经过固定的酶不仅具有高的催化效率和高度专一性，而且固定化酶在一定程度上提高了酶对酸碱和温度的稳定性，增加了酶的使用寿命。对于工业化来说，还可简化工艺，反应后易与反应产物分离，减少了产物分离纯化的困难，可重复性大大降低工业生产成本。

酶固定化方法一般可以分为两种，包括有载体固定化(将酶与载体结合或者用载体将酶包埋)和无载体固定化(酶分子之间进行交联)。2003年，王俊等以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂固定海藻糖合酶，海藻糖含量最高能达40％。2005年，韩国的Youn-Jeung Cho等报道了用EupergitC250L将海藻糖合酶进行固定化，固定化酶比游离酶受pH值影响较小，热稳定性提高，更易存放。2011年，Tsung-Ta Wu等人将带组氨酸标签的海藻糖合酶通过金属离子螯合作用进行固定化，底物麦芽糖的浓度是100Mm，可以重复使用24批次，保留原始酶活的80％，固定化酶相比于游离酶对pH和温度具有更强的耐受性。2013年，Anna Panek等人用Fe₃O₄磁性纳米粒子将海藻糖合酶进行固定化，可重复利用12次，酶活保持在80％左右。2014年，Ying Chen等人将海藻糖合酶的交联聚集体用油包水乳剂进行固定化，大大增加了酶的稳定性，包括对高温、pH的耐受性，另外，固定化酶在Tris、尿素、盐酸胍、以及Zn²⁺,Cu²⁺,Al³⁺,Fe²⁺环境中，均比游离酶稳定。

综上所述，将海藻糖合酶固定化可提高酶的稳定性，并且可以重复利用，若投入工业生产，可大大降低工业生产成本。

本发明提供了一种用树脂将海藻糖合酶固定化，在高浓度的底物中反应并进行重复使用的方法。使用的载体为西安蓝晓LX-1000EP树脂，该载体在报道的海藻糖合酶的固定化方法中，未被研究过。

实验证明该固定化方法简便易行，酶与载体可直接结合，不需添加辅助交联剂或者激活剂，比一般固定化方法简便。固定化酶性质稳定，可在20％-30％的高浓度底物中反应。另外，因为底物与产物均为糖类，易染菌，在较高温度中反应可避免该问题，该固定化海藻糖合酶可在50℃的环境中连续使用14天-18天。相比于以报道的固定化海藻糖合酶具有更好的稳定性及工业化优势。相比于游离酶，固定化后副产物葡萄糖减少。

本发明提供了一种带环氧基团的树脂固定化海藻糖合酶进行催化反应。此固定化酶不但能重复使用较多批次，且固定化酶较为稳定，固定化酶与游离酶达到最高转化率的时间一致,固定化酶相比于游离酶，副产物葡萄糖减少。这种具有优良效果的简便固定化方法从未被提及或公开过。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对实验室现有的酶，提供了一种简便易行的固定化方法，通过重复使用提高酶的利用率，降低生产成本。

本发明的技术方案如下：

一种树脂固定海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)树脂的选择及预处理

载体为西安蓝晓公司的LX-1000EP带环氧基团的树脂；在碱性环境下，酶分子上的氨基基团更容易攻击碳原子，使得树脂与酶发生共价结合；

称100g载体加入400ml，0.1M，pH为8的磷酸缓冲液，室温下200rpm搅拌15min，测pH值，维持pH在7.8-8.2，1h后过滤抽干得到活化后的树脂；

(2)酶的固定化

将带有海藻糖合酶目的基因的大肠杆菌进行发酵，离心后得到菌体，加入体积为发酵液体积1/5的PBS将菌体重悬，超声破碎后得到细胞破碎液，用细胞破碎液进行固定化；

固定化方法为：称取活化后的树脂0.4g，在10ml磷酸缓冲液体系中加入1ml细胞破碎液,，室温条件下，150rpm摇床振荡进行固定化；固定化5-6h后抽滤，固体物质即为固定化酶，负载量为70-80％；

(3)固定化酶反应

20ml的质量百分比浓度为20％的麦芽糖底物中加入0.4g固定化酶，在50℃摇床中150rpm反应24h；反应结束后进行抽滤，反应液用高效液相色谱检测其成分含量，流动相为乙腈：水＝87:13，流速为1ml/min，柱温为25℃；

(4)固定化酶的循环使用

反应结束抽滤后得到固定化酶，用去离子水冲洗后投入到新的20ml的质量百分比浓度为20％的麦芽糖底物中进行下一批反应，从而实现循环利用。

进一步，所用海藻糖合酶是Yan Li等人研究的来源为Thermus thermophilus HB27，经过改造在大肠杆菌中表达的酶；所用海藻糖合酶序列为NO.1。

本发明将海藻糖合酶固定在带环氧基的树脂上进行催化反应，可重复使用过一定批次，提高了海藻糖合酶的利用率，大大降低生产成本。

附图说明

图1为不同载体量对转化率的影响

图2为不同酶量对转化率的影响

图3为不同固定化时间对转化率的影响

图4不同pH对转化率的影响

图5不同温度对转化率的影响

图6为循环批次

图7不同反应时间下游离酶与固定化酶产葡萄糖的量

具体实施方式

通过以下的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细解释及展述。

实施例1树脂的选择及酶的固定化

(1)树脂的选择及预处理

本发明涉及到的海藻糖合酶为实验室改造菌株产的酶，目前已经实现工业化。考虑应用到工业生产，对一些载体进行了筛选，选取性质稳定，易于分离，工业化生产较为方便的载体。最终选择的载体为西安蓝晓公司的LX-1000EP带环氧基团的树脂，环氧树脂是一种含环氧基的树脂，可与酶发生共价结合，其基本信息见表1。

树脂性质较为稳定，保存到4℃条件下即可。树脂需要预处理，处理方法为100g载体加入400ml，0.1M，pH为8的磷酸缓冲液，室温下200rpm搅拌15min，测pH值，维持pH在7.8-8.2，1h后过滤抽干得到活化后的树脂。

(2)酶的固定化

本实验所产海藻糖合酶带组氨酸标签，可以纯化，但为了工业化方便，直接尝试使用细胞破碎液进行固定化。

固定化方法为：称取1g活化后的树脂，在10ml磷酸缓冲液体系中加入2ml细胞破碎液(此时载体和酶都过量,细胞破碎液蛋白量约为20mg/ml)，室温条件下，150rpm摇床振荡进行固定化。固定化4h后抽滤，用去离子水冲洗三遍。

(3)固定化酶反应

20ml的质量百分比浓度为20％的麦芽糖底物中加入固定化酶，50℃反应24h。反应结束后抽滤得到固定化后酶，用去离子水冲洗后投入到下一批反应中。采用高效液相色谱进行检测，流动相为乙腈：水＝87:13，流速为1ml/min，柱温为25℃。

2.固定化条件优化

初步验证该固定化方法有一定的效果且可以循环一定的批次，进一步对其固定化条件及反应条件进行了优化。

(1)载体量优化

分别称取活化后的载体0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g，加入1ml细胞破碎液液固定4h后过滤抽干，投入麦芽糖底物中反应，24h反应结束后测转化率。不同载体量的固定化酶的转化率如图1。

(2)酶量优化

0.4g载体分别加入0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml的细胞破碎液，振荡固定4h后投入麦芽糖底物中反应，24h反应结束测转化率。不同酶量的固定化酶的转化率如图2。

(3)固定化时间优化

0.4g载体加入1.0ml的细胞破碎液，室温下分别振荡1h、2h、3h、4h、5h、6h，抽滤后投入麦芽糖底物中反应，24h反应结束测转化率。不同固定化时间的转化率如图3。

3.反应条件优化

对固定化酶的反应条件进行了优化，包括反pH及反应温度。

(1)反应pH优化实验

在pH为6、6.5、7、7.5、8的条件下进行反应，24h反应结束测转化率。不同pH条件下反应的转化率如图4。

(2)反应温度优化实验

在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃及60℃的条件下分别进行反应，24h反应结束测转化率。不同pH条件下反应的转化率如图5。

4.固定化酶的循环批次

在优化后的条件下固定海藻糖合酶，并在最适条件下进行反应，每批次反应结束后将固定化酶过滤抽干，用去离子水冲洗后投入下一批反应。

称0.4g活化后的树脂，加1ml细胞破碎液液，室温下振荡固定5-6h，得到固定化酶后在50℃、pH为7的条件下反应24h，取样，HPLC检测转化率。循环批次如图6所示。

从图1至图6可以看出，粗酶即细胞破碎液的原始转化率在56％-60％，固定化后可循环使用。结果表明用树脂固定化有一定的效果，优化固定化条件及反应条件结果显示，加入1ml细胞破碎液液进行固定化，可以达到较好的结果，反应24h后与游离酶的转化率相差不大。最优载体量为0.4g，固定化时间为5-6h时，固定化效果较好。pH为7时转化率相对较高，同时考虑工业化应用，用水作为反应溶剂。50℃时酶活相对最高，温度较低时，24h不能达到最高转化率，温度较高时，副产物葡萄糖的量会大大增加。50℃相对来说，副产物较少且24h可达到最高转化率。图7可以看出，50℃时，相比于游离酶，固定化酶的副产物葡萄糖量减少。

循环使用，初始转化率为58％左右，循环到18批时，转化率基本还可以保持在初始转化率的72％左右。循环到14批时，转化率基本还可以保持在初始转化率的80％左右。

因此将海藻糖合酶固定在带环氧基的树脂上后，可达到与游离酶相同的转化率，另外若保持在80％以上的转化率，可重复利用14批左右，大大节省生产成本。

表1为环氧树脂的基本信息

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一种树脂固定海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。