专利摘要

本发明公开了一种基于相转变溶菌酶纳米薄膜对微生物进行非基因改造的方法，该方法通过使接枝引发剂的溶菌酶发生相转变，从而在微生物(细菌、真菌、细胞)表面粘附一层接枝引发剂的溶菌酶纳米薄膜，继而可以通过原子转移自由基聚合(ATRP)实现对微生物的ATRP反应，成功对微生物进行非基因改造。该方法基于类淀粉样蛋白的粘附力，可以快速而高效的对酵母菌进行改造。同时，体系具有良好的温和性，能够适用于各种类型的微生命体。

权利要求

1.一种基于相转变溶菌酶纳米薄膜对微生物非基因改造的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：

(1)将三乙胺、溶菌酶溶解于二甲亚砜中，在冰浴冷却和氮气保护下，加入N-琥珀酰亚胺-2-溴异丁酸酯，室温搅拌4～5小时，然后将反应液在去离子水中透析，得到接枝引发剂的溶菌酶；

(2)将1～100mmol/L三(2-羧乙基)膦的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液用NaOH调节至pH值为5.0～10.0，然后将其与1～50mg/mL溶菌酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合均匀，并加入微生物，再将所得溶液铺展在基材表面，室温培育30～60分钟；随后将基材转移到质量分数为0.1％～1％的戊二醛水溶液中，室温交联30～60分钟，形成微生物活化涂层，即负载微生物的基材；

(3)将1～100mmol/L三(2-羧乙基)膦的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液用NaOH调节至pH值为5.0～10.0，然后将其与1～50mg/mL接枝引发剂的溶菌酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合均匀，再将负载微生物的基材倒扣在混合溶液表面，室温培育30～60分钟，使微生物表面粘附一层接枝引发剂的溶菌酶纳米薄膜，得到接枝引发剂的微生物；

(4)将接枝引发剂的微生物浸没于0.12mol/L氯化钠水溶液中，在氮气保护下加入溴化亚铜和五甲基二乙烯三胺，混合均匀，再加入水溶性单体，室温反应1～3小时，用0.12mol/L氯化钠水溶液清洗，得到聚合物接枝的微生物。

2.根据权利要求1所述的基于相转变溶菌酶纳米薄膜对微生物非基因改造的方法，其特征在于：所述的微生物为酵母菌、细胞、细菌中任意一种。

3.根据权利要求1所述的基于相转变溶菌酶纳米薄膜对微生物非基因改造的方法，其特征在于：所述的水溶性单体为聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯中任意一种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对微生物进行非基因改造的方法。

背景技术

在体外条件下保护和保存个体活细胞对于各种基于细胞的应用，包括细胞治疗、细胞传感器、组织工程，甚至可再生能源都是棘手的挑战。有机生命体对于环境十分的敏感，如营养水平、温度、压力、水分、盐度和pH的细微变化会破坏它们的生物学功能，从而导致细胞死亡。为了应对这一挑战，基因工程和合成生物学被用以提高细胞对环境变化的适应能力。然而这些技术面临一系列挑战，包括高复杂度、表征困难、标准化和模块化、噪声、表观遗传学、突变和意外释放到野生的风险，以及其他挑战。因此，开发一种通用的非基因工程替代品来暂时增强细胞的适应性是非常需要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述不足，提供一种基于相转变溶菌酶纳米薄膜对微生物进行非基因改造的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、将三乙胺、溶菌酶溶解于二甲亚砜中，在冰浴冷却和氮气保护下，加入N-琥珀酰亚胺-2-溴异丁酸酯，室温搅拌4～5小时，然后将反应液在去离子水中透析，得到接枝引发剂的溶菌酶。

2、将1～100mmol/L三(2-羧乙基)膦的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液用NaOH调节至pH值为5.0～10.0，然后将其与1～50mg/mL溶菌酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合均匀，并加入微生物，再将所得溶液铺展在基材表面，室温培育30～60分钟；随后将基材转移到质量分数为0.1％～1％的戊二醛水溶液中，室温交联30～60分钟，形成微生物活化涂层，即负载微生物的基材。

3、将1～100mmol/L三(2-羧乙基)膦的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液用NaOH调节至pH值为5.0～10.0，然后将其与1～50mg/mL接枝引发剂的溶菌酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合均匀，再将负载微生物的基材倒扣在混合溶液表面，室温培育30～60分钟，使微生物表面粘附一层接枝引发剂的溶菌酶纳米薄膜，得到接枝引发剂的微生物。

4、将接枝引发剂的微生物浸没于0.12mol/L氯化钠水溶液中，在氮气保护下加入溴化亚铜和五甲基二乙烯三胺，混合均匀，再加入水溶性单体，室温反应1～3小时，用0.12mol/L氯化钠水溶液清洗，得到聚合物接枝的微生物。

上述的微生物为酵母菌、细胞、细菌中任意一种。

上述的水溶性单体为聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯中任意一种。

本发明的有益效果如下：

本发明通过相转变接枝引发剂的溶菌酶，使微生物(细菌、真菌、细胞)表面粘附一层接枝引发剂的溶菌酶纳米薄膜，继而通过原子转移自由基聚合(ATRP)反应，对微生物进行非基因改造，成功实现了对微生物的ATRP反应。该方法基于类淀粉样蛋白的粘附力，可以快速而高效的对酵母菌进行改造。同时，体系具有良好的温和性，能够适用于各种类型的微生命体。

附图说明

图1是实施例1中形成的酵母菌活化涂层的扫描电子显微图。

图2是接枝聚合物的酵母菌的扫描电子显微图。

图3是接枝聚合物的酵母菌的红外表征结果。

图4是接枝聚合物的酵母菌的增殖结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、将553.4μL三乙胺溶解于10mL二甲亚砜中，然后加入100mg溶菌酶，分散均匀，在冰浴冷却和氮气保护下，加入245.8μL N-琥珀酰亚胺-2-溴异丁酸酯，室温搅拌4小时。随后将反应液在去离子水中透析5天(每12小时换一次水)，得到接枝引发剂的溶菌酶。

2、将1mL 2mmol/L三(2-羧乙基)膦的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液用NaOH调节至pH值为7.0，然后将其与1mL 1mg/mL溶菌酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合均匀，然后加入100μL OD600为0.8的酵母菌，再将所得溶液铺展在玻璃片表面，室温培育60分钟；随后将玻璃片转移到质量分数为1％的戊二醛水溶液中，室温交联60分钟，形成酵母菌活化涂层，即负载酵母菌的玻璃片。由图1可见，酵母菌固定在硅片上面，成功的制备了微生物的活化涂层。

3、将1mL50mmol/L三(2-羧乙基)膦的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液用NaOH调节至pH值为7.0，然后将其与1mL2mg/mL接枝引发剂的溶菌酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合均匀后，将负载酵母菌的玻璃片倒扣在混合溶液表面，室温下培育60分钟，使酵母菌表面粘附一层接枝引发剂的溶菌酶纳米薄膜，得到接枝引发剂的酵母菌。

4、将接枝引发剂的酵母菌浸没于5mL0.12mol/L氯化钠水溶液中，在氮气保护下加入1mg溴化亚铜和10μL五甲基二乙烯三胺，混合均匀，用注射器将50μL聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(数均分子量360)加入到上述混合物中，保持氮气保护，室温反应3小时后，用0.12mol/L氯化钠水溶液清洗，得到聚合物接枝的酵母菌。由图2电子扫描图片和图3的红外分析可见，制备得到了聚合物接枝的酵母菌。同时图4增值实验证明，得到的聚合物接枝的酵母菌(即改造酵母菌)仍然具有生命活性。这些结果说明了本发明成功对微生命酵母菌进行了非基因的接枝聚合物改造。

基于相转变溶菌酶纳米薄膜对微生物非基因改造的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。