专利摘要

本发明公开一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，以甲基丙烯酸甲酯为单体，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯为交联剂，与自由基引发剂充分混合后涂覆到硅胶表面，然后使其进行自由基聚合反应得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球，将其作为固定相填料，采用湿法装柱制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱，对三七总皂苷进行HPLC分离，对三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的分离度可达到3.02，对人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度可达到3.62，对人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的分离度可达到25.43，对人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的分离度可达到8.42。本发明的方法能将三七总皂苷中各组分完全分开，且分离效果较好。

权利要求

1.一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球作为固定相填料，采用湿法装柱制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱；将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.0-2.0mL/min，检测波长203nm，柱温箱35±10℃；启动进样阀使流动相将三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的混合溶液带入核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱中，实现三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的分离；所述核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的结构为以二氧化硅为核，以松香基高分子为壳，并高度交联在一起的结构，其中松香基高分子的结构式为：

n≥1，

式中R为：

所述核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球粒径分布为2-50μm，孔径分布为0.5-15nm，比表面积为150-350m2/g；

所述流动相为乙腈水。

2.根据权利要求1所述的分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，所述的湿法装柱为用恒压泵将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000-6000psi的压力下装柱50-100min，待柱压平衡后，将色谱柱卸下并装上柱头，即得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱。

3.根据权利要求1所述的分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，所述核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的制备方法为：以甲基丙烯酸甲酯为单体，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯为交联剂，与自由基引发剂充分混合后，均匀涂覆到硅胶表面，然后置于水相中进行自由基聚合反应，即可制得核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球。

4.根据权利要求3所述的分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，所述单体、交联剂与自由基引发剂的质量比为1-50：1-100：0.1-5。

5.根据权利要求3所述的分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，所述交联剂及单体与硅胶的质量比1：1-100。

6.根据权利要求3所述的分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，所述水相为质量分数为1-15％的十二烷基硫酸钠水溶液。

7.根据权利要求3所述的分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，所述自由基引发剂为有机过氧化物类引发剂或偶氮类引发剂。

8.根据权利要求7所述的分离三七总皂苷中单一组分的方法，其特征在于，所述自由基引发剂为过氧化二苯甲酰、偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈。

说明书

技术领域

本发明属于高效液相色谱法领域，具体涉及一种分离三七总皂苷中单一组分的方法。

背景技术

三七总皂苷包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，化学结构式分别为：

三七又名田七，性温、味甘，归肝、胃经，其茎、叶、花等均可入药，药用价值极高，在我国中药材体系中具有极高的地位。三七中的三七皂苷含量超过13％，是发挥药用价值的重要成分，其中主要活性成分为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，因此将其分离开进行提取具有重要意义。

液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术。通过改进填料的粒度及柱压，在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论，在技术上采用了高压输液泵，高效固定相和高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种色谱技术被称为高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，简称HPLC)。HPLC具有分离效能高、选择性高、灵敏度高、分析速度快和应用范围广的优势。

目前，关于三七总皂苷分离的方法报道，我们查到如下一些文献：

1.周迎春，赵怀清，梁宁，et al.高效液相色谱法同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rg1、Re、Rb1与三七皂苷R1含量[J].沈阳药科大学学报，2003，20(1):27-31；其中提到三七总皂苷中人参皂苷Rg1、Re、Rb1与三七皂苷R1的液相色谱条件，用Asahipak NH2P-50色谱柱(250mm×4.0mm)，以乙腈-水(81：19，V:V)为流动相，流速1.2mL/min，检测波长203nm，柱温为室温。

2.梁宁，赵怀清，周迎春，et al.HPLC法同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rg1与Rb1的含量[J].中草药，2002，33(8)：704-705；其中提到测定三七总皂苷中人参皂苷Rg1与Rb1的含量的液相色谱条件，用Asahipak NH2P-50色谱柱(250mm×4.0mm)，以乙腈-水(80：20，V:V)为流动相，流速1.0mL/min，检测波长203nm，柱温为室温。

3.申请号：200610093606.X，发明名称：一种三醇组人参皂苷和二醇组人参皂苷的制备方法，其中提到人参皂苷Re、Rb1、Rg1的提取，将人参或红参提取物大孔吸附树脂吸附后用低浓度有机溶剂的水溶液洗脱，然后用高浓度有机溶剂的水溶液洗脱，分别收集洗脱液，回收溶剂，即得。

然而，上述方法对三七总皂苷的分离提取不太理想，因此有必要探索一种更好的分离三七总皂苷中单一组分的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，该方法对三七总皂苷中各组分具有较好的分离度和选择性，且色谱柱机械强度更大，溶剂耐受度更高。

本发明的技术方案如下：

一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球作为固定相填料，采用湿法装柱制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱；将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.0-2.0mL/min，检测波长203nm，柱温箱35±10℃；启动进样阀使流动相将三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的混合溶液带入核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱中，实现三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的分离；所述核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的结构为以二氧化硅为核，以松香基高分子为壳，并高度交联在一起的结构，其中松香基高分子的结构式为：

式中R为：

作为技术方案的优选，所述核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球粒径分布为2-50μm，孔径分布为0.5-15nm，比表面积为150-350m2/g。

作为技术方案的优选，所述的湿法装柱为用恒压泵将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000-6000psi的压力下装柱50-100min，待柱压平衡后，将色谱柱卸下并装上柱头，即得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱。

作为技术方案的优选，所述流动相为乙腈水。

作为技术方案的优选，所述核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的制备方法为：以甲基丙烯酸甲酯为单体，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯为交联剂，与自由基引发剂充分混合后，均匀涂覆到硅胶表面，然后置于水相中进行自由基聚合反应，即可制得核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球。

作为技术方案的优选，所述单体、交联剂与自由基引发剂的质量比为1-50：1-100：0.1-5。

作为技术方案的优选，所述交联剂及单体与硅胶的质量比1：1-100。

作为技术方案的优选，所述水相为质量分数为1-15％的十二烷基硫酸钠水溶液。

作为技术方案的优选，所述自由基引发剂为有机过氧化物类引发剂或偶氮类引发剂。

作为技术方案的进一步优选，所述自由基引发剂为过氧化二苯甲酰、偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈。

核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球分离三七总皂苷的机理：

本发明使用的色谱柱的固定相填料核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球由甲基丙烯酸甲酯与富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯交联聚合而成，核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的结构模型图如图7所示。一方面，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯上面含有与三七皂苷相似的甾环结构，并且其上的手性C原子使得合成的松香基高分子色谱柱具有更好的立体选择性用于分离结果相似物，另一方面，富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯具有三个酯基，交联度更高，能形成更致密的网状结构，有利于提高色谱柱的耐压性能；微球表面孔结构可以根据被分离物质尺寸大小进行调整，有利于分离过程的吸附解析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明使用的高度交联的松香基高分子微球以天然产物松香的衍生物富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯为原料，可再生，机械强度高，安全无毒，可以用于食品级的分离。

(2)本发明使用的高度交联的松香基高分子微球为弱极性，与现有的松香基高分子微球比较，其酸值更低，属于完全中性的微球，有更好的耐碱性、膨胀度小、粒径均一、比表面积大等特点，与申请人的在先申请201710710292.1采用两个丙烯基制备的松香基高分子微球相比，机械强度高，作为色谱柱填料耐压性更高、极性更小，不会因膨胀而破坏微球的网络结构，耐压性能从8MPa提高至20MPa。

(3)本发明使用的色谱柱的固定相填料核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球既保持了二氧化硅微球粒径均一，球形度良好的特点，同时又兼顾了高度交联的松香基高分子微球孔结构规整，表面官能团丰富，机械强度大，溶剂耐受度高的优势，所以以该微球作为固定相制备得到的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱机械强度大，溶剂耐受度高，在较高的流速和压力下，没有出现压塌的现象，并且稳定性好，可重复使用，长时间使用后，色谱柱里的填料仍没有破坏、溶解，具有高于普通二氧化硅@松香基高分子色谱柱的理论塔板数，理论塔板数由10000提高到12000。

(4)本发明使用的以核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球作为固定相填料的色谱柱，对三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的分离度可达到3.02，对人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度可达到3.62，对人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的分离度可达到25.43，对人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的分离度可达到8.42，说明该色谱柱能将三七总皂苷中各组分完全分开，且分离效果较好。而商品柱C18柱对三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的分离度为4.03，对人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度为0，对人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的分离度为24.21，对人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的分离度为11.34，并不能将三七总皂苷中各组分完全分开。综合来看，本发明的以核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球作为固定相填料的色谱柱对人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度效果明显优于商品柱，且能将三七总皂苷中各组分完全分开，分离效果较好，具有较好的发展前景。

附图说明

图1为本发明对比实施例1分离三七总皂苷的分析图；

图2为本发明应用实施例1分离三七总皂苷的分析图；

图3为本发明应用实施例2分离三七总皂苷的分析图；

图4为本发明应用实施例3分离三七总皂苷的分析图；

图5为本发明应用实施例4分离三七总皂苷的分析图；

图6为本发明应用实施例5分离三七总皂苷的分析图。

图7为本发明核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的结构模型图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进一步详细说明，但不限于本发明的保护范围。

核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的制备

制备实施例1

将2.0g甲基丙烯酸甲酯，2.0g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯与0.2g偶氮二异丁腈充分混合后，均匀涂覆到400g硅胶表面，然后置于1000mL质量分数为1％的十二烷基硫酸钠水溶液中进行自由基聚合反应8h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可制得核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例所得到的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的粒径分布集中在2-10μm范围内，平均孔径为5.50nm，比表面积为350m2/g。

制备实施例2

将7.5g甲基丙烯酸甲酯，1.5g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯与2.25g偶氮二异庚腈充分混合后，均匀涂覆到225g硅胶表面，然后置于100mL质量分数为5％的十二烷基硫酸钠水溶液中进行自由基聚合反应9h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可制得核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例所得到的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的粒径分布集中在12-18μm附近，平均孔径为3.79nm，比表面积为247m2/g。

制备实施例3

将0.5g甲基丙烯酸甲酯，10g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯与14mg过氧化二苯甲酰充分混合后，均匀涂覆到10.5g硅胶表面，然后置于100mL质量分数为15％的十二烷基硫酸钠水溶液中进行自由基聚合反应10h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可制得核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例所得到的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的粒径分布集中在25-30μm附近，平均孔径为6.01nm，比表面积为312m2/g。

制备实施例4

将25g甲基丙烯酸甲酯，35g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯与3g偶氮二异庚腈充分混合后，均匀涂覆到3000g硅胶表面，然后置于100mL质量分数为5％的十二烷基硫酸钠水溶液中进行自由基聚合反应6h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可制得核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例所得到的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的粒径分布集中在32-40μm附近，平均孔径为12.79nm，比表面积为187m2/g。

制备实施例5

将50g甲基丙烯酸甲酯，100g富马海松酸三(丙烯酸乙二醇)酯与5g过氧化二苯甲酰充分混合后，均匀涂覆到250g硅胶表面，然后置于100mL质量分数为15％的十二烷基硫酸钠水溶液中进行自由基聚合反应7h，接着用无水乙醇对产物进行索氏提取，再真空干燥，即可制得核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球。

经检测分析，本实施例所得到的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球的粒径分布集中在42-50μm附近，平均孔径为15.00nm，比表面积为150m2/g。

应用核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱高效分离三七总皂苷的方法

对比实施例1应用C18柱分离三七总皂苷

商品柱C18柱，为在市场上购买得到。

一种应用C18柱分离三七总皂苷的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，用70％甲醇溶解，配制成每1L含2.0×10-3mol的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd混合溶液，进样；

(2)设定参数：将C18柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.5mL/min，检测波长203nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈水将样品带入C18柱中，进样量为20μL，实现三七总皂苷的分离，所得结果如图1所示。从图1可以看出，在保留时间35.13min时出现三七皂苷R1峰，在保留时间35.96min时出现人参皂苷Rg1峰，分离度为4.03；在保留时间35.96min时出现人参皂苷Rg1峰和人参皂苷Re峰，分离度为0；在保留时间35.96min时出现人参皂苷Re峰，在保留时间41.25min时出现人参皂苷Rb1峰，分离度为24.21；在保留时间41.25min时出现人参皂苷Rb1峰，在保留时间43.78min时出现人参皂苷Rd峰，分离度为11.34。

应用实施例1

将制备实施例1所得的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：

湿法装柱为用恒压泵将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在3000psi压力下装填30min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱，用乙腈水溶液冲洗至基线平衡即可进样。

一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，用70％甲醇溶解，配制成每1L含2.0×10-3mol的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd混合溶液，进样；

(2)设定参数：将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.5mL/min，检测波长203nm，柱温箱25℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈水将样品带入核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现三七总皂苷的分离，所得结果如图2所示。从图2可以看出，在保留时间19.64min时出现三七皂苷R1峰，在保留时间23.41min时出现人参皂苷Rg1峰，分离度为2.51；在保留时间23.41min时出现人参皂苷Rg1峰，在保留时间27.74min时出现人参皂苷Re峰，分离度为3.62；在保留时间27.74min时出现人参皂苷Re峰，在保留时间36.28min时出现人参皂苷Rb1峰，分离度为16.59；在保留时间36.28min时出现人参皂苷Rb1峰，在保留时间38.3min时出现人参皂苷Rd峰，分离度为7.68。

应用实施例2

将制备实施例2所得的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：湿法装柱为用恒压泵将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在4500psi压力下装填60min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱，用乙腈水冲洗至基线平衡即可进样。

一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，用70％甲醇溶解，配制成每1L含2.0×10-3mol的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd混合溶液，进样；

(2)设定参数：将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.5mL/min，检测波长203nm，柱温箱30℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈水将样品带入核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现三七总皂苷的分离，所得结果如图3所示。从图3可以看出，在保留时间15.01min时出现三七皂苷R1峰，在保留时间18.00min时出现人参皂苷Rg1峰，分离度为3.02；在保留时间18.00min时出现人参皂苷Rg1峰，在保留时间21.08min时出现人参皂苷Re峰，分离度为2.73；在保留时间21.08min时出现人参皂苷Re峰，在保留时间33.86min时出现人参皂苷Rb1峰，分离度为17.52；在保留时间33.86min时出现人参皂苷Rb1峰，在保留时间35.51min时出现人参皂苷Rd峰，分离度为7.12。

应用实施例3

将制备实施例3所得的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：湿法装柱为用恒压泵将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在5500psi压力下装填100min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱，用甲醇-水(80:20，V/V)冲洗至基线平衡即可进样。

一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，用70％甲醇溶解，配制成每1L含2.0×10-3mol的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd混合溶液，进样；

(2)设定参数：将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.0mL/min，检测波长203nm，柱温箱35℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈水将样品带入核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现三七总皂苷的分离，所得结果如图4所示。从图4可以看出，在保留时间24.05min时出现三七皂苷R1峰，在保留时间26.71min时出现人参皂苷Rg1峰，分离度为1.79；在保留时间26.71min时出现人参皂苷Rg1峰，在保留时间29.04min时出现人参皂苷Re峰，分离度为2.78；在保留时间29.04min时出现人参皂苷Re峰，在保留时间36.76min时出现人参皂苷Rb1峰，分离度为17.92；在保留时间36.76min时出现人参皂苷Rb1峰，在保留时间38.83min时出现人参皂苷Rd峰，分离度为8.42。

应用实施例4

将制备实施例4所得的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：湿法装柱为用恒压泵将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在6000psi压力下装填120min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱，用乙腈水冲洗至基线平衡即可进样。

一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，用70％甲醇溶解，配制成每1L含2.0×10-3mol的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd混合溶液，进样；

(2)设定参数：将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.2mL/min，检测波长203nm，柱温箱40℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈水将样品带入核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现三七总皂苷的分离，所得结果如图5所示。从图5可以看出，在保留时间16.82min时出现三七皂苷R1峰，在保留时间19.43min时出现人参皂苷Rg1峰，分离度为1.61；在保留时间19.73min时出现人参皂苷Rg1峰，在保留时间24.57min时出现人参皂苷Re峰，分离度为2.66；在保留时间24.57min时出现人参皂苷Re峰，在保留时间36.07min时出现人参皂苷Rb1峰，分离度为8.96；在保留时间36.07min时出现人参皂苷Rb1峰，在保留时间38.13min时出现人参皂苷Rd峰，分离度为4.79。

应用实施例5

将制备实施例5所得的核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球采用湿法装柱制备色谱柱，具体为：湿法装柱为用恒压泵将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子微球填充于空色谱柱中，在4000psi压力下装填20min，待柱压平衡后，将色谱柱从装柱机上取下，装上柱头，即可制备得到核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱，用乙腈水冲洗至基线平衡即可进样。

一种分离三七总皂苷中单一组分的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备样品溶液：取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，用70％甲醇溶解，配制成每1L含2.0×10-3mol的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd混合溶液，进样；

(2)设定参数：将核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱接入液相色谱仪，设置液相色谱仪的流动相流速为1.1mL/min，检测波长203nm，柱温箱45℃；

(3)分离：启动进样阀使乙腈水将样品带入核壳型二氧化硅@高度交联的松香基高分子色谱柱中，进样量为20μL，实现三七总皂苷的分离，所得结果如图6所示。从图6可以看出，在保留时间9.54min时出现三七皂苷R1峰，在保留时间11.39min时出现人参皂苷Rg1峰，分离度为2.02；在保留时间11.39min时出现人参皂苷Rg1峰，在保留时间13.03min时出现人参皂苷Re峰，分离度为1.54；在保留时间13.03min时出现人参皂苷Re峰，在保留时间33.59min时出现人参皂苷Rb1峰，分离度为25.43；在保留时间33.59min时出现人参皂苷Rb1峰，在保留时间36.20min时出现人参皂苷Rd峰，分离度为5.61。

一种分离三七总皂苷中单一组分的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。