专利摘要

本发明涉及一种利用酵母产海藻糖制备生物燃料电池的方法。将酵母菌，大肠杆菌和葡萄糖氧化酶同时固定在一个碳毡电极作为阳极，空白碳毡电极为阴极，以酵母菌发酵培养液为阳极液，过氧化氢溶液为阴极液，并在阴极室和阳极室之间设置质子交换膜而组成生物燃料电池。本发明设计形成了多酶偶联反应，具有高效而精准的反应特点，同时反应中未使用强酸，强碱及有机溶剂，避免了环境污染，绿色环保。

权利要求

1.一种利用酵母产海藻糖制备生物燃料电池的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配制葡萄糖氧化酶溶液，将空白电极放于葡萄糖氧化酶溶液中浸泡后取出电极备用；

（2）将酵母菌和大肠杆菌分别发酵培养，并分别取发酵液离心洗涤，将得到的两种固形菌体沉淀物混合，加入PBS稀释得到混合菌液，将步骤（1）获取的电极在混合菌液中摇瓶浸泡后，取出电极备用；

（3）以步骤（2）所得电极为阳极，空白电极为阴极，酵母菌发酵培养液为阳极液，30%过氧化氢溶液为阴极液，在阴极室和阳极室之间放置质子交换膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

（4）使用冷激处理的方法对酵母菌进行周期性刺激。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，葡萄糖氧化酶溶液为27u/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，空白电极选用表面积1.5cm×1.5cm的碳毡电极，将空白电极放入葡萄糖氧化酶溶液中，200r/min 37℃浸泡12 h后取出备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述酵母菌为酿酒酵母YPH499；大肠杆菌为BL21(DE3)-pET22b(+)-treA。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酵母菌发酵培养液选用YPD培养液；大肠杆菌培养液选用LB培养液。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酵母菌发酵培养方式为：按4%接种量将酵母菌冻存液接种至YPD培养液中，28-30℃ 200r/min摇瓶培养24h，得到酵母菌发酵液；

大肠杆菌发酵培养方式为：按4%接种量将大肠杆菌冻存液接种至LB培养液中，37℃200r/min摇瓶培养12 h，得到大肠杆菌发酵液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，分别取发酵液离心洗涤，离心转速为2800rpm，时间10min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，将步骤（1）所得的电极放入混合菌液中，200r/min、28-30℃下浸泡10 h，取出电极。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，阳极液和阴极液等体积，质子交换膜为杜邦Nafion 117膜。

说明书

技术领域

本发明涉及化学和生物学领域，特别是涉及一种利用酵母产海藻糖制备生物燃料电池的方法。

背景技术

燃料电池是通过电化学反应将燃料与氧化剂的化学能直接转换成电能的装置，它被广泛应用于军事国防及民用的电力、汽车、通信等领域，具有极其广阔的应用前景。膜电极组件是燃料电池的核心单元，它是由可传导质子的膜和分别在膜两侧的电极（阴极和阳极）构成，燃料供应到阳极中，而氧化剂供应到阴极中，从而产生氧化还原反应。

生物燃料电池是利用燃料电池的原理，以有机物如葡萄糖、乙醇等为燃料，利用酶或者微生物组织作为催化剂，将有机物中的化学能转化成电能的装置。如有利用假单胞菌为阳极菌株，以葡萄糖等物质为有机底物构成燃料电池的（公开号：CN102255096A），也有利用啤酒酵母和培养基为阳极，代谢阳极液葡萄糖构成燃料电池（公开号：CN1588683A），但这些所用阳极菌都是单一菌种，且需外源添加作为阳极反应的有机物。

海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，它是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性双糖。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。由于其独特的生物学功能，它在食品、分子生物学、医药、化妆品、农业等方面具有广泛的应用前景。海藻糖作为酵母的一种应激代谢物，在酵母中的含量最大。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种利用酵母产海藻糖制备生物燃料电池的方法。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用酵母产海藻糖制备生物燃料电池的方法，包括如下步骤：

（1）配制葡萄糖氧化酶溶液，将空白电极放于葡萄糖氧化酶溶液中浸泡后取出电极备用；

（2）将酵母菌和大肠杆菌分别发酵培养，并分别取发酵液离心洗涤，将得到的两种固形菌体沉淀物混合，加入PBS稀释得到混合菌液，将步骤（1）获取的电极在混合菌液中摇瓶浸泡后，取出电极备用；

（3）以步骤（2）所得电极为阳极，空白电极为阴极，酵母菌发酵培养液为阳极液，30%过氧化氢溶液为阴极液，在阴极室和阳极室之间放置质子交换膜。

本发明的方法，还包括：步骤（4）使用冷激处理的方法对酵母菌进行周期性刺激。

本发明的方法，所述步骤（1）中，葡萄糖氧化酶溶液为27 u/mL。

本发明的方法，所述步骤（1）中，空白电极选用表面积1.5cm×1.5cm的碳毡电极，将空白电极放入葡萄糖氧化酶溶液中，200r/min 37℃浸泡12 h后取出备用。

本发明的方法，所述步骤（2）中，所述酵母菌为酿酒酵母YPH499；大肠杆菌为BL21(DE3) (pET22b(+)-treA)。

本发明的方法，，所述步骤（2）中，酵母菌发酵培养液选用YPD培养液；大肠杆菌培养液选用LB培养液。所述YPD培养液组分（质量分数）为：酵母膏1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，pH自然，108℃条件下灭菌20min；所述LB培养液组分（质量分数）为：酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，pH自然，121℃条件下灭菌20min；

本发明的方法，所述步骤（2）中，酵母菌发酵培养方式为：按4%接种量将酵母菌冻存液接种至YPD培养液中，28-30℃ 200r/min摇瓶培养24h，得到酵母菌发酵液；

大肠杆菌发酵培养方式为：按4%接种量将大肠杆菌冻存液接种至LB培养液中，37℃ 200r/min摇瓶培养12 h，得到大肠杆菌发酵液。

本发明的方法，所述步骤（2）中，分别取发酵液离心洗涤，离心转速为2800rpm，时间10min。

本发明的方法，所述步骤（2）中，将步骤（1）所得的电极放入混合菌液中，200r/min、28-30℃下浸泡10 h，取出电极。

本发明的方法，所述步骤（3）中，阳极液和阴极液等体积，质子交换膜为杜邦Nafion 117膜。

本发明的原理如图1所示，在自然条件下，酵母菌会产海藻糖，大肠杆菌会产海藻糖水解酶，将酵母菌和大肠杆菌共同固定到一个电极上，两种菌体的产物海藻糖和海藻糖水解酶则特异性的发生反应，生成葡萄糖。固定在同一电极上的葡萄糖氧化酶又特异性的催化产物葡萄糖，生成葡萄糖酸，反应过程中有电子失去即可作为电池的阳极，而阴极室的过氧化氢阴极液从而得到电子，整体反应中有电子得失从而组成一个燃料电池体系。

本发明相对于现有的技术具有如下的优点：

（1）本发明设计的生物燃料电池形成了多酶偶联反应，在反应过程中表现出高选择性，高效率和高度协调性的特点，提高了各反应物的利用率。

（2）本发明中所使用的酵母菌和大肠杆菌两种菌种，均具有较强的生长能力，环境适应能力强，因此培养较为简单。

（3）本发明中未使用强酸，强碱及有毒的有机溶剂，避免环境污染，做到了清洁环保。

附图说明

图1是本发明利用酵母产海藻糖制备燃料电池的方法的原理图；

图2是本发明的生物燃料电池的结构示意图；

图3是本发明实施例2中电压信号采集卡输出数据的电压曲线图；

图4是本发明实施例3中电压信号采集卡输出数据的电压曲线图；

图2中1.阳极室；2.阴极室；3.质子交换膜；4.碳毡电极；5.电压信号采集卡。

具体实施方式

以下通过结合实施例和附图对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例中的双室燃料电池，阳极室和阴极室均由有机玻璃加工制成，阳极室的容量=阴极室的容量，阳极室和阴极室依靠质子交换膜实现分隔，质子交换膜为杜邦Nafion117膜。

实施例中所用菌种为：酵母菌为酿酒酵母YPH499，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号CICC 1002；大肠杆菌为BL21(DE3) (pET22b(+)-treA)，为实验室自行合成的携带treA海藻糖水解酶基因的重组菌。

YPD培养液组分（质量分数）为：酵母膏1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，pH自然，108℃条件下灭菌20min。

LB培养液组分（质量分数）为：酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，pH自然，121℃条件下灭菌20min。

实施例1

（1）称量6.1mg 222 u/mg的葡萄糖氧化酶固体倒入150mL锥形瓶，加蒸馏水搅拌，配制成50mL 27 u/mL葡萄糖氧化酶溶液，将一块空白碳毡电极（表面积1.5cm×1.5cm）放入该溶液中，200r/min 37℃浸泡12 h后取出，-4℃冷藏备用；

（2）将2 mL酵母菌冻存液接种于装有50mL YPD培养液的250mL锥形瓶中，200r/min28-30℃ 摇瓶培养24 h，得到酵母菌发酵液，备用；

在酵母菌发酵经过12 h左右时，将2mL大肠杆菌冻存液接种于装有50mL LB培养液的250mL锥形瓶中，200r/min 37℃ 摇瓶培养12 h，得到大肠杆菌发酵液，备用；

将酵母菌发酵液和大肠杆菌发酵液分别用离心机在2800rpm条件下离心10min后，PBS洗涤两次，再以该条件离心，收集两种菌体固形沉淀物，然后将两种菌体固形沉淀物混合并用pH=7.4的0.1mol/L PBS溶液稀释至20mL，得到混合菌液；

将步骤（1）所得的浸泡过葡萄糖氧化酶的碳毡电极放入步骤（2）所得的混合菌液中，200r/min 28-30℃浸泡10 h，取出电极，连接钛丝，得到阳极；

（3）步骤（2）所得碳毡电极为阳极，连接钛丝的空白碳毡电极为阴极，阳极室内加入36mL YPD培养液，阴极室内加入36mL 30%过氧化氢溶液，中间用质子交换膜作为电解质将阴、阳极室分隔开。然后将制备好的阴阳极分别放入阴极室和阳极室，并把电极上的钛丝与与外电路相连，形成双室燃料电池；装置结构如图2所示；

电池的测试：将电压信号采集卡串联在外电路，设置每隔2min采集一次电压数据，记录8 h内电池的产电情况。根据结果显示，在一定时间内电池可以持续产电，最高产电量为299.76mV，反应至200min左右时产电趋势平缓，基本停止产电。

实施例2

（1）称量6.1mg 222 u/mg的葡萄糖氧化酶固体倒入150mL锥形瓶，加蒸馏水搅拌，配制成50mL 27 u/mL葡萄糖氧化酶溶液，将一块空白碳毡电极（表面积1.5cm×1.5cm）放入该溶液中，200r/min 37℃浸泡12 h后取出，-4℃冷藏备用；

（2）将2mL酵母菌冻存液接种于装有50mL YPD培养液的250mL锥形瓶中，200r/min28-30℃ 摇瓶培养24 h，得到酵母菌发酵液，备用；

在酵母菌发酵经过12 h左右时，将2mL大肠杆菌冻存液接种于装有50mL LB培养液的250mL锥形瓶中，200r/min 37℃ 摇瓶培养12 h，得到大肠杆菌发酵液，备用；

将酵母菌发酵液和大肠杆菌发酵液分别用离心机在2800rpm条件下离心10min后，PBS洗涤两次，再以该条件离心，收集两种菌体固形沉淀物，然后将两种菌体固形沉淀物混合并用pH=7.4的0.1mol/L PBS溶液稀释至20mL，得到混合菌液；

将步骤（1）所得的浸泡过葡萄糖氧化酶的碳毡电极放入步骤（2）所得的混合菌液中，200r/min 28-30℃浸泡10 h，取出电极，连接钛丝，得到阳极；

（3）步骤（2）所得碳毡电极为阳极，连接钛丝的空白碳毡电极为阴极，阳极室内加入36mL YPD培养液，阴极室内加入36mL 30%过氧化氢溶液，中间用质子交换膜作为电解质将阴、阳极室分隔开。然后将制备好的阴阳极分别放入阴极室和阳极室，并把电极上的钛丝与与外电路相连，形成双室燃料电池；

电池的测试：将电压信号采集卡串联在外电路，使用冷激处理的方法每隔约6 h对酵母菌进行周期性刺激，使其分泌更多海藻糖，每隔2min采集一次电压数据，记录64 h内电池的产电情况。根据图3结果所示，对酵母菌进行周期性刺激，所得电压结果也随之呈现周期性变化，并且产电效果持续且基本稳定。

实施例3

（1）称量6.1mg 222 u/mg的葡萄糖氧化酶固体倒入150mL锥形瓶，加蒸馏水搅拌，配制成50mL 27 u/mL葡萄糖氧化酶溶液，将一块空白碳毡电极（表面积1.5cm×1.5cm）放入该溶液中，200r/min 37℃浸泡12 h后取出，-4℃冷藏备用。

（2）将2mL酵母菌冻存液接种于装有50mL YPD培养液的250mL锥形瓶中，200r/min28-30℃ 摇瓶培养24 h，得到酵母菌发酵液，备用；

在酵母菌发酵经过12 h左右时，将2mL大肠杆菌冻存液接种于装有50mL LB培养液的250mL锥形瓶中，200r/min 37℃ 摇瓶培养12 h，得到大肠杆菌发酵液，备用；

将酵母菌发酵液和大肠杆菌发酵液分别用离心机在2800rpm条件下离心10min后，PBS洗涤两次，再以该条件离心，收集两种菌体固形沉淀物，然后将两种菌体固形沉淀物混合并用pH=7.4的0.1mol/L PBS溶液稀释至20mL，得到混合菌液；

将步骤（1）所得的浸泡过葡萄糖氧化酶的碳毡电极放入步骤（2）所得的混合菌液中，200r/min 28-30℃浸泡10 h，取出电极，连接钛丝，得到阳极；

（3）步骤（2）所得碳毡电极为阳极，连接钛丝的空白碳毡电极为阴极，阳极室内加入50mL YPD培养液，阴极室内加入50mL 30%过氧化氢溶液，中间用质子交换膜作为电解质将阴、阳极室分隔开。然后将制备好的阴阳极分别放入阴极室和阳极室，并把电极上的钛丝与与外电路相连，形成双室燃料电池。

电池的测试：将电压信号采集卡串联在外电路，使用冷激处理的方法不间断地对酵母菌进行连续性刺激，使其分泌更多海藻糖，每隔1min采集一次电压数据，记录72 h内电池的产电情况。根据图4结果所示，对酵母菌进行连续性刺激，所得电压结果也一直保持持续不变的状态，且维持在较高的电压值水平。

一种利用酵母产海藻糖制备生物燃料电池的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。