一种经过表面修饰活化的上转换发光材料

IPC分类号 : C09K11/02,G01V15/00

申请号

CN200410000914.4

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专利摘要

本发明公开了一种表面覆盖一层薄而均匀的SiO2，SiO2层上由硅烷化衍生物修饰而得到活性游离基团，进而通过双功能交联剂与抗体、酶、寡核苷酸、蛋白质等生物活性分子相连接的上转换发光材料；本发明使用了全新的方法系统对上转换发光材料表面进行了修饰与活化，使得经过表面修饰活化的上转换发光材料可以作为一种全新的生物分析标记物，以极高的稳定性、灵敏性、灵活性应用于传统标记物所涉及的各个领域。

权利要求

1、一种上转换发光材料，其特征在于其表面覆盖一层薄而均匀的SiO₂。

2、如权利要求1所述的上转换发光材料，其特征在于SiO₂层上包含硅烷化衍生物修饰而得到活性游离基团。

3、如权利要求2所述的上转换发光材料，其特征在于所述的硅烷化衍生物是三乙氧基-3-氨基丙基硅烷。

4、如权利要求1-3之一所述的上转换发光材料，其特征在于它还连有接生物活性分子。

5、如权利要求4所述的上转换发光材料，其特征在于它是通过双功能交联剂与选自抗体、酶、寡核苷酸、蛋白质的生物活性分子连接的。

6、如权利要求5所述的上转换发光材料，其特征在于所述的双功能交联剂为葡聚糖、氨基羧基聚乙二醇、双氨基聚乙二醇、戊二醛、对二苯甲醛。

7、一种生物检测装置，其特征在于包括权利要求4-6之一的上转换发光材料作为生物标记物。

8、一种对上转换发光材料进行表面修饰处理的方法，其特征在于包括：

(1)对上转换发光材料表面进行硅化处理形成SiO₂层；

(2)上转换发光材料所形成的SiO₂层与硅烷化试剂的衍生物反应，修饰活性游离基团。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于硅烷化衍生物是三乙氧基-3-氨基丙基硅烷。

10、如权利要求8所述的方法，其特征在于活性游离基团选自-NH₂、-COOH、-OH。

11、如权利要求8所述的方法，其特征在于进一步包括步骤(3)：将步骤(2)所得的上转换发光材料通过其表面修饰的活性游离基团，经双功能交联剂与生物活性分子相连接，所述生物活性分子选自抗体、酶、寡核苷酸、蛋白质。

12、如权利要求11所述的方法，其特征在于所述双功能交联剂为葡聚糖、氨基羧基聚乙二醇、双氨基聚乙二醇、戊二醛、对二苯甲醛。

13、如权利要求11或12所述的方法，其特征在于采用戊二醛作为双功能交联剂，和低浓度的NaBH₄作为还原剂。

14、如权利要求13所述的方法，其特征在于进一步经BSA和Tween 20封闭。

15、如权利要求11-14任一项所述的方法，其特征在于步骤(1)和(2)是有机相中进行，并且以蒸干体系结束反应。

16、一种生物标记物的制备方法，其特征在于该方法包含如下步骤：

上转换发光材料表面硅化：100体积份异丙醇中加入2-3体积份氨水和3-4体积份H₂O，混合均匀；称量100重量份UCP，将混合液反应体系加入其中，用超声波处理30s将反应体系充分混合均匀；放入磁转子，在30-50℃水浴中，磁力搅拌，平衡20-40min；悬浊液反应体系，加入0.3-0.5体积份正硅酸乙脂；30-50℃磁力搅拌器搅拌反应3-5h；上口改为蒸馏系统，将水浴升温至80-100℃左右，磁力搅拌，蒸干烧瓶中的混合液反应体系；

上转换发光材料表面氨基化：上一步得到的UCP中加入100体积份三氯甲烷，用超声波处理30s将烧瓶中的体系充分混合均匀，并倒入在实验准备中处理好的烧瓶中；烧瓶中的悬浊液反应体系，加入0.1-0.3体积份APES，并放入磁转子，上口接蒸馏系统；将烧瓶放入60-80℃左右水浴中磁力搅拌，蒸干混合液反应体系；将UCP连同烧瓶放入100-120℃烘箱中老化5-8h；老化的UCP中加入20体积份水，超声波处理30s将烧瓶中的体系充分混合均匀；将悬浊液倒入离心管中，用少量水清洗烧瓶，洗液合并入离心管中；用水作为清洗液进行12000r/min离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，超声30s混匀后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；离心管中的UCP沉降物中加入少量水，用超声波处理30s将其充分混合均匀；将UCP悬浊液倒入蒸发皿中，100-120℃蒸干；

上转换发光材料表面醛基化：将100重量份氨基化UCP加入圆底磨口烧瓶中；将85-90体积份pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，加入盛有氨基化UCP的圆底磨口烧瓶中，用超声波处理30s将烧瓶中的反应体系充分混合均匀；UCP悬浊液反应体系中，加入10-15体积份50％戊二醛，磁力搅拌，常温反应1-2h；将UCP悬浊液反应体系分别倒入离心管中，用少量pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共4次，超声30s混匀后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；

17、如权利要求16所述的生物标记物的制备方法，其特征在于该方法还包含如下步骤：

100重量份醛基化UCP中，加入99-99.2体积份3-5℃预冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，用超声波处理30s充分混匀；UCP悬浊液反应体系中，加入0.8-1体积份1-3mg/ml抗体，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4ml40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，搅拌反应1-3h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4重量份NaBH₄，3-5℃，搅拌反应1-2h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB缓冲液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN₃，清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入磨口试剂瓶中；将UCP-抗体标记物保存于3-5℃备用；

18、如权利要求16所述的生物标记物的制备方法，其特征在于该方法还包含如下步骤：

100重量份醛基化UCP中，加入100体积份3-5℃预冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，用超声波处理30s充分混匀；UCP悬浊液反应体系中，加入1-3重量份亲合素，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4ml 40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，搅拌反应1-3h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4重量份NaBH₄，3-5℃，搅拌反应1-2h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN₃，清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入磨口试剂瓶中；将UCP-生物素标记物保存于3-5℃备用；

19、如权利要求16所述的生物标记物的制备方法，其特征在于该方法包含如下步骤：

上转换发光材料表面羧基化：1000-1100重量份琥珀酸酐，加入100体积份pH＝10-12，0.1-1.0mol/L PB缓冲液中，水浴加热使溶解；将混合液反应体系，加入盛有100重量份氨基化UCP的圆底磨口烧瓶中，用超声波处理30s将烧瓶中的反应体系充分混合均匀；磁力搅拌，室温反应7-9h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，pH＝3-5，0.01-0.05mol/L的PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用pH＝3-5，0.01-0.05mol/LPB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共4次，超声处理30s后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；

上转换发光材料表面羧基的EDC活化：盛有羧基化UCP沉降物的离心管中，加入60体积份pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB缓冲液，用超声波处理30s充分混匀，将UCP悬浊液反应体系倒入烧瓶中；共用40体积份pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB缓冲液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；UCP悬浊液反应体系中，加入90-110重量份EDC，常温搅拌反应1-2h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用pH＝3-5，0.01-0.05mol/LPB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝3-5，0.01-0.05mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心10-15min，共2次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；

20、如权利要求19所述的生物标记物的制备方法，其特征在于该方法还包含如下步骤：

99体积份3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，加入1-3mg/ml抗体1体积份，混合均匀；60体积份上述反应混合液加入盛有羧基被活化的UCP沉降物的离心管中，超声波处理30s充分混匀，将悬浊液反应体系倒入烧瓶中；用剩余的40体积份3-5℃预冷的反应混合液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4ml 40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN3，清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分多次对离心管进行清洗，洗液合并入磨口试剂瓶中；将UCP-抗体标记物保存于3-5℃备用；

21、如权利要求19所述的生物标记物的制备方法，其特征在于该方法还包含如下步骤：

100体积份3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，加入1-3重量份亲合素，混合均匀；60体积份上述反应混合液加入盛有羧基被活化的UCP沉降物的离心管中，超声波处理30s充分混匀，将悬浊液反应体系倒入烧瓶中；用剩余的40体积份3-5℃预冷的反应混合液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4ml 40mg/ml牛血清白蛋白BSA，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液，其为pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN₃，清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入磨口试剂瓶中；将UCP-亲合素标记物保存于3-5℃备用；

22、如权利要求16、17、18、19、20或21所述的生物标记物的制备方法，其特征在于该方法中的温度参数3-5℃均可以是4℃。

说明书

技术领域

本发明涉及一种上转换发光材料，特别是涉及一种经过表面修饰活化的上转换发光材料及其作为生物标记物在生物领域中的应用。

技术背景

背景技术

上转换发光材料(Up-Converting Phosphor，下称UCP，见附图1)是一种可对能量进行上转的无机合成物，即UCP可吸收低能量的(长波长)红外光，但却发射高能量的(短波长)可见光。UCP是由几种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的。在这种材料中有三种主要的成分：主基质、吸收子和发射子。

采用合成法可以制得含有不同主基质、吸收子、发射子的UCP。然而，UCP的主基质一般是氧硫化物、氟化物、镓酸盐以及硅酸盐等，这几种物质的表面均没有可以利用的基团，使生物活性分子无法直接共价固定于UCP表面。至于UCP连接生物活性分子的方法，已有技术均存在一定的缺陷，例如：UCP未经任何处理，而只是凭借其纳米级颗粒表面带静电的特性，直接吸附生物活性分子，这使得UCP在生物分析过程中稳定性、重现性无法得到保证；即使在对UCP表面进行了硅化与修饰的实验中，由于连接生物活性分子时，未对不稳定的Schiff碱(-CH＝N-)进行进一步的处理，使得UCP与生物活性分子的连接产物由于Schiff碱(-CH＝N-)不稳定、易水解，而无法长期保存。如何实现UCP表面活化的高效率、高稳定性及重现性，并与此同时最大限度地保持生物活性分子的活性不受损伤，已有技术中并未明确教导相应的解决方案。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种经过表面修饰处理的UCP。具体地说，该UCP的表面覆盖有一层薄而均匀的SiO₂。有利地，SiO₂层上进一步包含经硅烷化试剂衍生物修饰而得到的活性游离基团，所述硅烷化试剂衍生物优选为三乙氧基-3-氨基丙基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，APES)，所述活性游离基团包括-NH₂、-COOH、-OH，优选为-NH₂。

本发明的另一目的是提供一种生物标记物，包括经表面硅化和表面功能化处理的UCP和生物活性分子，其中UCP与生物活性分子是通过双功能交联剂连接的，所述双功能交联剂包括葡聚糖(dextran linker)、NH₂-PEG-COOH(PEG＝聚乙二醇)、NH₂-PEG-NH₂、戊二醛、对二苯甲醛，所述生物活性分子包括但不限于抗体、酶、寡核苷酸、蛋白质。

另外，本发明进一步提供一种生物检测装置，其特征在于包括上述生物标记物。本发明修饰活化的UCP作为生物标记物在生物分析中，以无本底干扰、无粹灭、适于多重分析和定量分析等显著优势，从本质上有别于传统标记物。其在快速免疫分析、微点阵、高通量药物筛选、基因组学研究、外科手术组织成像、食品环境检测以及生化战防御等方面都将得到广泛地应用。

在另一方面，本发明还提供了制备本发明经表面修饰处理UCP的方法。在现有的一些技术中，UCP表面硅化与氨基化后，立即采用高速离心的方法将UCP从反应体系中分离，实验证明由于此时UCP表面的硅层并未完全硬化，高速离心的过程中会使大量的颗粒牢固地粘于一起，并随着硅层的硬化既使超声也无法分离，这为后期UCP标记物在生物分析中的应用带来潜在的障碍；而本发明所采取的硅化与氨基化分开进行、以蒸馏结束反应分离UCP的方法，对这一问题予以了针对性的解决：

A.本发明中在硅化反应完全后，采用蒸干体系的方法分离出已硅化好、但硅层尚未硬化的UCP颗粒，这样一来保证了UCP颗粒形态的完整性以及颗粒之间的独立性；

B.硅化完成后，在硅层硬化老化之前立即进行氨基化反应，由此可最大程度地保护与利用UCP表面硅层上的-OH，提高氨基化效率。因为，硅层硬化老化的过程实际就是两分子-OH失去一分子H₂O结合成-O-，即-OH急剧减少的过程；

C.氨基化后，最终的高温老化过程使硅层在UCP的表面彻底硬化，保证了UCP表面修饰后的稳定性。

具体地说，本发明所述方法包括：

(1)UCP表面硅化：将UCP的表面覆盖一层薄而均匀的SiO₂，通过Si(OC₂H₅)₄在含有NH₃的液相中水解就可以实现。具体反应如下：

(2)UCP的表面功能化：UCP表面硅化所形成的SiO₂层，与硅烷化试剂的衍生物反应，便可以在UCP的SiO₂层上修饰活性游离基团：-NH₂、-COOH、-OH等，使UCP可进行后续的连接反应。

三乙氧基-3-氨基丙基硅烷一氯-十二酰氯-二甲基硅烷

一氯-癸酰甲氧基-二甲基硅烷三乙氧基-3-巯基丙基硅烷

优选地，本发明利用三乙氧基-3-氨基丙基硅烷(APES)在UCP的硅层表面修饰-NH₂，

具体反应如下：

本发明UCP硅化以及APES修饰的过程均在有机相中进行，并且以蒸干体系结束反应，藉此提高了UCP表面硅化以及修饰的效率，同时具备产量高、操作简便等优点。

在另一方面，本发明进一步提供制备本发明生物标记物的方法，包括在上述步骤(1)和(2)之后进行以下操作：

(3)UCP连接生物活性分子：经过功能化的UCP通过它表面所带有的活性游离基团(例如-NH2)，经双功能交联剂与生物活性分子相连接。在本发明中，可采用戊二醛、碳二亚胺(EDC)或物理吸附法，在UCP表面连接生物活性分子(见图4、图5、图6、图7、图8)。

具体地说，本发明生物标记物的制备方法包含如下步骤：

上转换发光材料表面硅化：100体积份异丙醇中加入2-3体积份氨水和3-4体积份H₂O₃，混合均匀；称量100重量份UCP，将混合液反应体系加入其中，用超声波处理30s将反应体系充分混合均匀；放入磁转子，在30-50℃水浴中，磁力搅拌，平衡20-40min；悬浊液反应体系，加入0.3-0.5体积份正硅酸乙脂；30-50℃磁力搅拌器搅拌反应3-5h；上口改为蒸馏系统，将水浴升温至80-100℃左右，磁力搅拌，蒸干烧瓶中的混合液反应体系；即得本发明表面硅化的UCP；

上转换发光材料连接抗体：100重量份醛基化UCP中，加入99-99.2体积份3-5℃预冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，用超声波处理30s充分混匀；UCP悬浊液反应体系中，加入0.8-1体积份1-3mg/ml抗体(人抗体、牛抗体、羊抗体、马抗体、兔抗体、鼠抗体等，以上抗体均由北京鼎国生物技术发展中心提供)，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液配制)，3-5℃，搅拌反应1-3h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4重量份NaBH₄，3-5℃，搅拌反应1-2h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB缓冲液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB缓冲液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN₃)清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入磨口试剂瓶中；将UCP-抗体标记物保存于3-5℃备用；即得本发明UCP-抗体标记物；

上转换发光材料连接亲合素：100重量份醛基化UCP中，加入100体积份3-5℃预冷的pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，用超声波处理30s充分混匀；UCP悬浊液反应体系中，加入1-3重量份亲合素，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝8-10，0.01-0.1mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液配制)，3-5℃，搅拌反应1-3h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4重量份NaBH₄，3-5℃，搅拌反应1-2h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN₃)清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入磨口试剂瓶中；将UCP-生物素标记物保存于3-5℃备用；即得本发明UCP-亲合素标记物；

本发明生物标记物还可以用EDC还原法制备，其中包含如下步骤：

上转换发光材料表面羧基化：1000-1100重量份琥珀酸酐，加入100体积份pH＝10-12，0.1-1.0mol/l PB缓冲液中，水浴加热使溶解；将混合液反应体系，加入盛有100重量份氨基化UCP的圆底磨口烧瓶中，用超声波处理30s将烧瓶中的反应体系充分混合均匀；磁力搅拌，室温反应7-9h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，pH＝3-5，0.01-0.05mol/L的PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用pH＝3-5，0.01-0.05mol/LPB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共4次，超声处理30s后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；即得本发明表面羧基化的UCP；

上转换发光材料连接抗体：99体积份3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，加入1-3mg/ml抗体(人抗体、牛抗体、羊抗体、马抗体、兔抗体、鼠抗体等，以上抗体均由北京鼎国生物技术发展中心提供)1体积份，混合均匀；60体积份上述反应混合液加入盛有UCP(羧基被活化)沉降物的离心管中，超声波处理30s充分混匀，将悬浊液反应体系倒入烧瓶中；用剩余的40体积份3-5℃预冷的反应混合液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液)，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN₃)清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分多次对离心管进行清洗，洗液合并入磨口试剂瓶中；将UCP-抗体标记物保存于3-5℃备用；即得本发明UCP-抗体标记物；

上转换发光材料连接亲合素：100体积份3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/LPB缓冲液中，加入1-3重量份亲合素，混合均匀；60体积份上述反应混合液加入盛有UCP(羧基被活化)沉降物的离心管中，超声波处理30s充分混匀，将悬浊液反应体系倒入烧瓶中；用剩余的40体积份3-5℃预冷的反应混合液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应3-5h；UCP悬浊液反应体系中，加入2-4m1 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/l PB缓冲液配制)，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，3-5℃，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共2次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP封闭液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，含0.5-1.5％BSA和0.1-1.0％Tween 20)，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP封闭液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100体积份UCP悬浊液反应体系，3-5℃，搅拌反应1-3h；将UCP悬浊液反应体系倒入离心管中，用3-5℃预冷的UCP保存液(pH＝6.5-8.0，0.01-0.1mol/L PB缓冲液中，含0.1-0.3％BSA、0.01-0.1％Tween 20、0.01-0.05％NaN₃)清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用3-5℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，离心15-30min，共1次，不重悬沉降物，离心10-15min，共1次，搅拌震荡后，离心15-30min，共1次，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向盛有UCP沉降物的离心管中，加入60体积份3-5℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40体积份3-5℃预冷的UCP保存液分为多次对离心管进行清洗，洗液也合并入磨口试剂瓶中；将UCP-亲合素标记物保存于3-5℃备用；即得本发明UCP-亲合素标记物；

上述保存温度3-5℃，其中优选4℃。

上述方法解决了已有技术UCP表面修饰与活化过程中稳定性、重复性差以及效率低的缺点，同时具有以下特点：

A.本发明中戊二醛还原法中虽然是使用了与脂肪链相连接的醛基，即戊二醛作为双功能交联剂，但在使用戊二醛的同时采用了NaBH₄作为还原剂，对生成的Schiff碱(-CH＝N-)进行还原；同时低浓度的NaBH₄确保了对生物活性分子极低的损伤；且反应环境选用碱性缓冲体系提高了Schiff碱(-CH＝N-)的暂时稳定性；

B.与传统的单一体系法相比，我们在EDC法中采用了多种变换的反应环境，既保证了中间活化产物的稳定性，同时又使得生物活性分子的活性不受损伤；

C.UCP完成了与生物活性分子的连接后，以BSA与Tween 20进行封闭，保证下一步以UCP作为标记物的生物分析过程具有极低的非特异；本发明实现了UCP表面活化的高效率及高稳定性、重现性，并与此同时最大限度的保持生物活性分子的活性不受损伤。为后续的UCP在多种生物分析中的应用，打下坚实的基础。

因此，惰性的无机合成材料UCP在经过本发明一系列表面修饰与活化后，其绝无仅有的能量上转现象在生物分析中得到充分地发挥。其作为生物标记物拥有放射性同位素、酶、荧光标记物、化学发光标记物、胶体金等传统标记物所无法比拟的优势：

A.UCP中吸收子与发射子均掺杂于主晶体中，属于内致发光，这使它的发光信号不会受到检测环境(温度、被检物所处基质等因素)影响。这意味着在野外环境和实验室条件下，对全血、尿液、唾液、组织匀浆等可进行同样高灵敏地分析，而无需顾及标记物的稳定性。

B.不同组成的UCP可具有不同的激发光谱和(或)发射光谱，且反STOKES位移大，发射光波长范围窄。这就为UCP进行多重分析提供了基础。

C.UCP独有的上转换发光现象决定了它不存在背景干扰，从而造就了UCP高灵敏度的特性。

D.用紫外光对荧光标记物进行激发时，会对细胞、DNA等被检测的生物样品产生损伤，而UCP采用红外光源为激发光，所以用UCP作为标记物可对细胞或活体进行无损伤的动态监测。

E.一些荧光标记物在检测过程中会产生荧光淬灭，使得时间分辨检测(time-resolved assay)无法准确进行，而UCP发光性能稳定，因而用它做标记物使实验方法更为灵活，不受标记物的限制。

F.酶、放射性同位素等标记物在应用的过程中通常都会产生一些对环境有害的物质，而UCP吸收红外光、发射可见光、自身性质又极稳定，因而使用安全。

G.与胶体金技术相比，UCP突出地显示了它能够准确灵活地进行定量分析、多重分析的优势。修饰活化的UCP通过与多种生物活性分子相连接在高通量药物筛选、基因组学研究、外科手术组织成像、食品环境检测以及生化战的防御中都将发挥不可估量的作用。实验部分

材料：本发明所用UCP由上海科炎光电技术有限公司提供。

实验例1.UCP表面氨基化效率检测：

说明：在本实验中利用化学物质茚三酮可与游离氨基反应生成蓝色物质(该蓝色物质的特征吸收峰为563nm、564nm、565nm)的特性对UCP表面修饰的氨基进行鉴定。为了实现对UCP表面修饰过程中的氨基化效率进行检测(即，对氨基进行定量测定)，首先便是绘制氨基浓度-吸光度标准工作曲线。利用一分子氨基与两分子茚三酮反应，生成一分子蓝色物质的检测反应化学计量关系，在标准曲线的绘制过程中，使用含有一个氨基的甘氨酸作为标准品代替UCP表面的游离氨基与茚三酮反应生成蓝色物质。

通过将浓度准确控制的产物系列稀释，并测量其在特征峰处的吸光度便可完成氨基浓度-吸光度标准浓度工作曲线的绘制。利用该曲线所求得的斜率便可对UCP表面氨基化效率进行精确计算。

A.标准浓度工作曲线绘制：准确称量30mg甘氨酸；甘氨酸中加入4mg/m1的茚三酮2ml，沸水浴30s使其充分反应；(甘氨酸过量，终浓度：蓝色物质1.12×10^-2mol/L，甘氨酸0.189mol/L)以“b”中含蓝色物质1.12×10^-2mol/L的溶液作为母液，将其用蒸馏水系列稀释至蓝色物质终浓度为：1.40×10^-4mol/L、1.25×10^-4mol/L、1.12×10^-4mol/L、1.02×10^-4mol/L、9.36×10^-5mol/L、8.64×10^-5mol/L、8.02×10^-5mol/L、7.48×10^-5mol/L、7.02×10^-5mol/L、6.24×10^-5mol/L、5.61×10^-5mol/L、5.10×10^-5mol/L、4.68×10^-5mol/L、4.32×10^-5mol/L、4.01×10^-5mol/L、3.74×10^-5mol/L、3.51×10^-5mol/L、3.12×10^-5mol/L、2.81×10^-5mol/L、2.55×10^-5mol/L、2.34×10^-5mol/L、2.16×10^-5mol/L、2.00×10^-5mol/L、1.87×10^-5mol/L、1.75×10^-5mol/L、1.56×10^-5mol/L、1.40×10^-5mol/L、1.28×10^-5mol/L、1.17×10^-5mol/L、1.08×10^-5mol/L、1.00×10^-5mol/L、9.36×10^-6mol/L、5.01×10^-6mol/L、4.68×10^-6mol/L；各溶液分别于563nm、564nm、565nm处测吸光度；以蓝色物质浓度(也即是参加反应氨基的浓度)作为横坐标，以各浓度对应的563nm、564nm、565nm处吸光度平均值作为纵坐标绘制标准浓度工作曲线(见图9)；根据曲线可得曲线斜率为K＝1.023×10^-4。

B.UCP表面氨基化效率测定：准确称量30mg氨基化UCP；UCP中加入4mg/ml茚三酮1ml，超声混匀，沸水浴5min使其充分反应(见图10)；将UCP反应后的蓝色悬浊液以12000r/min离心5min；离心后的上清液取出，利用紫外-可见分光光度计对其在563nm、564nm、565nm处的吸光度进行测量，并得出吸光度平均值A；利用公式：UCP表面修饰氨基化效率＝(1.023×10^-4A)×1×10^-3/30(mol/mg)。

C.UCP表面氨基化效率变异系数测定：将UCP表面硅化与氨基化实验平行重复10次；分别测定其吸光度-氨基化效率(mol/mg)为：1.5088-5.15×10^-9、1.2408-4.23×10^-9、1.6934-5.77×10^-9、1.3596-4.64×10^-9、1.4326-4.89×10^-9、1.2014-4.10×10^-9、1. 1303-3.85×10^-9、1.5436-5.26×10^-9、1.2594-4.29×10^-9、1.4023-4.78×10^-9；经过计算UCP表面氨基化效率变异系数为：12.64％。

实验例2.UCP表面醛基检测：

A.检测试剂-品红-醛基试剂(Fuchsin-Aldehyde Reagent，F-A Reagent)的配制：0.05g碱性品红溶于50ml水中；磁力搅拌下，加入2ml饱和NaHSO₃溶液，反应1h；磁力搅拌下，加入1ml浓HCl，磁力搅拌反应过夜。

B.UCP表面醛基检测：氨基化后经过清洗的少量UCP粉末加入1ml F-A试剂中；醛基化后经过清洗的少量UCP悬浊液加入1ml F-A试剂中；比较“a”与“b”的现象(见图11)。

结论：通过比较氨基化UCP(左)和醛基化UCP(右)与醛基检测试剂反应的现象，可以证实通过本发明可在UCP表面氨基化的基础上，实现UCP表面醛基化。

实验例3.UCP表面抗体检测：(以UCP标记羊抗炭疽芽孢抗体为例进行说明)

说明：羊抗炭疽芽孢抗体可与其所对应的二抗-碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG抗体发生特异的免疫结合反应，最终生成的免疫复合物UCP-羊抗炭疽芽孢抗体-兔抗羊IgG-碱性磷酸酶在加入碱性磷酸酶的显色底物后，以颜色的变化间接的揭示了UCP表面羊抗炭疽芽孢抗体的存在；而羊抗炭疽芽孢抗体与与其同源的羊抗兔IgG抗体之间则无任何反应，因而可以使用UCP-羊抗炭疽芽孢抗体与AP-羊抗兔IgG抗体反应作为上述特异性反应的空白对照。

A.抗体标记物特异性检测：取5ml 4℃保存的UCP-羊抗炭疽芽孢抗体悬浊液；悬浊液中加入5μl碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG抗体(AP-兔抗羊IgG)，4C搅拌反应1h；将UCP悬浊液反应体系倒入20ml离心管中，用4℃预冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/LPB缓冲液含0.05％Tween20)清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用4℃预冷的UCP清洗液作为清洗液，进行12000r/min，4℃，1次(离心20min)-5次(不重悬沉降物，离心10min)-1次(搅拌震荡后，离心20min)，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；UCP沉降中加入1m1 UCP清洗液，搅拌震荡充分混匀；7次清洗后的离心上清(1#-7#)，以及UCP悬浊液共8个样品，各取1ml；每个样品中各加入200μl pNPP(碱性磷酸酶的反应底物，与AP反应可生成在405nm有特征吸收峰的黄色物质)，室温反应30min；每个样品中分别加入200μl 1mol/L NaOH终止催化反应(见图12)；(注：1#清洗上清变为黄色表示：在反应结束时，UCP复合物周围有游离的AP-兔抗羊IgG；7#清洗上清为无色，而经过7次清洗的UCP悬浊液为极其明显黄色，表示：UCP表面实现了与羊抗炭疽芽孢抗体的连接，而通过羊抗炭疽芽孢抗体，AP-兔抗羊IgG结合于UCP表面，因而显色。)将UCP反应后的悬浊液以12000r/min离心5min；离心后的上清液取出，利用紫外-可见分光光度计对其在405nm处的吸光度进行测量得X。

B.抗体标记物空白对照检测：取5ml 4℃保存的UCP-羊抗炭疽芽孢抗体悬浊液；悬浊液中加入5μl碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG抗体(AP-羊抗兔IgG)，4℃搅拌反应1h；将UCP悬浊液反应体系倒入20ml离心管中，用4℃预冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/LPB缓冲液含0.05％Tween 20)清洗烧瓶，洗液合并入离心管中；用4℃预冷的UCP清洗液作为清洗液，进行12000r/min，4℃，1次(离心20min)-5次(不重悬沉降物，离心10min)-1次(搅拌震荡，离心20min)，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；UCP沉降中加入1ml UCP清洗液，搅拌震荡充分混匀；上述的7次清洗后的离心上清(1#-7#)，以及上述UCP悬浊液共8个样品，各取1ml；每个样品各加入200μl pNPP(碱性磷酸酶的反应底物，与AP反应可生成在405nm有特征吸收峰的黄色物质)，室温反应30min；每个样品分别加入200μl 1mol/L NaOH终止催化反应(见图13)；(注：1#清洗上清变为黄色表示：在反应结束时，UCP复合物周围有游离的AP-羊抗兔IgG；7#清洗上清为无色，而经过7次清洗的UCP悬浊液也为无色，表示：UCP表面除了免疫反应没有物理吸附作用可使AP-羊抗兔IgG结合于UCP表面，因而无色。由此也证明了抗体特异性检测中结论的可靠性。)将UCP反应后的悬浊液12000r/min离心5min；离心后的上清液取出，利用紫外-可见分光光度计对其在405nm处的吸光度进行测量得Y。

C.UCP表面抗体检测：说明：“A”与“B”中通过颜色变化已经说明了两个问题：①UCP表面已经实现了抗体的连接；②UCP标记抗体在将来的应用中，不会产生颗粒本身性质导致的物理吸附(即，与其它蛋白的非特异结合)。为了进一步说明这个问题，我们使用“A”与“B”中得到的吸光度具体数值X与Y代替颜色进行论证。

大批量制备一批氨基化UCP，按照本发明中所描述的EDC法完全平行重复进行10次羊抗炭疽芽孢抗体标记；每一批UCP-羊抗炭疽芽孢抗体分别按照“抗体标记物特异性检测”与“抗体标记物空白对照检测”中的方法步骤进行检测，共得到10组一一对应的X与Y值；(X代表：UCP-羊抗炭疽芽孢抗体与AP-兔抗羊IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即特异性检测中得到的吸光度；Y代表：UCP-羊抗炭疽芽孢抗体与AP-羊抗兔IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即空白对照检测中得到的吸光度，见表1)；上文所述同一批制备的氨基化UCP，按照本发明中所描述的戊二醛法完全平行重复进行10次羊抗炭疽芽孢抗体标记；每一批UCP-羊抗炭疽芽孢抗体分别按照“抗体标记物特异性检测”与“抗体标记物空白对照检测”中的方法步骤进行检测，共得到10组一对应的X与Y值；(X代表：UCP-羊抗炭疽芽孢抗体与AP-兔抗羊IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即特异性检测中得到的吸光度；Y代表：UCP-羊抗炭疽芽孢抗体与AP-羊抗兔IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即空白对照检测中得到的吸光度)，见表2；将EDC法与戊二醛法制备的UCP-抗体标记物特异性检测吸光度进行比较，见图14。

EDC法与戊二醛法标记抗体标记效率比较结论：通过上述的抗体标记物特异性检测实验以及空白对照检测实验，根据颜色现象以及具体数据证据充分证明：无论是EDC法还是戊二醛法均可在UCP表面连接抗体；戊二醛法的抗体标记效率高于EDC法；这种经过修饰与活化的UCP颗粒表面已经不存在任何可对蛋白产生非特异性物理吸附的位点。

表1 EDC法制备的UCP-抗体标记物特异性检测与空白对照检测吸光度

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

空白对照Y 0.0770 0.0414 0.0598 0.0265 0.0653 0.0324 0.0256 0.0543 0.0672 0.0387

特异检测X 2.5412 2.4989 2.4587 2.5793 2.3010 2.5173 2.4001 2.5379 2.3924 2.4781

表2戊二醛法制备的UCP-抗体标记物特异性检测与空白对照检测吸光度

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

空白对照Y 0.0287 0.0565 0.0735 0.0419 0.0574 0.0263 0.0791 0.0511 0.0437 0.0629

特异检测X 3.0792 2.9987 2.9812 3.0441 3.0171 2.9578 2.9910 2.9762 3.0524 2.9847

实验例4.UCP表面亲合素检测：

说明：亲合素可与生物素化羊抗兔IgG抗体中的生物素发生特异性的结合反应，而生物素化羊抗兔IgG中的羊抗兔IgG又可与其所对应的二抗——碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG抗体中的兔抗羊IgG发生特异的免疫结合反应；最终生成的免疫复合物UCP-亲合素-生物素-羊抗兔IgG-兔抗羊IgG-碱性磷酸酶在加入碱性磷酸酶的显色底物后，以颜色的变化间接的揭示UCP表面亲合素的存在。而在没有生物素-羊抗兔IgG的存在下UCP-亲合素与碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG之间则无任何反应，可以此来作为上述特异性反应的空白对照。

A.亲合素标记物特异性检测：取5ml 4℃保存的UCP-亲合素悬浊液；浊液中加入5μl生物素化羊抗兔IgG抗体，4℃搅拌反应1h；将UCP悬浊液反应体系倒入20ml离心管中，用4℃预冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/L PB缓冲液含0.05％Tween20)清洗烧瓶，洗液合并入离心管中；用4℃预冷的UCP清洗液作为清洗液，进行12000r/min，4℃，1次(离心20min)-2次(不重悬沉降物，离心10min)-1次(搅拌震荡后，离心20min)，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；UCP沉降中加入1ml UCP保存液，搅拌震荡充分混匀，取出放入烧瓶中；再用4ml UCP保存液分次清洗离心管，洗液也合并入烧瓶中；悬浊液中加入5μl碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG抗体(AP-兔抗羊IgG)，4℃搅拌反应1h；将UCP悬浊液反应体系倒入20ml离心管，用4℃预冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/L PB缓冲液含0.05％Tween20)清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用4℃预冷的UCP清洗液作为清洗液，进行12000r/min，4℃，1次(离心20min)-5次(不重悬沉降物，离心10min)-1次(搅拌震荡后，离心20min)，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；UCP沉降中加入1ml UCP清洗液，搅拌震荡充分混匀；上述7次清洗后的离心上清(1#-7#)，以及上述的UCP悬浊液共8个样品，各取1ml；每个样品中各加入200μl pNPP(碱性磷酸酶的反应底物，与AP反应可生成在405nm有特征吸收峰的黄色物质)，室温反应30min；每个样品中分别加入200μl 1mol/L NaOH终止催化反应，见图15(注：1#清洗上清变为黄色表示：反应结束时，UCP复合物周围有游离AP-兔抗羊IgG；7#清洗上清为无色，经过7次清洗的UCP悬浊液为极其明显黄色，表示：UCP表面实现了与亲合素的连接，而通过生物素化羊抗兔IgG，AP-兔抗羊IgG结合于UCP表面，因而显色。)；将UCP反应后的悬浊液以12000r/min离心5min；离心后的上清液取出，利用紫外-可见分光光度计对其在405nm处的吸光度进行测量得X。

B.亲合素标记物空白对照检测：取5ml 4℃保存的UCP-亲合素悬浊液；悬浊液中加入5μl碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG抗体(AP-兔抗羊IgG)，4℃搅拌反应1h；将UCP悬浊液反应体系倒入20ml离心管中，用4℃预冷的UCP清洗液(pH＝7.2，0.03mol/L PB缓冲液含0.05％Tween20)清洗烧瓶，洗液合并入离心管中；用4℃预冷的UCP清洗液作为清洗液，进行12000r/min，4℃，1次(离心20min)-5次(不重悬沉降物，离心10min)-1次(搅拌震荡后，离心20min)，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；在UCP沉降中加入1ml UCP清洗液，搅拌震荡充分混匀；上述7次清洗后的离心上清(1#-7#)，及上述的UCP悬浊液共8个样品，各取1ml；每个样品中各加入200μl pNPP(碱性磷酸酶的反应底物，与AP反应可生成在405nm有特征吸收峰的黄色物质)，室温反应30min：每个样品中分别加入200μl 1mol/L NaOH终止催化反应(见图16)(注：1#清洗上清变为黄色表示：在反应结束时，UCP复合物周围有游离的AP-兔抗羊IgG；7#清洗上清为无色，而经过7次清洗的UCP悬浊液也为无色，表示：UCP表面除了免疫反应没有物理吸附作用可使AP-兔抗羊IgG结合于UCP表面，因而无色。由此也证明了亲合素特异性检测中结论的可靠性)；将UCP反应后的悬浊液以12000r/min离心5min；离心后的上清液取出，利用紫外-可见分光光度计对其在405nm处的吸光度进行测量得Y；

C.UCP表面亲合素检测：说明：“A”与“B”中通过颜色变化已经说明了两个问题：①UCP表面已经实现了亲合素的连接；②UCP标记亲合素在将来的应用中，不会产生颗粒本身性质导致的物理吸附(即，与其它蛋白之间的非特异结合)。为了进一步说明这个问题，我们使用“A”与“B”中得到的吸光度具体数值X与Y代替颜色进行论证。

上文所述同一批制备的氨基化UCP，按照本发明所描述的EDC法完全平行重复进行10次亲合素标记；每一批UCP-亲合素分别按照“亲合素标记物特异性检测”与“亲合素标记物空白对照检测”中的方法步骤进行特异性检测与空白对照检测，共得到10组一对应的X与Y值，见表3；(X代表：UCP-亲合素依次与生物素化羊抗兔IgG、AP-兔抗羊IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即特异性检测中得到的吸光度；Y代表：UCP-亲合素与AP-兔抗羊IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即空白对照检测中得到的吸光度；)上文所述同一批制备的氨基化UCP，按照本发明所描述的戊二醛法完全平行重复进行10次亲合素标记；每一批UCP-亲合素分别按照“亲合素标记物特异性检测”与“亲合素标记物空白对照检测”中的方法步骤进行特异性检测与空白对照检测，共得到10组一对应的X与Y值，见表4；(X代表：UCP-亲合素依次与生物素化羊抗兔IgG、AP-兔抗羊IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即特异性检测中得到的吸光度；Y代表：UCP-亲合素与AP-兔抗羊IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即空白对照检测中得到的吸光度)；将EDC法与戊二醛法制备的UCP-亲合素标记物特异性检测吸光度进行比较，见图17，结论：通过上述的亲合素标记物特异性检测实验以及空白对照检测实验，根据颜色现象以及具体数据证据充分证明了：无论是EDC法还是戊二醛法均可在UCP表面连接亲合素；这种经过修饰与活化的UCP颗粒表面已经不存在任何可对蛋白产生非特异性物理吸附的位点。戊二醛法的亲合素标记效率高于EDC法。

表3：EDC法制备的UCP-亲合素标记物特异性检测与空白对照检测吸光度

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

空白对照Y 0.0642 0.0327 0.0584 0.0721 0.0451 0.0487 0.0661 0.0579 0.0216 0.0489

特异检测X 2.7469 2.7312 2.6949 2.6831 2.7079 2.7254 2.6657 2.6943 2.7398 2.7138

表4：戊二醛法制备的UCP-生物素标记物特异性检测与空白对照检测吸光度

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

空白对照Y 0.0575 0.0497 0.0399 0.0631 0.0759 0.0245 0.0672 0.0311 0.0658 0.0519

特异检测X 3.3483 3.3010 3.2742 3.2936 3.3387 3.2887 3.3148 3.3212 3.2729 3.3059

实验例5.共价法与物理吸附法标记抗体，标记效率与标记物稳定性比较：(仅以UCP-羊抗炭疽芽孢抗体为例进行说明)

说明：在现有的一些UCP标记技术中，其没有采用UCP表面系列修饰后通过共价法连接抗体的方法，而是与胶体金标记技术类似，即直接利用UCP纳米级颗粒的表面静电吸附特性，通过物理吸附法结合抗体。在此我们通过实验将这两种方法从标记效率以及标记物稳定性两方面来进行比较。

A.物理吸附法UCP标记羊抗炭疽芽孢抗体：称量100mg没有经过任何表面修饰的空白UCP加入圆底磨口烧瓶中；烧瓶中加入99.175ml 4℃预冷的pH＝9.5 0.05mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，用超声波处理30s充分混匀；99.175ml的UCP悬浊液反应体系中，加入825μl 2mg/ml羊抗炭疽芽孢抗体，4℃，搅拌反应4h；UCP悬浊液反应体系中，加入2.5ml 40mg/ml BSA(牛血清白蛋白，pH＝9.5 0.05 mol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液配制)，4℃，搅拌反应2h；将UCP悬浊液反应体系倒入6支20ml离心管中，用4℃预冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB缓冲液清洗烧瓶，洗液也合并入离心管中；用4℃预冷的pH＝7.2，0.03mol/L PB缓冲液作为清洗液，进行12000r/min，4℃，1次(离心20min)-2次(不重悬沉降物，离心10min)-1次(搅拌震荡后，离心20min)，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向6支盛有UCP沉降物的离心管中，分别加入10ml 4℃预冷的UCP封闭液(pH＝7.2，0.03mol/L PB缓冲液中，含1.0％BSA和0.5％Tween20)，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入烧瓶中；共用40ml 4℃预冷的UCP封闭液分为多次对6支离心管进行清洗，洗液也合并入烧瓶中；100ml UCP悬浊液反应体系，4℃，搅拌反应2h；将UCP悬浊液反应体系倒入6支20ml离心管中，用4℃预冷的UCP保存液(pH＝7.2，0.03mol/L PB缓冲液中，含0.1％BSA、0.05％Tween20、0.02％NaN₃)清洗烧瓶，洗液合并入离心管中；用4℃预冷的UCP保存液作为清洗液，进行12000r/min，1次(离心20min)-1次(不重悬沉降物，离心10min)-1次(搅拌震荡后，离心20min)，离心清洗，每次将上清液尽量吸尽；向6支盛有UCP沉降物的离心管中，分别加入10ml 4℃预冷的UCP保存液，用玻璃棒充分搅拌混匀，将悬浊液倒入磨口试剂瓶中；共用40ml 4℃预冷的UCP保存液分为多次对6支离心管进行清洗，洗液也合并入磨口试剂瓶中；将UCP-抗体标记物保存于4℃备用。

B.共价法与物理吸附法标记效率比较：上文所述同一批制备的氨基化UCP，按照本发明所描述的物理吸附法完全平行重复进行10次羊抗炭疽芽孢抗体标记；每一批UCP-抗体分别按照“抗体标记物特异性检测”与“抗体标记物空白对照检测”的方法步骤进行实验，共得到10组一对应的X与Y值，见表5，(X代表：UCP-羊抗炭疽芽孢抗体与AP-兔抗羊IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即特异性检测中得到的吸光度；Y代表：UCP-羊抗炭疽芽孢抗体与AP-羊抗兔IgG反应后，再用底物pNPP显色后的吸光度，即空白对照检测中得到的吸光度)；按照EDC共价法、戊二醛共价法和物理吸附法分别进行10次重复实验制备UCP-羊抗炭疽芽孢抗体标记物，其各自特异性检测后的吸光度结果总结见表6，图18，结论：物理吸附法也可以在UCP表面固定抗体；共价法的抗体标记效率远好于物理吸附法，而共价法中戊二醛法略好于EDC法。

表5：物理吸附法制备的UCP-抗体标记物特异性检测与空白对照检测吸光度

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

空白对照Y 0.0352 0.0257 0.0562 0.0719 0.0442 0.0269 0.0603 0.0552 0.0679 0.0748

特异检测X 1.2402 1.3549 1.2918 1.3162 1.2547 1.2794 1.3071 1.2955 1.2625 1.2957

表6：三种方法分别制备的10批UCP-抗体标记物特异性检测吸光度

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

EDC共价法 2.5412 2.4989 2.4587 2.5793 2.3010 2.5173 2.4001 2.5379 2.3924 2.4781

戊二醛共价法 3.0792 2.9987 2.9812 3.0441 3.0171 2.9578 2.9910 2.9762 3.0524 2.9847

物理吸附法 1.2402 1.3549 1.2918 1.3162 1.2547 1.2794 1.3071 1.2955 1.2625 1.2957

C.共价法与物理吸附法所得到的UCP抗体标记物稳定性比较：上文所述同一批制备的氨基化UCP，分别用戊二醛共价法、EDC共价法和物理吸附法标记羊抗炭疽芽孢抗体；使用AP-兔抗羊IgG分别在制备后0h、30h、60h、120h、240h、480h、960h，对戊二醛共价法UCP-羊抗炭疽芽孢抗体、EDC共价法UCP-羊抗炭疽芽孢抗体和物理吸附法UCP-羊抗炭疽芽孢抗体进行抗体标记物特异性检测。结果见表7和图19，结论：共价法制备的UCP-抗体标记物稳定性好于物理吸附法，而共价法中戊二醛法略好于EDC法。

表7：三种方法制备的UCP-抗体在不同保存时间下特异性检测吸光度

时间(h) 0.0 30.0 60.0 120.0 240.0 480.0 960.0

戊二醛共价法 3.0792 2.8069 2.7738 2.7903 2.7569 2.7421 2.7494

EDC共价法 2.5412 2.1527 2.2401 2.1735 2.1358 2.2024 2.1647

物理吸附法 1.2402 0.4199 0.4240 0.4341 0.4279 0.4037 0.4213

实验例6.共价法与物理吸附法标记亲合素，标记效率与标记物稳定性比较：

A.物理吸附法UCP标记亲合素：称量100mg没有经过任何表面修饰的空白UCP加入圆底磨口烧瓶中；烧瓶中加入100ml 4℃预冷的pH＝9.5，0.05mol/L Na_{2
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