一种催化活性和对映归一性提高的PvEH3突变体

IPC分类号 : C12N1/21,C12N15/55,C12N15/70,C12N9/14,C12P41/00,C12P7/22,C12R1/19

申请号

CN201810033879.8

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专利摘要

本发明公开了一种催化活性和对映归一性提高的PvEH3突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明在具有一定对映归一性催化特性的环氧化物水解酶基础上，通过组合定点突变生物技术改造环氧化物水解酶分子结构，得到一株催化活性和对映归一性均提高的环氧化物水解酶突变体PvEH3G170E/F187L。突变体具有高对映归一择性、高催化活性的优点，有较大应用潜力，也为EH的研究奠定了理论基础。

权利要求

1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.表达权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的细胞。

5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，包括真菌细胞和细菌细胞。

6.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.1所示的环氧化物水解酶突变体。

7.一种提高环氧化物水解酶催化活性和对映归一性的方法，其特征在于，所述方法是对phaseolus vulgaris来源的环氧化物水解酶进行氨基酸突变；所述氨基酸突变是将第170位的甘氨酸突变成谷氨酸，并将第187位的苯丙氨酸突变成亮氨酸。

8.一种生物法制备(R)-对氯苯乙二醇的方法，其特征在于，以权利要求1所述的环氧化物水解酶突变体为催化剂，催化外消旋对氯环氧苯乙烷。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将表达权利要求1所述的环氧化物水解酶突变体的细胞加入至含有外消旋对氯环氧苯乙烷的溶液中。

10.权利要求1所述的环氧化物水解酶突变体在在药物合成及化工领域的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种催化活性和对映归一性提高的PvEH3突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。

背景技术

R-对氯苯乙二醇是一类高附加值的药物中间体，可用于神经类药物Eliprodil的合成。菜豆环氧化物水解酶PvEH3能催化外消旋对氯苯乙烷环氧化物对映归一性水解，将底物完全转化为相应的单一构型的R-对氯苯乙二醇，具有绿色、经济等优点。外消旋环氧化物的对映归一性水解可以通过一种具有互补的对映选择性和区域选择性的环氧化物水解酶实现。

目前已报道的具有单一对映归一性催化特性的环氧化物水解酶有三种，分别来源于土豆、绿豆和新月柄杆菌。随着基因工程技术和高通量筛选技术的发展，对已知的环氧化物水解酶进行定向改造是丰富此类酶的重要途径。近年来，分子生物学技术，如定点突变、饱和突变、错易PCR和DNA shuffling等也用于改造EH的催化活性、稳定性、对映选择性等性质，并通过高通量筛选获得性质提高的突变酶。如来源于菜豆的环氧化物水解酶PvEH1对映归一性水解获得(R)-苯基乙二醇的e.e._p仅为33.6％，叶慧华等对其进行组合点突变后获得一种最优突变酶PvEH1^{L105I/M160A/M175I}，其催化获得产物的e.e._p值提高到了87.8％。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种催化活性和对映归一性提高的环氧化物水解酶(PvEH3)突变体，该突变体含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述氨基酸序列的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述环氧化物水解酶突变体PvEH3的细胞系。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞和细菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。

本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主，表达SEQ IDNO.1所示的环氧化物水解酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

本发明的第六个目的是一种提高phaseolus vulgaris来源的环氧化物水解酶催化活性和对映归一性的方法，所述方法是对phaseolus vulgaris来源的环氧化物水解酶PvEH3进行氨基酸突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述突变是将PvEH3第170位的甘氨酸突变成谷氨酸，并将第187位的苯丙氨酸突变成亮氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述phaseolus vulgaris来源的环氧化物水解酶的GenBank登录号为MF420352。

本发明的第七个目的是提供所述环氧化物水解酶突变体在在药物合成及化工领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备(R)-对氯苯乙二醇。

在本发明的一种实施方式中，所述应用具体是：将所述基因工程菌接种至LB培养基中，于35～37℃培养10～36h，收集菌体，以菌体为生物催化剂加入至含有外消旋对氯环氧苯乙烷的溶液中。

本发明的有益效果：本发明通过菜豆来源的环氧水解酶3(PvEH3)的Gly170和Phe187位进行组合点突变，获得活性与对映归一性提高的突变酶PvEH3^G170E//F187L。PvEH3^G170E//F187L对外消旋对氯环氧苯乙烷(rac-pCSO)的活性，在25℃下为19.64U/g，相比于野生型酶(3.45U/g)提高了4.6倍；水解产物(R)-对氯苯乙二醇(R-pCPED)的e.e._p值为91.5％。相比于野生型酶的催化效果e.e.p值(85.1％)提高了约百分之六。同时，该突变体的稳定性没有发送变化，有利于酶在工业生产上的应用。

附图说明

图1为环氧化物水解酶催化示意图。

具体实施方式

rac-pCSO购自上海Energy公司；其他试剂均为分析纯。手性正相HPLC色谱柱 AS-H(5μm,4.6mmΦ×250mm)购买自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司；高效液相色谱仪(Waters e2695)为美国Waters科技公司产品。

突变体命名方式：

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如G170L，表示位置170的氨基酸由亲本PvEH3的Gly替换成Glu，位置的编号对应于亲本PvEH3的氨基酸序列。

酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟分解1μmol rac-SO所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶的活性单位(IU)。

实施例1突变酶基因及其表达质粒的构建

将扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因pveh3，扩增产物与pUCm-T连接，转化E.coli JM109，经蓝白斑筛选、SacⅠ酶切鉴定和DNA测序。将测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-pveh3。用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pUCm-T-pveh3，回收pveh3，与经同样双酶切的pET-28a(+)连接，获重组质粒pET-28a(+)-pveh3。

以已知的土豆EH的晶体结构(PDB：2CJP)为模板，同源建模获得PvEH3的三维结构。用AutoDock4.2软件将模型底物分子rac-pCSO与PvEH3进行分子对接，统计出催化rac-pCSO分子内的氨基酸，同源性分析排除保守位点氨基酸；统计多种植物类EHs以及具有对映归一性特性的EHs的同位点氨基酸的种类和概率，综合以上因素选择将第170位的甘氨酸突变成了谷氨酸，同时将第187位的苯丙氨酸突变成了亮氨酸。基于上面设计的突变位点，设计并合成特异性定点突变引物如下：

L170-F：5-GCTGAAGTTGGGACTGAATATGTGCTCAAA-3'，含突变位点；

L187-F：5-CCTCCAATCTTACCAAAGGGAGAGTACG-3'，含突变位点；

pET-28a-2254-R：5-GCCTTACTGGTTAGCAGAATG-3'，含突变位点；

以L170-F、pET-28a-2254-R为上下游引物，以pET28a(+)-pveh3为模板，利用QuickChange^TM试剂盒进行PCR，转化Escherichia coli BL21(DE3)，利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pET28a(+)-pveh3^G170E；(2)L187-F、pET-28a-2254-R为上下游引物，以pET28a(+)-pveh3^G170E为模板，利用QuickChange^TM试剂盒进行PCR，转化E.coli BL21(DE3)，利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pET28a(+)-pveh3^G170E/F187L；(3)将上一步得到的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，获得重组工程菌株E.coli BL21-pveh3^G170E/F187L。

将E.coli BL21-pveh3^G170E/F187L单菌落接种于2mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、220r/min培养过夜；取1mL培养液转接于50mL相同的培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，添加IPTG(终浓度0.5mmol/L)，20℃诱导10h。收集菌体，每g湿菌体用10mL磷酸钠缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,100mmol/L,pH 7.5)悬浮得到菌悬液。

实施例2突变酶PvEH3^G170E/F187L对映体纯度的测定

在2mL EP管中加入200μL菌悬液，25℃保温5min，再加入10μL 200mM rac-pCSO,25℃反应过夜。反应结束后，取反应液200μL加入1mL乙酸乙酯终止反应。微孔过滤后，样品分析采用正相HPLC(Waters e2695)、AS-H柱和紫外检测仪。流动相为正己烷/异丙醇(80:20，v/v)，流速为0.8mL/min，检测波长为220nm。(R)-pCSO((R)-对氯环氧乙烷)、(S)-pCSO((S)-对氯环氧乙烷)、(S)-pCPED((S)-对氯苯乙二醇)和(R)-pCPED((R)-对氯苯乙二醇)的保留时间分别为6.169、6.905、7.485和8.656min。产物纯度e.e._p＝[(R_d-S_d)/(R_d+S_d)]×100％。其中：R_d和S_d表示(R)-和(S)-pCPED浓度。经过5h反应，突变酶PvEH3^G170E/F187L水解产物(R)-对氯苯乙二醇的e.e._p值为91.5％。相比于野生型酶的催化效果e.e._p值提高了约百分之六。

实施例3区域选择性系数和活性的测定

在1.5mL EP管中加入450μL菌悬液和500μL磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，25℃保温5min，再加入50μL rac-pCSO(终浓度20mmol/L)进行反应。定时10min,30min,1h,2h,4h,6h和8h取样50μL至1mL乙酸乙酯中萃取，样品分析采用与实施例2相同的方法。利用公式求得e.e._p＝(β_R-α_S)×e.e._s×(1-c)c^-1+(α_S+β_R–1)区域选择性系数α_S和β_R。其中，c表示rac-pCSO转化率。突变酶PvEH3^G170E//F187L的区域选择性系数α_S和β_R分别为93.4％和98.2％，其区域选择性系数α_S比野生型酶(87.0％)提高了约百分之六。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟分解1μmol rac-SO所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶的活性单位(IU)。突变酶PvEH3^G170E//F187L催化活性为19.64U/g，相比于野生型酶(3.45U/g)提高了4.6倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化活性和对映归一性提高的PvEH3突变体

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 317

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Gly Ile Gln His Lys Glu Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met His

1 5 10 15

Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His Gly Phe

20 25 30

Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ala Leu Ser Ser

35 40 45

Arg Gly Tyr Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp Thr

50 55 60

Glu Ala Pro Ala Ser Met Ser Ser Tyr Ser Cys Phe Asp Ile Val Gly

65 70 75 80

Asp Leu Val Ala Leu Ile Asp Leu Leu Gly Val Asp Gln Val Phe Leu

85 90 95

Val Ala His Asp Trp Gly Ala Ile Ile Gly Trp Tyr Leu Cys Met Phe

100 105 110

Arg Pro Asp Arg Val Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Leu Leu

115 120 125

His Arg Asn Pro Glu Ile Arg Thr Val Asp Ala Met Arg Ala Met Tyr

130 135 140

Gly Asp Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Lys Pro Gly Glu Met Glu

145 150 155 160

Ala Gln Met Ala Glu Val Gly Thr Glu Tyr Val Leu Lys Asn Ile Leu

165 170 175

Thr Thr Arg Lys Pro Gly Pro Pro Ile Leu Pro Lys Gly Glu Tyr Gly

180 185 190

Thr Gly Phe Asn Pro Asp Met Thr Asn Ser Leu Pro Ser Trp Leu Ser

195 200 205

Gln His Asp Leu Ala Tyr Tyr Val Ser Lys Phe Gln Lys Thr Gly Phe

210 215 220

Thr Gly Pro Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Met Asn Pro Asn Trp Glu Leu

225 230 235 240

Thr Ala Pro Trp Ser Gly Ala Lys Ile Lys Val Pro Val Lys Phe Ile

245 250 255

Thr Gly Asp Leu Asp Met Val Tyr Thr Ser Leu Asn Met Lys Glu Tyr

260 265 270

Ile His Gly Gly Gly Phe Lys Glu Asp Val Pro Asn Leu Glu Glu Val

275 280 285

Ile Val Gln Lys Gly Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu Ala Ala Glu

290 295 300

Glu Ile Asn Thr His Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe

305 310 315

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggagggaa tacagcacaa agaagtggaa gtaaatggca tcaaaatgca tgttgcagag 60

aaaggagagg gtcctgtggt cttgttcctc catggcttcc ctgaactgtg gtattcctgg 120

cgccaccaga ttctggctct cagttcccga ggatatcgcg ctgttgcacc agatctacgt 180

ggctacggtg acacagaggc accagcttca atgagcagct acagctgctt tgacatagtg 240

ggtgatctgg ttgcgcttat agaccttctg ggtgttgatc aagtcttcct tgtggctcat 300

gactggggtg ccatcatagg ttggtacctc tgcatgtttc gccccgacag agtcaaggcc 360

tatgtctgcc tcagtgtgcc tttactccac cgaaaccccg agatcagaac cgtcgatgcc 420

atgcgtgcta tgtacggaga cgactactac atctgcagat ttcagaaacc aggagaaatg 480

gaagctcaga tggctgaagt tgggactgaa tatgtgctca aaaacatcct cacaactcgc 540

aaacctggtc ctccaatcgt ccccaaggga gagtacggaa ctggattcaa cccagatatg 600

actaattcct taccctcttg gctctcacaa catgatcttg cttattatgt ttccaaattt 660

cagaaaacgg gcttcactgg acccttgaac tattacagaa atatgaaccc aaattgggag 720

ctgacagcac cgtggagtgg agcgaaaata aaagtgccgg taaagttcat cacaggtgat 780

ttggacatgg tatacacctc actgaacatg aaggagtaca tccatggtgg aggtttcaaa 840

gaagatgtgc caaatctaga agaagtgatt gtgcagaaag gagtagctca cttcaataat 900

caagaagcag ctgaggaaat caatactcac atttatgatt ttatcaacaa gttttga 957

<210> 3

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3