专利摘要

本发明涉及一种制备灵芝子实体发酵物的方法、发酵物及其应用。本发明所述方法包括以下步骤：将灵芝子实体与水混合，打制成灵芝浆液；在所述灵芝浆液中接种酵母，于20～30℃下避光发酵48～72h，即得灵芝发酵液；在所述灵芝发酵液中接种乳酸菌，于40～43℃下发酵48～72h，发酵结束，即得灵芝子实体发酵物。本发明所述方法能够制备出营养价值高、抗氧化性强和美白效果好的灵芝子实体发酵物。

权利要求

1.一种制备灵芝子实体发酵物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将灵芝子实体与水混合，打制成灵芝浆液；

(2)向所述灵芝浆液中添加葡萄糖，所述葡萄糖的添加量为5g/100ml灵芝浆液；

(3)在所述灵芝浆液中接种酵母，于20～30℃下避光发酵48～72h，即得灵芝发酵液；

(4)向所述灵芝发酵液中添加葡萄糖，所述葡萄糖的添加量为3g/100ml灵芝发酵液；

(5)在所述灵芝发酵液中接种乳酸菌，于40～43℃下发酵48～72h，发酵结束，即得灵芝子实体发酵物；

所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus) ，所述酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ；

所述步骤(1)中，所述灵芝子实体与水的质量体积比为1g:15～25ml；

所述步骤(3)按体积比5～8％接种酵母；

所述步骤(3)中的发酵时间为48h或72h；

所述步骤(5)中的发酵时间为48h或72h；

所述步骤(5)中按体积比5～8％接种乳酸菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灵芝选自美国灵芝、中华灵芝或鹿角灵芝中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述灵芝为鹿角灵芝。

4.根据权利要求1～3任一项方法制备而成的灵芝子实体发酵物。

5.权利要求4所述发酵物在制备营养保健品中的应用。

6.权利要求4所述发酵物在制备化妆品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化妆品为护肤品。

说明书

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体而言，涉及一种制备灵芝子实体发酵物的方法、发酵物及其应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma)隶属于担子菌纲，多孔菌科，灵芝属的大型真菌。性甘，平；归心、肺、肝、肾经，其可食用部分主要是灵芝子实体。

现代科学研究表明，灵芝子实体中含有多糖类、三萜类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、微量元素、脂肪酸等，其中，灵芝多糖和灵芝三萜是灵芝主要的生物活性成分。灵芝主要具有补气安神、止咳平喘，用于眩晕不眠、心悸气短、虚劳咳喘。

目前灵芝子实体主要用于保健食品或药品，也有少量研究将灵芝用于制备化妆品。但现有的灵芝子实体加工产品存在营养物质溶出率不高、抗氧化性和美白效果不显著等缺陷。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种制备灵芝子实体发酵物的方法，本发明所述方法能够制备出营养价值高、抗氧化性强和美白效果好的发酵物。

本发明的第二目的在于提供根据前述方法制备而成的灵芝子实体发酵物，其具有营养价值高、抗氧化性强和美白效果好的优点。

本发明的第三目的在于提供前述发酵物在制备营养保健品中的应用。

本发明的第四目的在于提供前述发酵物在制备化妆品中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种制备灵芝子实体发酵物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将灵芝子实体与水混合，打制成灵芝浆液；(2)在所述灵芝浆液中接种酵母，于20～30℃下避光发酵48～72h，即得灵芝发酵液；(3)在所述灵芝发酵液中接种乳酸菌，于40～43℃下发酵48～72h，发酵结束，即得灵芝子实体发酵物。

本发明所述方法通过发酵的方式有效地破坏灵芝子实体致密的结构，有利于子实体中的活性成分如灵芝多糖和灵芝三萜的释放；并且，本发明所述方法发酵方式为酵母发酵和乳酸菌发酵联合使用的方式，与单发酵方式相比，能够显著提高灵芝多糖和灵芝三萜的含量，同时促进发酵液清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力以及对酪氨酸酶活性的抑制，从而提升其抗氧化和美白功效。

在一些具体的实施方式中，步骤(1)中，所述灵芝子实体与水的质量体积比为1g:15～25ml，优选地，所述质量体积比为1g:20ml。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(2)按体积比5～8％接种酵母；优选地，所述体积比为6.5％。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(3)按体积比5～8％接种乳酸菌；优选地，所述体积比为6.5％。

在一些具体的实施方式中，所述方法还包括在步骤(1)中的灵芝浆液或灵芝发酵液中添加蔗糖，所述蔗糖的添加量为1～7g/100mL；优选地，所述蔗糖的添加量为5g/100mL。

在一些具体的实施方式中，所述方法还包括在步骤(2)中的灵芝浆液或灵芝发酵液中添加蔗糖，所述蔗糖的添加量为1～7g/100mL；优选地，所述蔗糖的添加量为3g/100mL。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(2)中的发酵时间为48h或72h。

在一些具体的实施方式中，所述步骤(3)中的发酵时间为48h或72h。

在一些具体的实施方式中，所述灵芝选自美国灵芝、中华灵芝或鹿角灵芝中的一种或多种，优选地，所述灵芝为鹿角灵芝。

在一些具体的实施方式中，所述酵母为酿酒酵母。

在一些具体的实施方式中，所述乳酸菌选自保加利亚乳杆菌和/或植物乳杆菌；优选地，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌。

本发明所述方法进一步对发酵时间和灵芝种类做出优化，优化后的方法可以进一步提升发酵物的营养价值、抗氧化性和美白效果。

本发明还涉及根据前述方法制备而成的灵芝子实体发酵物。本发明所述灵芝子实体发酵物具有营养价值高、抗氧化性强和美白效果好的优点。

本发明还涉及前述发酵物在制备营养保健品中的应用。

本发明还涉及前述发酵物在制备化妆品中的应用，优选地，所述化妆品为护肤品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述方法通过酵母和乳酸菌联合发酵的方式促进灵芝子实体中活性成分的释放，能够显著提高灵芝多糖和灵芝三萜的含量，同时促进发酵液清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力以及对酪氨酸酶活性的抑制，从而提升其抗氧化和美白功效。

(2)本发明所述发酵物具有营养价值高、抗氧化和美白效果好的优点。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1

一种制备灵芝子实体发酵产品的方法，所述方法包括以下步骤：

1、取灵芝子实体，与无菌水混合均匀后打浆，即得灵芝浆液，其中，所述灵芝为美国灵芝，所述灵芝子实体与无菌水之间的质量体积比为1g:20ml；

2、向灵芝浆液中添加葡萄糖，所述葡萄糖的添加量为5g/100ml灵芝浆液；

3、接种酿酒酵母至所述灵芝浆液中，并于25℃下避光发酵48h，发酵结束后即得灵芝发酵液，其中，所述酿酒酵母的接种量为6.5ml酵母/100ml灵芝浆液；

4、向灵芝发酵液中添加葡萄糖，所述葡萄糖的添加量为3g/100ml灵芝发酵液；

5、接种保加利亚乳杆菌至所述灵芝发酵液中，并于40℃下发酵48h，发酵结束后即得灵芝子实体发酵产品，其中所述保加利亚乳杆菌的接种量为6.5ml保加利亚乳杆菌/100ml灵芝发酵液。

实施例2

参照实施例1所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述保加利亚乳杆菌的发酵时间为72h。

实施例3

参照实施例1所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述酿酒酵母的发酵时间为72h。

实施例4

参照实施例1所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述保加利亚乳杆菌的发酵时间为72h，所述酿酒酵母的发酵时间为72h。

实施例5

参照实施例1所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述灵芝为中华灵芝。

实施例6

参照实施例5所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述保加利亚乳杆菌的发酵时间为72h。

实施例7

参照实施例5所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述酿酒酵母的发酵时间为72h。

实施例8

参照实施例5所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述保加利亚乳杆菌的发酵时间为72h，所述酿酒酵母的发酵时间为72h。

实施例9

参照实施例1所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述灵芝为鹿角灵芝。

实施例10

参照实施例9所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述保加利亚乳杆菌的发酵时间为72h。

实施例11

参照实施例9所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述酿酒酵母的发酵时间为72h。

实施例12

参照实施例9所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，所述保加利亚乳杆菌的发酵时间为72h，所述酿酒酵母的发酵时间为72h。

对比例1～4

参照实施例1所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，对比例1所述方法只接种酿酒酵母进行发酵，发酵时间为48h；对比例2所述方法只接种酿酒酵母进行发酵，发酵时间为72h；对比例3所述方法只接种保加利亚乳杆菌进行发酵，发酵时间为48h；对比例4所述方法只接种保加利亚乳杆菌进行发酵，发酵时间为72h。

对比例5～8

参照实施例5所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，对比例5所述方法只接种酿酒酵母进行发酵，发酵时间为48h；对比例6所述方法只接种酿酒酵母进行发酵，发酵时间为72h；对比例7所述方法只接种保加利亚乳杆菌进行发酵，发酵时间为48h；对比例8所述方法只接种保加利亚乳杆菌进行发酵，发酵时间为72h。

对比例9～12

参照实施例9所述方法制备灵芝子实体发酵产品，区别仅在于，对比例9所述方法只接种酿酒酵母进行发酵，发酵时间为48h；对比例10所述方法只接种酿酒酵母进行发酵，发酵时间为72h；对比例11所述方法只接种保加利亚乳杆菌进行发酵，发酵时间为48h；对比例12所述方法只接种保加利亚乳杆菌进行发酵，发酵时间为72h。

实验例1

检测实施例1～12与对比例1～12所述方法制成的灵芝子实体发酵产品中灵芝多糖和灵芝三萜的含量：

1、灵芝多糖的检测方法：(1)绘制葡萄糖标准曲线：分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml的标准葡萄糖溶液置于试管中，用超纯水补至1.0ml，得到0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08mg/ml浓度的葡萄糖溶液，向试管中加入1.0ml 5％苯酚溶液，然后快速加入5.0ml浓硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，振荡后静置反应30min，490nm测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制定标准曲线图。(2)测定发酵产品中灵芝多糖的含量：取样液1ml于50ml离心管中，加入3倍体积的95％乙醇醇析24h左右；5000r/min，离心20min，弃上清；将沉淀于超低温冷冻干燥机中干燥2-3h；再加20ml超纯水将沉淀物溶解稀释到合适的浓度，充分溶解后，吸取1ml该待测液，按照上述苯酚-硫酸法测得吸光值，再通过葡萄糖标曲计算待测液得多糖含量。

2、灵芝三萜的检测方法：(1)标准曲线的绘制：精确移取100μg/mL齐墩果酸溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL置于试管中，将所有试管进行水浴加热直至溶剂挥干，加入0.4mL 5％香草醛—冰醋酸溶液以及1mL的高氯酸，迅速混合均匀后进行65℃15min的水浴加热；待溶液自然冷却后用冰醋酸定容至5mL，于550nm处，测吸光度值；分别将吸光度和标准品的浓度定为标准曲线的纵坐标和横坐标，依据两者的关系，建立回归方程。(2)测定灵芝三萜的含量：取样液0.1ml于试管中，加入0.9ml无水乙醇室温下放置1h左右；沸水浴加入使液体挥发，干燥；加入0.4mL 5％香草醛—冰醋酸溶液以及1mL的高氯酸迅速混合均匀，进行65℃15min的水浴加热；(此步骤设空白组，只加入上述1.4ml反应液，其余操作相同)；冷却后用冰醋酸定容至5mL后，对照空白组，在550nm下测三次吸光度取平均值，结合回归方程(齐墩果酸标准曲线y＝0.0555x-0.0154R2＝0.999)，计算待测物的三萜含量。

具体检测结果参见表1。根据表1所示实验数据可知，与单独使用酵母菌或者乳酸菌发酵而言，酵母菌发酵和乳酸菌发酵的联合使用可以显著提升发酵液中灵芝多糖和灵芝三萜的含量；同时，与美国灵芝和中华红芝相比，鹿角灵芝的发酵产品中多糖与三萜的含量更丰富；另外，与其他时间段的发酵结果相比，酵母菌和乳酸菌均发酵72h后获得的发酵产品中多糖与三萜的含量也更高。

表1不同发酵产品中灵芝多糖和灵芝三萜的检测结果

实验例2

检测实施例1～12与对比例1～12所述方法制成的灵芝子实体发酵产品的DPPH自由基的清除率以及超氧阴离子自由基的清除率：

1、清除DPPH自由基能力测定：取1ml待测液加1ml浓度为0.2mmol/L的DPPH，室温下静置30min后，在517nm波长处测吸光度变化，根据吸光度代入如下公式中，计算DPPH清除率。

DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％；

式中：Ai为1ml的DPPH+1ml样品的吸光度；Aj为1ml溶剂+1ml样品的吸光度；A0为1mlDPPH+1ml溶剂的吸光度。

2、清除超氧阴离子自由基实验：取5.7ml的50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液于10ml EP管中，向其中加入0.2ml样液，混匀后于25℃保温10min，然后加入于25℃预热的10mmol/L的邻苯三酚溶液0.1ml，总体积为6ml，迅速摇匀后用紫外-可见分光光度计记录其在320nm波长处1min内吸光度的增加值(As)。计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。另取试剂同上，将样液用等体积水替代，同样测定其在320nm波长下，1min内吸光度的增加值(A0)。

根据下述公式计算超氧阴离子自由基清除率：超氧阴离子自由基清除率(％)＝(A0-As)/A0×100％。

具体检测结果参见表2。根据表2所述检测结果可知，与单独使用酵母菌或者乳酸菌发酵而言，酵母菌发酵和乳酸菌发酵的联合使用可以显著提升发酵液的抗氧化能力；同时，与美国灵芝和中华红芝相比，鹿角灵芝的发酵产品抗氧化能力更强；另外，与其他时间段的发酵结果相比，酵母菌和乳酸菌均发酵48h后获得的发酵产品的抗氧化能力最强。

表2不同发酵产品的抗氧化功效检测结果

实验例3

检测实施例1～12与对比例1～12所述方法制成的灵芝子实体发酵产品的美白功效：

检测酪氨酸酶活性抑制率：用微量移液器分别按表3的体积准确吸取T1、T2、T3、T4中的酪氨酸酶、PBS及样品的反应液分别置于4个PE管中，混匀，37℃恒温水浴10min，然后在T2、T4中分别加入1ml的L-酪氨酸，37℃反应10min，快速置于冰水中冷却。用酶标仪在475nm处测定其吸光度AT1、AT2、AT3、AT4。

按以下公式计算样品抑制酪氨酸酶的活性：

酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(AT4-AT3)/(AT2-AT1)]×100％

其中，AT1：未加样品且未加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；AT2：未加样品加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；AT3：加样品而未加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度；AT4：加样品和加酪氨酸酶的反应液在475nm处测得的吸光度。

根据表4所述检测结果可知，与单独使用酵母菌或者乳酸菌发酵而言，酵母菌发酵和乳酸菌发酵的联合使用可以显著提升发酵液的抑制酪氨酸酶活性的能力，从而提高发酵产品的美白效果；同时，与美国灵芝和中华红芝相比，鹿角灵芝的发酵产品抑制酪氨酸激酶活性的能力更强；另外，与其他时间段的发酵结果相比，酵母菌和乳酸菌分别发酵72h和48h后获得的发酵产品的美白功效最强。

表3酪氨酸酶活性抑制率检测试验中反应液的组成

表4不同发酵产品的美白功效检测结果

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

一种制备灵芝子实体发酵物的方法、发酵物及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。