专利摘要

本发明公开了一种蕲蛇提取物及应用，所述蕲蛇提取物按如下方法制备：向含糖皮质激素受体基因的重组工程菌经发酵培养获得的发酵液中加入IPTG进行诱导培养，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀经超声破碎后提取蛋白，获得糖皮质激素受体蛋白；所述糖皮质激素受体基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示；将糖皮质激素受体蛋白偶联到Ni-NTAAgarose柱作为固定相，再将蕲蛇水煎剂作为流动相流经Ni-NTAAgarose柱，然后PBS洗涤柱子两次，加入IgGElutionBuffer洗脱液进行洗脱，收集流出液，获得蕲蛇提取物；本发明制备的蕲蛇提取物，可以增强糖皮质激素受体与NF-κB相互作用，具有潜在的抗炎效应，为糖皮质激素的替代品提供了依据。

权利要求

1.一种蕲蛇提取物，其特征在于所述蕲蛇提取物按如下方法制备：（1）糖皮质激素受体蛋白制备：向含糖皮质激素受体基因的重组工程菌经发酵培养获得的发酵液中加入IPTG进行诱导培养，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀经超声破碎后提取蛋白，获得糖皮质激素受体蛋白；所述糖皮质激素受体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；（2）蕲蛇提取物：将步骤（1）制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到Ni-NTA Agarose柱作为固定相，再将蕲蛇水煎剂作为流动相流经Ni-NTA Agarose柱，然后PBS洗涤柱子两次，加入IgG Elution Buffer洗脱液进行洗脱，收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液冷冻干燥后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。

2.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（1）所述重组工程菌发酵培养的方法为：将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，获得发酵液。

3.如权利要求2所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（1）所述发酵液诱导培养的条件为：向发酵液中加入终浓度1mM的IPTG，在15℃、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液。

4.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（1）所述蛋白提取方法为：将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度1mM的苯甲基磺酰氟，在功率300W、温度4℃条件下超声破碎10s，间隔10s，超声10min，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和苯甲基磺酰氟吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，离心，取上清，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL。

5.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于步骤（2）所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原反应液体积的5%，过滤，滤液在-20℃冷冻干燥后制成粉末，然后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，用0.25μM微孔滤膜过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。

6.如权利要求1所述蕲蛇提取物，其特征在于所述蕲蛇提取物按如下方法制备：（1）糖皮质激素受体蛋白：将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，向培养液中加入终浓度1mM的IPTG，在15℃、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度1mM的苯甲基磺酰氟，在功率300W、温度4℃条件下超声破碎，超声10s，间隔10s，超声10min，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和苯甲基磺酰氟，吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，12000rpm，离心10min，离心后取上清液，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL；（2）蕲蛇提取物的制备：将步骤（1）制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到Ni-NTA Agarose柱作为固定相，将蕲蛇水煎剂作为流动相流经偶联受体蛋白的Ni-NTA Agarose柱，然后PBS洗涤柱子两次，加入IgG Elution Buffer洗脱液进行洗脱，收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液在-20℃冷冻干燥后粉碎成粉末，然后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，用0.25μM微孔滤膜过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。

7.一种权利要求1所述蕲蛇提取物在制备糖皮质激素类抗炎药物中的应用。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种蕲蛇提取物，特别涉及从蕲蛇中提取可与糖皮质激素受体结合的物质及其应用。 

（二）背景技术

蕲蛇属蝰科五步蛇[Agkistrodon acμtμs(Gμenther)]的干燥体，味甘，咸，性温，具有祛风，通络，止痉的功效。将蛇入药自古有之，《开宝本草》载：“主中风湿痹不仁，筋脉拘急，口面喎斜，半身不遂，骨节疼痛，大风疥癞及暴风瘙痒，脚弱不能久立”。化学成分研究表明，蕲蛇主要化学成分有脂肪、脂质、挥发油、脂肪酸类、维生素类、磷脂及氨基酸及小分子类化合物，另外还含有3种毒蛋白和大量的稀有氨基酸类，并含透明质酸酶、精氨酸脂酶及阻凝剂等（王贵金,孙佳明,王丹,等.蝮蛇肉中肌苷的HPLC-MS/MS鉴定与含量测定.世界科学技术-中医药现代化,2007.9（5）68-71）。 

现代研究认为，蛇组织有强烈的生物活性，应用得当，疗效确切，诸如止痛、抗炎、扶正等方面都有着独特的效验。诸蛇之功效多近似，我们利用风湿病研究平台临床应用发现，蕲蛇在治疗风湿性疾病中可以有效减少糖皮质激素的使用量，起到类激素样作用，而且无副作用（司徒忠,谢冠群,谢志军,范永升教授治疗风寒湿痹经验.浙江中医药大学学报,2008.第32:(2),300-301）。方炳福等报道，用中药虫、蛇类药物治疗风湿性关节炎50例,总有效率分别为90%和97%(方炳福,类风湿性关节炎治疗现状与展望.实用中医内科杂志,1998.12:(2),13-14)。张海等报道，采用白蛇参附汤治疗类风湿性关节炎患者52例，获得满意疗效(张海，白蛇参附汤治疗类风湿性关节炎52例疗效观察,中华中医药杂志,2008.23(7),651-652)。另外，通过小鼠试验，我们发现蕲蛇的水、醇提取液均有明显的抗炎作用， 而且蕲蛇提取物明显抑制佐剂及胶原诱导的大鼠足肿胀(张纪达,等,蕲蛇水提取物对胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10的影响，中华中医药杂志,2012.27(5),1407-1409.谷恒存,等,蕲蛇水提液对佐剂性关节炎大鼠的免疫调节作用,中华中医药杂志,2012.27(10),2676-2678)。 

目前对于风湿疾病患者而言，使用糖皮质激素（glμcocorticoid）是常用的治疗方法，但是长期使用高剂量的糖皮质激素容易增加感染风险并引起骨质疏松和骨坏死等( H,et al,Mechanisms involved in the side effects of glμcocorticoids.Pharmacology&Therapeμtics,2002.96,(1),23-43)。筛选副作用小和治疗作用显著的类糖皮质激素药物而提高体内治疗指数是一个非常有前景的工作。Reichardi等观察到，糖皮质激素受体（glμcocorticoid receptors，GR）二聚体化区域氨基酸发生突变的转基因小鼠（GRdim/dim）不能形成二聚体(Reiehar dt HM,Kaestner KH,Tμekermann J,et al.DNA bingding of the glμcocorticoid for receptor is not necessary for sμrvival.cell,1998.93(4),531-541)，但地塞米松在GRdim/dim小鼠及正常小鼠的炎症模型中，均表现出良好的抗炎活性。受此启发，大家开始寻找和开发选择性糖皮质激素受体调节剂（SGRMS）。SGRMS在与GR特异性结合后，主要发挥抑制核转录因子（nμclear transcription factor,NF-κB）和激活蛋白（activator protein-1,AP-1等促炎症因子转录作用（非基因组效应），对涉及糖异生、脂肪和氨基酸代谢等相关基因的转录激活作用减弱（基因组效应），进而在产生抗炎效应的同时，降低其副作用(Cindy Stahn&Frank Bμttgereit Genomic and nongenomic effects of glμcocorticoids Natμre Reviews Rheμmatology2008.7(4),525-533)。Ravindran等对糖皮质激素使用的剂量和治疗效果及安全性进行了统计，表明临床使用大剂量糖皮质激素抗炎时，主要以非基因组效应起作用，但不能抑制糖皮质激素的基因组效应，提出开发只保留非基因组效应的新型糖皮质激素的必要性(Vinod  Ravindran,Newer glμcocorticoids:Overcoming mechanistic hμrdles.Indian Joμrnal of Rheμmatology,2012.7(4),221–225)。此后，AL-4388、LGD5552、ZK216348和CpdA等化合物的相继出现，提示开发低毒副作用类糖皮质激素成分具有很大的可行性(Schacke H,et al,Dissociation of transactivation from transrepression by a selective glμcocorticoid receptor against leads to separation of therapeμtic effects from side effects,Proc Natl Acad SciΜSA,2004.101(1),P227-32;Miner JN,et al,Antiinflammatory glμcocorticoid receptor ligand with redμced side effects exhibits an altered protein-protein interaction Proc Natl Acad SciΜSA,2007.104(49),19244-19249)。发明人拟制备GR亲和层析柱，依据受体-配体理论从蕲蛇单方中富集可以和GR专一性结合的类似糖皮质激素的配体成分。 

天然药物的物质基础研究常用的方法是采用硅胶柱分离、鉴定、药理筛选等方式，这类方法存在试剂消耗量大、目标成分不明确等缺点。在本发明中，发明人利用GR亲和层析柱专一性筛选蕲蛇水提液中可以结合糖皮质激素受体的蕲蛇提取物，这样目标更明确而且需要的药材量更少，也为其他中药有效成分的获得提供了一种新的思路。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一种新的从蕲蛇中筛选可与糖皮质激素受体结合的物质及应用；该方法筛选成分目标明确，使用的药材量少；所得到的蕲蛇提取物可以快速用于高效低毒的糖皮质激素受体选择性调节剂的筛选靶标。与传统化合物的分离鉴定相比，筛选出的化合物的特异性和有效性都更强。 

本发明采用的技术方案是： 

本发明提供一种蕲蛇提取物，所述蕲蛇提取物的制备方法以糖皮质激素受体作为固定相，蕲蛇水煎剂作为流动相，收集蕲蛇水煎剂中可与糖皮质激素受体结合的蕲蛇提取液成分即蕲蛇提取物，具体所述蕲蛇提取物按 如下方法制备：（1）糖皮质激素受体蛋白表达：向含糖皮质激素受体基因的重组工程菌经发酵培养获得的发酵液中加入IPTG（即异丙基硫代半乳糖苷）进行诱导培养（优选IPTG的终浓度为1mM），获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀经超声破碎后提取蛋白，获得糖皮质激素受体蛋白；所述糖皮质激素受体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；（2）蕲蛇提取物的制备：将步骤（1）制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到Ni-NTA Agarose柱作为固定相，再将蕲蛇水煎剂作为流动相流过偶联糖皮质激素受体蛋白的Ni-NTA Agarose柱，蕲蛇水煎剂中能和糖皮质激素受体结合的物质会结合到Ni-NTA Agarose柱上，然后PBS洗涤Ni-NTA Agarose柱两次，加入IgG Elution Buffer洗脱液（优选购自21004PIERCE公司）进行洗脱进行洗脱，直接收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液冷冻干燥后用pH值为7.0的磷酸缓冲液溶解（缓冲液的体积用量多少对本发明没有影响，通常根据所需蕲蛇水煎剂的量定），过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。 

本发明所述蕲蛇水煎剂具体按如下步骤制备：蕲蛇干燥体20g，打碎，加双蒸水2000ml（即2000g），煎药罐煎煮至100ml，过滤后将溶液在-20℃冷冻干燥，粉碎成固体粉末，用pH值为7.0的磷酸缓冲液溶解，过滤（优选用0.25μM微孔滤膜过滤），滤液即为蕲蛇水煎剂。进一步，步骤（1）所述重组工程菌发酵培养的方法为：将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素（Ampicillin，Amp），在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，获得发酵液。 

进一步，步骤（1）所述发酵液诱导培养的条件为：向发酵培养液中 加入终浓度1mM的IPTG，在15℃、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液。 

进一步，步骤（1）所述蛋白提取方法为：将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度1mM的苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesμlfonyl flμoride,PMSF)，在功率300W、温度4℃条件下超声破碎，超声10s，间隔10s，超声10min，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和PMSF（尿素溶解液的用量能够溶解沉淀即可，通常为离心获得沉淀体积的10倍，PMSF的用量通常在尿素溶解液中的终浓度1mM），吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，离心，取沉淀，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL。更进一步，本发明所述蕲蛇提取物按如下方法制备：（1）糖皮质激素受体蛋白制备：将含糖皮质激素受体基因的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液，将种子液以体积浓度1%的接种量接种至LB液体培养基中，然后加入终浓度为100μg/ml的Amp，在37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，向培养液中加入终浓度1mM的IPTG，在15℃、200rpm条件下诱导培养12h，获得诱导培养液；将诱导培养液离心，收集沉淀用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液制成菌悬液，在菌悬液中加入终浓度1mM的PMSF，在功率300W、温度4℃条件下超声破碎10s，间隔10s，超声10min，离心，弃去上清液，沉淀加入尿素溶解液和PMSF，吹打均匀后振荡，冰置5min，重复振荡和冰置4次，离心，取上清液，获得糖皮质激素受体蛋白；所述尿素溶解液每50mL的配制方法为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL；（2）蕲蛇提取物：将步骤（1）制备的糖皮质激素受体蛋白偶联到Ni-NTA Agarose柱作为固定 相，将蕲蛇水煎剂作为流动相流经偶联受体蛋白的Ni-NTA Agarose柱，然后PBS洗涤柱子两次，加入IgG Elution Buffer洗脱液进行洗脱，收集流出液，获得蕲蛇提取物；所述蕲蛇水煎剂按如下方法制备：将蕲蛇粉末与双蒸水以质量比1：100混合后煎煮至原料体积的5%，过滤，滤液在-20℃冷冻干燥后粉碎成粉末，然后用pH值为7的磷酸缓冲液溶解，用0.25μM微孔滤膜过滤，滤液即为蕲蛇水煎剂。 

本发明还提供一种所述蕲蛇提取物在制备糖皮质激素类抗炎药物中的应用。糖皮质激素主要通过与糖皮质激素受体结合，激活糖皮质激素受体与NF-κB互作，从而起到抗炎作用，糖皮质激素受体主要通过与NF-κB和AP-1等相互作用，抑制NF-κB和AP-1促炎症因子转录作用，从而产生抗炎效应。通过细胞学实验检测表明本发明所分离的蕲蛇提取物可以显著增强糖皮质激素受体与NF-κB的相互作用，提示该结合物具有抗炎活性。 

本发明所述蕲蛇提取物的制备流程为： 

（1）基于NCBI网站上糖皮质激素受体全序列，采用RNA逆转录的方法扩增糖皮质激素受体全基因，并进行核苷酸改造，使其适合原核表达体系，改造后的核苷酸序列为SEA ID NO：1所示，所翻译的氨基酸序列为SEA ID NO：2所示。 

（2）将步骤（1）中合成的全基因构建在原核表达载体中。 

（3）将构建好的原核表达载体转化大肠杆菌，IPTG诱导糖皮质激素受体蛋白表达，筛选高效表达糖皮质激素受体的原核表达体系。 

（4）制备偶联糖皮质激素受体的镍柱。 

（5）已偶联的镍柱作为固定相，蕲蛇水煎剂作为流动相，富集可与糖皮质激素受体结合的化合物，采用蛋白洗脱液（即IgG Elution Buffer洗脱液）进行洗脱，收集蕲蛇提取物，获得的蕲蛇提取物经过液质联用色谱 进行结构分析，结果表明在10min和11min时均有峰出现。 

本发明步骤（1）所述的糖皮质激素受体全基因的克隆方法为本领域公知技术，可以采用相关商品化试剂盒进行克隆扩增，但是在本发明中我们针对克隆的核酸序列通过合成拼接的方式使之更适合于原核表达，获得SEQ ID NO：1所示的序列。 

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明涉及一种以蕲蛇水煎剂为流动相，以偶联糖皮质激素受体蛋白的Ni-NTA Agarose柱为固定相，以IgG Elution Buffer洗脱液作为洗脱剂，制备蕲蛇提取物的方法，该方法将蛋白原核表达技术和层析柱分离有效成分结合起来，可以更加有效的分离蕲蛇水煎剂中可与糖皮质激素受体结合的目标成分；糖皮质激素主要通过与糖皮质激素受体结合，激活糖皮质激素受体与NF-κB互作，从而起到抗炎作用。本发明制备的蕲蛇提取物，可以增强糖皮质激素受体与NF-κB相互作用，具有潜在的抗炎效应，为糖皮质激素的替代品提供了依据。 

（四）附图说明

图1：糖皮质激素受体全基因（GRα）PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为糖皮质激素受体全基因PCR扩增产物，泳道M为Marker。 

图2：基因改造过的糖皮质激素受体核苷酸序列（构建在克隆载体PΜC57中，经测序鉴定）与原核酸序列比对图谱。 

图3：提取糖皮质激素受体全基因载体质粒琼脂糖凝胶电泳图，泳道1-3为提取糖皮质激素受体全基因载体质粒酶切鉴定，泳道1：BamH I/EcoR I酶切，预期条带1502bp、746bp；泳道2：Hind III/Xho I酶切，预期条带1071bp、554bp、368bp；泳道3：BamH I/Xho I酶切，切出GRαCDS全长约2360bp；M1：Marker。 

图4：鉴定IPTG诱导的糖皮质激素受体原核表达的SDS-PAGE电泳 图，泳道M：Marker，泳道1：E4空载表达，泳道2：IPTG诱导空载，泳道3：E4-GRα，泳道4：IPTG诱导E4-GRα，蛋白Marker分子量从上之下依次为：170KD、130KD、100KD、70KD、55KD、40KD、35KD和25KD。 

图5：鉴定纯化的糖皮质激素受体蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道1为BSA(2.0μg)，泳道2为镍柱纯化的糖皮质激素受体蛋白；泳道M1为Marker，蛋白Marker分子量从上之下依次为：94KD、66KD、36KD、14KD。 

图6：蛋白免疫印迹鉴定纯化的糖皮质激素受体蛋白电泳图，泳道M为Marker；泳道1为镍柱纯化的糖皮质激素受体表达蛋白；Marker分子量从上之下依次为：120KD、85KD、60KD、40KD。 

图7：中低压色谱分离蕲蛇水煎剂中与糖皮质激素受体结合的蕲蛇提取物图谱，峰1为尿素峰，峰2和3分别为蕲蛇提取物的洗脱峰。 

图8：2号洗脱峰的质谱鉴定图谱。 

图9：3号洗脱峰的质谱鉴定图谱。 

图10：蕲蛇提取物调节的糖皮质激素受体与NF-κB的相互作用的蛋白免疫印迹图。从左至右在6孔板的细胞培养液中添加蕲蛇提取物的剂量分别为0μl、1μl、2μl、5μl、10μl、100μl，A（即IB：NF-κB）表示的是与糖皮质激素受体结合的NF-κB含量。B（即IB：GRα）显示的是糖皮质激素受体的含量，表明各组是一致的。C（即IB：NF-κB）显示的是NF-κB表达量。结果表明添加10μl蕲蛇提取物可以增强糖皮质激素受体与NF-κB的相互作用。 

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 

如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》（(美)M.R.格林//J.萨姆布鲁克科学出版社）、《液相色谱-质谱分析技术标准汇编/分析测试技术系列标准汇编》（中国标准出版社，2013年）等手册以及本发明所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。 

实施例1：基于亲和层析的方法富集蕲蛇水煎剂中蕲蛇提取物 

1、糖皮质激素受体（glμcocorticoid reccptor，GR）全基因的克隆 

淋巴细胞分离液(LTS1077 TBD公司)分离正常人血液白细胞，Trizol法提取白细胞总RNA。然后将总RNA逆转录成cDNA，逆转录以TaKaRa公司的AMV逆转录酶提供的体系为标准(TaKaRa RNA LA PCRTM KiT(AMV)Ver.1.1Code No：DRR012A)。根据GeneBank上提供的糖皮质激素受体的序列号NM_001020825.1，用Primer5.0设计一对含GRα CDS的远端引物扩增得到约2.8kb片段，上下引物序列为：5-TGTGCGAGAATGGGGAGG-3；5-GGGCACTGGTGGTTTAGG-3。PCR反应条件：94度3分钟，(94度35秒，59度30秒，72度3分钟)30个循环，72度10分钟，16度保存；PCR扩增得到的糖皮质激素受体α全基因经核酸电泳鉴定，大小正确，电泳结果如图1所示，箭头指示位置为所扩增的目的基因，1号泳道为GRα的PCR产物，标记M的泳道为Marker。将PCR产物连到克隆载体PΜC57中，进行测序。测序在上海生工生物工程有限公司完成，将测序结果与NM_001020825.1上的序列进行比对，检测克隆的基因的准确性。以测序正确的pMD18-T-GRα15号质粒为模板，使用引物扩增获取约2.4kb的GRα开放阅读框(氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示)，引物序列为：5-ATAcgcggatcc GCACTGATGGACTCCAAAGAATC-3； 

5-ATACCGctcgag CCATTCTTATTAAGGCAGTCAC-3；PCR反应条件： 94度2分钟，（94度15秒，64度15秒，72度2分30秒）30个循环，72度10分钟，16度保存； 

将克隆正确的基因进行核酸改造，使之更适合于原核表达，改造后的核酸序列（SEQ ID NO：1所示）与原核酸序列的差异利用DNAman软件进行比对分析，比对分析结果如图2所示。 

核苷酸序列SEQ ID NO：1： 

SEA ID NO：2为： 

MDSKESLTPSSKEIPSDVLGSERRKVIGFYKTLRGGATAKVSASSPSLAAAAQSDSKQRRLLVDFPKGSGSNAQQPDLSKAVSLSMGLYMGETETKVMGNDLGFPQQGQISLSSGETDFRLLEESIANLSRSTSVSENPMSSSSAVSGTPTEELPQTQSDVSSEQQNLKGQAGTSGGNVKLYPADQSTFDILQDLEFSSGSPGKETNESPWRPDLLMDENCLLSPLAGEDDPFLLEGNSSEDCKPFILPDTKPKIKDNGDVILSSPNSVPLPQVKTEKEDFIELCTPGVIKQEKLGPVYCQASFSGANIIGNKMSAISVHGVSTSGGQMYHYDMNTASLSQQQDQKPIFNVIPPIPVSSENWNRCQGSGDDNLTSLGTMNFPGRSVFSNGYSSPGMRPDVSSPPSSSSTATGPPPKLCLVCSDEASGCHYGVLTCGSCKVFFKRAVEGQHNYLCAGRNDCIIDKIRRKNCPACRYRKCLQAGMNLEARKTKKKIKGIQQATTGVSQDTSENLNKTVVPATLPQLTPTLVSLLEVIEPEVLYAGYDASVPDSTWRIMTTLNMLGGRQVIAAVKWAKAIPGFKNLHLDDQMILLQYSWMFLMAFALGWRSYRQSSGNLLCFAPDLVVNEQRMTLPCMYDQCKHMLYVSSELKRLQVSYEEYLCMKTLLLLSSVPKEGLKSQELFDEIRMTYIKELGKAIVKREGNSSQNWQRFYQLTKLLDSMHEVVENLLNYCFQTFLDKTMSIEFPEMLAEIITNQLPKYSNGNIKKLLFHQK。 

2、糖皮质激素受体原核表达载体的构建 

表达基序如下， 

Expression Vector E4骨架：Trx标签+His标签序列+TEV切割位点+糖皮质激素受体； 

表达目的蛋白分子量为102961.2道尔顿，pI为6.27。序列如下， 

MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA EWCGPCKMIA 

PILDEIADEY QGKLTVAKLN IDQNPGTAPK YGIRGIPTLL 

LFKNGEVAAT KVGALSKGQL KEFLDANLAG SGSGHMHHHH 

HHSSGLVPRG SGMKETAAAK FERQHMDSPD LGTENLYFQG+糖皮质激素受体氨基酸序列。 

实验基本过程分为PCR产物切胶回收，双酶切，回收双酶切产物，连接到对应的原核表达载体。连接产物转化大肠杆菌，挑阳性克隆扩大培养，提取质粒，采用两端酶切位点和序列中间酶切位点共同检测。 

PCR产物切胶回收采用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。按 AxyPrep DAN凝胶回收试剂盒说明书进行。在1.5mL离心管中加入双酶切体系如表1配制，然后37℃水浴3h。表1中所用限制性内切酶均购自TakaRa公司。 

表1双酶切体系 

双酶切产物清洁回收用PCR清洁回收试剂盒回收双酶切产物。按TaKaRa Code:DV807A说明书进行。双酶切的PCR产物和同样进行双酶切的原核表达载体进行连接，连接体系如表2所示，然后16℃循环水浴过夜。 

表2连接体系 

连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性单菌落接种到含10mL LB培养液（培养液中含有终浓度100μg/ml的Amp）培养管中，37℃恒温摇床200转/分，过夜。收集菌体，获得含糖皮质激素受体基因的重组工程菌，提取质粒。按AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒说明书进行。采用两端酶切位点和序列中间酶切位点共同检测。结果表明Expression Vector E4表达载体为高效表达糖皮质激素受体蛋白的原核表达体系， 图3显示构建在E4原核表达载体中的GR原核表达载体的酶切鉴定分析，结果显示载体构建正确。M1泳道为Marker，泳道1为BamH I/EcoR I酶切产物，预期条带1502bp、746bp；泳道2为Hind III/Xho I产物酶切，预期条带1071bp、554bp、368bp；泳道3为BamH I/Xho I酶切，切出GRαCDS全长约2360bp。同样条件下以pGS21a，Expression Vector E3载体为对照，结果表明经筛查确定Expression Vector E4表达载体为最优表达体系。以pGS21a，Expression Vector E3为骨架构建的表达载体，诱导后表达的目的蛋白含量很低。 

3、糖皮质激素受体蛋白的诱导表达 

（1）诱导：将含糖皮质激素受体基因的Expression Vector E4载体转化的重组工程菌接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12h，获得种子液，向2个50mL离心管中分别加入35mL LB培养液后再加入175μl Amp和350μl种子液摇匀，封上封口膜。将上述两管培养液放至恒温37℃摇床200rpm摇菌6-8h，使OD₆₀₀达到0.6-0.8。在超净台中往两管培养液中分别加入终浓度1mM的IPTG(Merck CB420322)，封膜，15℃，200rpm摇菌12小时。 

（2）蛋白提取：摇过夜的两管培养液在4℃，12000rpm，离心5min，弃废液。分别用3mL PBS（pH值为7.0）吹打沉淀，均匀后合并为一管，制成菌悬液。在上述菌悬液中加入终浓度1mM苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesμlfonyl flμoride,PMSF)进行超声破碎细胞，设置功率300W，超声10s间隔10s，超声时间10min，温度4℃。将破碎后的菌悬液12000rpm，4℃，离心10min。往沉淀中加入6mL尿素溶解液（尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，加蒸馏水定容至50mL）和工作浓度为1mM的PMSF(碧云天，ST506)，吹打均匀进行振荡，然后冰置5min。振荡冰置4循环。之后4℃，12000rpm，离心10min。离心后的 上清液即为含糖皮质激素受体基因的E4载体转化的重组工程菌经IPTG诱导后的总蛋白，取20μl上清液加等体积的2×上样缓冲液，通过SDS-PAGE方法检测蛋白的诱导表达情况。 

同样条件下，以不含糖皮质激素受体基因的E4载体转化的重组工程菌、未经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白，不含糖皮质激素受体基因的E4载体转化的重组工程菌、经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白和含糖皮质激素受体基因的E4载体转化的重组工程菌、未经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白作为对照。 

SDS-PAGE的诱导表达情况如图4所示，结果表明IPTG诱导后目的蛋白表达明显。其余的上清液将在步骤4中用于制备糖皮质激素受体亲和层析柱。M泳道表示蛋白Marker，蛋白Marker分子量从上之下依次为：170KD,130KD,100KD,70KD,55KD,40KD,35KD,25KD。1号泳道为含有E4空载的未经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白。2号泳道为IPTG诱导含有E4空载的大肠杆菌总蛋白。3号泳道为含有E4-GRα表达载体的未经IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白。4号泳道为IPTG诱导含E4-GRα表达载体的大肠杆菌总蛋白。 

4、糖皮质激素受体蛋白纯化及层析柱制备 

首先通过镍柱纯化糖皮质激素受体蛋白，检测镍柱与糖皮质激素受体蛋白的结合效率。过程如下，（1）镍柱预处理：准备镍柱，打开空柱子盖子，添加1ml填料（Ni-NTA Agarose，QIAGEN30210），然后打开柱子的下盖，流走约800μL，马上加入2倍柱体积结合缓冲液（每50mL的配方为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，咪唑0.0344，加蒸馏水定容至50mL）平衡。在填料上方约500μL时把下盖盖住。 

（2）糖皮质激素受体蛋白偶联Ni-NTA Agarose柱：将步骤3中制备的含有目的蛋白的上清液经0.45μm的滤膜过滤后，取滤液加到预处理后 的镍柱中。将镍柱置于垂直摇床上、4℃、70转每分钟放置1.5h。用1mL PBS（pH值为7.0）洗涤2次柱子，获得偶联糖皮质激素受体蛋白的Ni-NTA Agarose柱。 

（3）偶联蛋白的验证：分别用500μL和1mL的结合缓冲液（每50mL的配方为：尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，咪唑1.72g，加蒸馏水定容至50mL）洗脱偶联糖皮质激素受体蛋白的Ni-NTA Agarose柱，收集洗脱液置于1.5mL离心管中。取20μl洗脱液加入20μl2×上样缓冲液（P0015B碧云天生物技术研究所）进行SDS-PAGE鉴定，检测蛋白纯化效率，结果如图5所示，结果表明洗脱下来的蛋白纯度高。图中1号泳道为2.0μg的牛血清白蛋白（BSA）样品。2号泳道为经过镍柱纯化洗脱的糖皮质激素受体总蛋白，箭头指示位置为目的蛋白。M1为蛋白Marker泳道，蛋白Marker分子量从上之下依次为：94KD、66KD、36KD、14KD。为了鉴定原核表达的糖皮质受体蛋白的正确性，选用糖皮质激素受体的一抗（μsc-1002，Santa Crμz公司），通过蛋白免疫印迹技术鉴定回收的蛋白是否为糖皮质激素受体。结果如图6显示纯化的蛋白正确，M为蛋白Marker泳道，蛋白Marker分子量从上之下依次为：120KD、85KD、60KD、40KD。1为镍柱纯化的糖皮质激素受体表达，经糖皮质激素受体抗体鉴定表明原核表达的蛋白为糖皮质激素受体。镍柱可以回收使用，分别用洗涤缓冲液（尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，咪唑1.72g，加蒸馏水定容至50mL）1mL和结合缓冲液（尿素24.04g，氯化钠0.8766g，磷酸钠0.9503g，咪唑0.0344，加蒸馏水定容至50mL）1mL洗涤一次，再加入结合缓冲液1mL平衡准备重新上样。 

5、蕲蛇提取物的制备 

蕲蛇干燥体20g，打碎，加双蒸水2000ml，煎药罐煎煮至100ml，过滤后将滤液在-20℃冷冻干燥，粉碎成固体粉末，分成10等分作为样品。 取一份样品加PBS（pH值为7.0）溶解，过0.25μM微孔滤膜，滤液作为流动相流过步骤4方法制备偶联糖皮质激素受体的Ni-NTA Agarose柱，PBS缓冲液（pH值为7.0）洗涤两次。然后用200μl IgG Elution Buffer洗脱液进行洗脱（21004PIERCE公司），收集流出液，获得可以和糖皮质激素受体结合的蕲蛇提取物。该提取物一部分通过细胞学方法进行活性分析，见步骤7。一部分用于进一步鉴定，见步骤6。 

6、液质鉴定蕲蛇提取物组分 

仪器型号为Agilent6520Q-TOF/MS，色谱条件：流动相A为体积浓度0.1%甲酸水溶液，B为体积浓度0.1%甲酸乙腈溶液，20%的B等度洗脱后，运行时间为3min。设置柱温箱温度为35℃，取步骤5中制备的蕲蛇提取物，进样量5μl，自动进样器温度为5℃。结果如图7显示，检测到两个分离峰，图中标记为2号峰（10min处）和3号峰（11min处）。 

质谱条件：分别使用ESI正离子模式采集数据。数据采集质荷比范围为：50-1000m/z，干燥气为N₂，干燥气温度为350℃，正离子模式毛细管电压（Capillary Voltage）为4000V，碎裂电压（Framentor Voltage）为180V，锥孔电压（Skimmer Voltage）分别为60V，雾化器压力（Nebμlizer pressμre）为40psi，使用Centroid模式保存质谱数据，数据采集速率为2spectrμm/s。结果如图8、9所示。 

7、蕲蛇提取物增强糖皮质激素受体与核转录因子NF-κB的相互作用 

细胞转染及蕲蛇提取液的添加：在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养HEK293T细胞（GNHu43，中国科学院上海细胞库），转染前24小时，将细胞接种至6孔板，当细胞生长铺满底部80%，准备转染。转染前制备好GRα-Myc真核表达载体和NF-κB-Flag表达载体质粒。一个六孔板的转染体系用的质粒的量是1μg，脂质体3μl，转染步骤参照转染试剂SμperFecting TMII Vitro DNA Transfection Reagent(2102-100普飞生 物技术有限公司)说明书进行。转染24小时后添加1ml新鲜培养基，同时每个孔分别添加蕲蛇提取物0μl、1μl、2μl、5μl、10μl、100μl、继续培养24小时后，收集细胞。 

免疫共沉淀及Western-blot分析蛋白互作：在收集好的细胞中（细胞量大约为长满细胞的六块板两个孔之和）加入500μl的IP裂解液（P0013碧云天生物技术有限公司），4℃旋转1h使其充分裂解，20,000g离心20min，取上清，加入一抗(1μg/500μl)，4℃混合过夜，再加20μl Protein A/G beads（P2012碧云天生物技术）混合4-6h。之后用IP裂解液洗涤ProteinA/G beads一次，再用PBS洗涤beads三次。最后加20μl2×SDS蛋白上样缓冲液煮沸10min后离心，吸出液体并进行SDS-PAGE电泳。然后进行蛋白免疫印迹鉴定，该方法为公知技术。所用的一抗和二抗为：NFκB p65C-20Rabbit Polyclonal Antibody(sc-372Santa Cruz公司)，GRmouse monoclonal antibody（sc-393232Santa Cruz公司），二抗IRDy680标记的羊抗兔抗体（926-32221LI-COR公司）和二抗IRDy680标记的羊抗鼠抗体（926-32210，LI-COR公司）。 

结果如图10所示，该方法所得到的蕲蛇提取物可以增强糖皮质激素受体和NF-κB的相互作用。其中6孔板中添加10μl的蕲蛇提取物可以增强糖皮质激素受体和NF-κB的相互作用的效果最明显。 

一种蕲蛇提取物及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。