专利摘要

本发明涉及用DNA制备金属纳米结构的方法，更具体地涉及制备金属纳米结构的方法，其中用自我组装的DNA作为框架，并且因此与常规的自下而上(bottom-up)方法相比容易控制所述纳米结构的取向、形状和尺寸。通过该方法制备的金属纳米结构显示出优良的局域表面等离子体共振特性，并且因而能作为荧光底物用于药物递送、生物医学成像、超灵敏生物传感器等。

权利要求

1.一种用于制备基于生物分子的金属纳米结构的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)在金属纳米种子(nanoseed)表面形成自我组装的生物分子单分子层，由此形成金属纳米种子-生物分子复合物；和

(b)使金属离子在所述复合物表面生长，同时用还原剂来还原所述金属离子。

2.权利要求1的方法，其中所述金属纳米种子-生物分子复合物通过如下步骤制备：

(i)将脱硫生物素修饰的DNA结合至链霉亲和素修饰的磁性粒子以形成磁性粒子-DNA复合物；

(ii)将金属纳米种子结合至所述复合物的DNA以形成磁性粒子-DNA-金属纳米种子复合物；和

(iii)将生物素溶液添加至所述磁性粒子-DNA-金属纳米种子复合物以分开磁性粒子和DNA之间的键，并从复合物去除磁性粒子，由此获得金属纳米种子-DNA复合物，

其中步骤(i)至(iii)重复进行。

3.权利要求2的方法，其中步骤(i)进一步包括在形成所述磁性粒子-DNA复合物后，将磁性粒子-DNA复合物添加至EDC和NHS的混合溶液的步骤，以激活DNA。

4.权利要求1的方法，其中所述金属纳米种子-生物分子复合物通过如下步骤制备：

(i)用具有末端二硫化物基团的寡核苷酸和具有羟基基团的低聚(乙二醇)(OEG-OH)处理所述金属纳米种子表面以形成自我组装的单分子层，由此修饰金属纳米种子表面；

(ii)向金属纳米种子添加末端硫醇化的DNA，并通过配体交换反应从所述金属纳米种子分离和去除所述寡核苷酸，由此制备金属纳米种子-DNA复合物；和

(iii)通过电泳回收所述金属纳米种子-DNA复合物。

5.权利要求4的方法，其中所述寡核苷酸是脱氧三磷酸腺苷(dATP)。

6.权利要求1的方法，其中所述金属纳米种子-生物分子复合物通过如下步骤制备：

(i)将DNA嵌入分子插入到质粒DNA中然后脱盐，以获得质粒DNA溶液；

(ii)向所述质粒DNA溶液添加金属纳米种子水溶液，以形成金属纳米种子-质粒DNA复合物；和

(iii)用缓冲液(pH10-14)处理所述金属纳米种子-质粒DNA复合物。

7.权利要求5的方法，其中所述DNA嵌入分子是1-芘丁酸(PBA)或S-(2-[[4-(2-菲基)丁基]氨基]乙基)硫代硫酸氢酯(S-(2-[[4-(2-phenanthryl)butyl]amino]ethyl)hydrogensulfurothioate))。

8.权利要求1的方法，其中所述金属离子的来源选自下组之一：四氯金(III)酸(HAuCl₄)、四氯金(III)酸钠(NaAuCl₄)、氯化金(III)(AuCl₃)、和四氯金(III)酸钾(KAuCl₄)。

9.权利要求1的方法，其中所述还原剂为选自下组之一：羟胺(NH₂OH)、二苯胺磺酸钠、抗坏血酸、和聚(烯丙基胺)盐酸盐。

10.权利要求1的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)之后，向所述复合物添加MPA以终止生长的步骤。

11.权利要求1的方法，其中所述金属纳米种子是选自下组的任一者：纳米球(nanosphere)、纳米棒(nanorod)、纳米棱柱(nanoprism)和纳米片(nanosheet)，并具有1-100nm的尺寸。

12.权利要求1的方法，其中所述金属纳米种子由选自下组的任一者制成：金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、钯(Pd)、铜(Cu)、硅(Si)、锗(Ge)、铝(Al)、和金属氧化物。

13.权利要求1的方法，其中所述生物分子是选自下组的任一者：单链DNA、双链DNA、DNA寡聚物、RNA寡聚物、质粒DNA、多肽、和蛋白质，其中所述单链DNA、双链DNA、DNA寡聚物和RNA寡聚物长度为5-5000bp，而所述质粒DNA长度为800-10000bp。

14.通过权利要求1-13任一项的方法制备的基于生物分子的金属纳米结构。

15.权利要求14的基于生物分子的金属纳米结构，其是选自下组的任一者：纳米球、纳米棒、纳米棱柱和纳米片，并具有5-500nm的尺寸。

16.一种局域表面等离子体共振传感器，器包含权利要求14的金属纳米结构。

说明书

发明领域

本发明涉及用于制备基于生物分子的金属纳米结构的方法，并且更具体涉及这样的制备金属纳米结构的方法，通过使用自我组装的生物分子，所述金属纳米结构的取向、形状和尺寸是可控的。

发明背景

纳米颗粒具有与大物质特性(bulkproperties)完全不同的独特特性(例如光学的、电磁的和催化的特性等等)。纳米颗粒具有这些特性的原因在于纳米颗粒具有增加的特定表面区域，其导致特性的变化。在金属纳米颗粒中，观察到了局域表面等离子体共振(LSPR)现象。金属纳米颗粒的吸收谱带的强度或频率取决于金属纳米颗粒的种类和放置纳米颗粒的金属种类而不同。进一步地，金属纳米颗粒的表面等离子体频率取决于所述颗粒的尺寸、形状和尺寸分布而不同。

用于制备此类纳米颗粒的方法可以分为自上而下(top-down)方法和自下而上(bottom-up)方法。自上而下方法是塑形成聚团(sculptsamass)使其变小的工艺。该方法具有小型化的限制，因为其不能制备尺寸为50nm或更低的材料。自下而上方法是通过如垛砖块一样结合原子或分子来制备新的纳米材料的工艺。自下而上方法的典型实例包括自我组装技术。可逆性的弱相互作用如氢键、疏水作用和范德华力在生物分子如DNA、RNA和蛋白质之间起作用。此类可逆的相互作用允许生物分子自发经历自我组装成为复合结构，此现象成为“自我组装现象”。换言之，可以通过组装生物分子用这种自我组装现象来制备具有数纳米至数十纳米尺寸的纳米结构。然而，由于自我组装现象在特定条件下自发地发生，所以自我组装过程非常难于精确控制。

为了解决这一问题，韩国专利公开出版号No.10-2012-0096120公开了改变反应条件(即温度、pH或盐浓度)来控制自我组装现象的方法的用途。然而，该方法有一个问题，在于生物分子难于快速控制，这是由于变化是应用于所述生物分子的水溶液的。

因此，需要继续对制备具有相同模式的纳米材料的方法进行研究，所述模式能自起始反应阶段制造想要的形状。

发明内容

本发明的一个目标是提供用于制备金属纳米结构的方法，其基于生物分子的自我组装而不使用表面活性剂，并且其使得纳米结构的形状和大小能够自制备工艺的起始阶段容易地进行控制。

本发明的另一个目标是提供通过上述方法制备的金属纳米结构。

本发明的又一个方面是提供包含所述金属纳米结构的局域表面等离子体共振传感器。

为了达到上述目标，本发明提供了用于制备基于生物分子的金属纳米结构的方法，该方法包括如下步骤：

(a)在金属纳米种子(nanoseed)表面形成自我组装的生物分子单分子层，由此形成金属纳米种子-生物分子复合物；和

(b)使金属离子在所述复合物表面生长，同时用还原剂来还原所述金属离子。

在一个本发明的实施方案中，所述金属纳米种子-生物分子复合物可以通过如下步骤制备：

(i)将脱硫生物素修饰的DNA结合至链霉亲和素修饰的磁性粒子以形成磁性粒子-DNA复合物；

(ii)将金属纳米种子结合至所述复合物的DNA以形成磁性粒子-DNA-金属纳米种子复合物；和

(iii)将生物素溶液添加至所述磁性粒子-DNA-金属纳米种子复合物以分开磁性粒子和DNA之间的键，并从复合物去除磁性粒子，由此获得金属纳米种子-DNA复合物，其中步骤(i)至(iii)重复进行。

在本发明的另一个实施方案中，步骤(i)可以进一步包括在形成所述磁性粒子-DNA复合物后，将磁性粒子-DNA复合物添加至EDC和NHS的混合溶液的步骤，以激活DNA。

在本发明的又一个实施方案中，所述金属纳米种子-生物分子复合物可以通过如下步骤制备：(i)用具有末端二硫化物基团的寡核苷酸和具有羟基基团的低聚(乙二醇)(OEG-OH)处理所述金属纳米种子表面以形成自我组装的单分子层，由此修饰金属纳米种子表面；(ii)向金属纳米种子添加末端硫醇化的DNA，并通过配体交换反应从所述金属纳米种子分离和去除寡核苷酸，由此制备金属纳米种子-DNA复合物；和(iii)通过电泳回收所述金属纳米种子-DNA复合物。此处的寡核苷酸可以是脱氧三磷酸腺苷(dATP)。

在本发明的又一个实施方案中，所述金属纳米种子-生物分子复合物可以通过如下步骤制备：(i)将DNA嵌入分子插入到质粒DNA中然后脱盐，以获得质粒DNA溶液；(ii)向所述质粒DNA溶液添加金属纳米种子水溶液，以形成金属纳米种子-质粒DNA复合物；和(iii)用缓冲液(pH10-14)处理所述金属纳米种子-质粒DNA复合物。

在本发明的又一个实施方案中，所述DNA嵌入分子可以是1-芘丁酸(PBA)或S-(2-[[4-(2-菲基)丁基]氨基]乙基)硫代硫酸氢酯(S-(2-[[4-(2-phenanthryl)butyl]amino]ethyl)hydrogensulfurothioate))。

在本发明的又一个实施方案中，所述金属离子的来源可以选自下组之一：四氯金(III)酸(hydrogentetrachloroaurate(III))(HAuCl₄)、四氯金(III)酸钠(NaAuCl₄)、氯化金(III)(AuCl₃)、和四氯金(III)酸钾(KAuCl₄)。

在本发明的又一个实施方案中，所述还原剂可以是选自下组的一项或多项：羟胺(NH₂OH)、二苯胺磺酸钠、抗坏血酸、和聚(烯丙基胺)盐酸盐(poly(allylamine)hydrochloride)。

在本发明的又一个实施方案中，所述方法还可以进一步包括在步骤(b)之后，向所述复合物添加MPA以终止生长的步骤。

在本发明的又一个实施方案中，所述金属纳米种子可以是选自下组的任一者：纳米球(nanosphere)、纳米棒(nanorod)、纳米棱柱(nanoprism)和纳米片(nanosheet)，并具有1-100nm的尺寸。

在本发明的又一个实施方案中，所述金属纳米种子可以由选自下组的任一者制成：金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、钯(Pd)、铜(Cu)、硅(Si)、锗(Ge)、铝(Al)、和金属氧化物。

在本发明的又一个实施方案中，所述生物分子可以是选自下组的任一者：单链DNA、双链DNA、DNA寡聚物、RNA寡聚物、质粒DNA、多肽、和蛋白质，其中所述单链DNA、双链DNA、DNA寡聚物和RNA寡聚物长度为5-5000bp，而所述质粒DNA长度为800-10000bp。

本发明还提供通过所述方法制备的基于生物分子的金属纳米结构。此处的金属纳米结构可以是选自下组的任一项：纳米球、纳米棒、纳米棱柱和纳米片，并可具有5-500nm的尺寸。

本发明还提供包含所述金属纳米结构的局部表面等离子体共振传感器。

附图简述

图1是显示通过逐个(one-after-another)法来形成金属纳米种子-DNA复合物的工艺的示意图。

图2是显示沉积于金属纳米种子-DNA复合物上的金属离子的示意图。

图3是显示获取自金属纳米种子-DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳的条带的示意图。

图4A是显示沉积于金属纳米种子-DNA复合物上的金属离子的HR-TEM图像。

图4B是照片，其显示由将金属离子沉积于金属纳米种子-DNA表面上导致的生长溶液颜色变化。

图5是HR-TEM图像，其显示金属离子和MPA之间的结合作为时间的函数。

图6描绘了根据本发明的一个实施方案的金属纳米结构的HR-TEM图像和示意图。

图7是根据本发明的一个实施方案的纳米结构的X射线衍射光谱；图7A是HR-TEM图像；图7B是FFT图像。

图8是根据本发明的一个实施方案的纳米结构的X射线能量色散光谱。

图9是根据本发明的一个实施方案的纳米结构的示意图。图9A是金属纳米种子的TEM图像，而图9B和9C是根据本发明的实施方案的纳米结构的TEM图像。

图10描绘了显示质粒DNA的沉降系数作为pH的函数的图，以及显示超螺旋状态变化的示意图。

图11A是根据本发明的一个实施方案的纳米卷曲(nanocoil)的HR-TEM图像，而图11B是根据本发明的一个实施方案的纳米盘(nanodisk)的HR-TEM图像。

图12是显示实施例1和2中制备的金属纳米种子和金属纳米结构的局域表面等离子体共振(LSPR)的强度的图。

实施发明的最佳方式

下文对本发明进行具体描述。

本发明涉及用于制备基于生物分子的金属纳米结构的方法，并且其特征在于可以从制备工艺的起始阶段制备具有想要的尺寸和形状的金属纳米结构，所述制备是通过用一些选定的生物分子形成金属纳米种子-生物分子复合物并允许所述复合物充当金属离子生长的框架。本发明已经发现了通过用选定的生物分子修饰金属纳米种子表面而形成金属纳米种子-生物分子复合物的最适合方法，并且还观察到了通过该方法制备的金属纳米结构的存在。此外，发现用每种生物分子形成的金属纳米结构的局域表面等离子体共振(LSPR)特性与金属纳米种子的那些相比显著提高。

用于控制金属纳米结构的尺寸和形状的方法包括控制生物分子的形状、控制结合至金属纳米种子的生物分子的数量、控制金属纳米种子的尺寸、控制反应时间、控制金离子的量、添加反应终止剂，等等。

(1)基于生物分子形状的控制

根据本发明，将制备的生物分子锚定(anchored)在金属纳米种子上以形成金属纳米种子-生物分子复合物框架，并将金离子还原且所述金原子在框架上结晶，由此制备金属纳米结构。此处的生物分子可以是选自下组的任一项：单链DNA、双链DNA、DNA寡聚物、RNA寡聚物、质粒DNA、多肽、和蛋白质，并且金属纳米结构的形状和尺寸可以取决于所选生物分子的种类来进行控制。

(2)基于结合至金属纳米种子的生物分子数量的控制

金属纳米结构的形状也可以根据结合至金属纳米种子的生物分子数量来确定。如果所述生物分子是双链DNA，则能结合至金属纳米种子的DNA分子的数量可以是1-7。分离金属纳米种子-DNA的方法包括多种方法，其依赖于DNA分子结合数量。首先，如果双链DNA长度为50-5,000bp，则可以用电泳来分离金属纳米种子-DNA复合物。在这种情况下，随着结合至金属纳米种子的DNA分子数量增加，电泳中的迁移距离减少(图3)。第二，如果双链DNA的长度是50bp或更少，则可以通过逐个法来分离金属纳米种子-DNA复合物。

然而，在单链DNA或质粒DNA的情况中，结合至金属纳米种子的DNA数量之间没有差别。因此，在这种情况中，不需要依赖于结合至纳米种子的生物分子数量来分离金属纳米种子-生物分子复合物。

(3)除上述方法外，金属纳米结构的尺寸可以根据金属纳米种子的尺寸和形状、金离子的量、金离子生长的时间、或反应终止剂的使用来控制。此处的金属纳米种子可以是选自下组的任一项：纳米球、纳米棒、纳米棱柱和纳米片，并可具有1-100nm的尺寸。作为反应终止剂，可使用巯基丙酸(MPA)。

通过金属纳米种子上自我组装的单分子层用根据生物分子种类的不同方法来制备金属纳米种子-生物分子复合物。

金纳米种子和具有短核苷酸序列的双链DNA的复合物可以通过逐步法来制备。具体而言，将第一DNA结合至金纳米种子，并将第二和第三DNA序贯地结合至其上，由此控制DNA分子的数量，所述DNA分子在金纳米种子表面形成自我组装的单分子层。

此外，为了制备金纳米种子和具有短核苷酸序列的双链DNA的复合物，通过配体交换反应用单核苷酸来形成复合物，并通过电泳根据金纳米种子表面形成的DNA分子数量来分离所述复合物。

在金纳米种子-质粒DNA复合物的情况下，质粒DNA具有不同的扭曲的形状，这取决于pH。因此，可以用缓冲液来制备具有多种扭曲形状金纳米种子-质粒DNA复合物。

为了制备金纳米种子-多肽复合物，将磁性颗粒结合至之前制备的多肽。用基质辅助激光解吸电离(MALDI)和荧光激活细胞分选(FACS)来分离所得的磁性颗粒-多肽复合物。向所述复合物添加金纳米种子水溶液，然后温育。多肽的半胱氨酸硫醇基团结合至金纳米种子以形成磁性颗粒-多肽-金纳米种子复合物。图2是显示沉积在纳米种子-多肽复合物表面上的金离子的示意图。

实施例

下文将参考实施例对本发明进一步详细描述。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅出于描述目的，而并非意在对本发明范围进行限制。因此，本发明的实质范围将通过所附的权利要求及其等同物来限定。

(1)本发明中使用的寡核苷酸可购自IntegratedDNATechnologies。除另有说明外，其他试剂购自SigmaAldrich。所有化学溶液和缓冲液均制备于超纯水中(18.2mQ/cm)。

(2)金纳米结构用原子力显微镜(AFM)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和快速傅里叶变换(FFT)进行观察。纳米结构的元素分析通过X射线能量色散光谱(EDX)来进行。晶体结构通过X射线晶体学技术(XRD)来确定。生长热力学通过UV-Vis-NIR光谱法来分析。此外，通过局域表面等离子体共振(LSPR)来研究金纳米簇生长过程。

制备实施例1：金纳米种子水溶液的制备

通过用柠檬酸钠还原HAuC1₄来合成金纳米种子的水溶液。在加强搅拌下将20mL的0.25mMHAuC1₄溶液加热直至沸腾。然后，向其快速添加2.0mL的5.0mM柠檬酸钠溶液，并观察到持续的从无色至红色的颜色变化。当搅拌持续10分钟时，颜色变化停止。随后，移除加热源，并再次继续搅拌15分钟。当溶液冷却至室温时，添加蒸馏水来替代蒸发的水分。将最终溶液经0.2μm膜滤器过滤并储存于4℃。

为了将羧基基团引入到纯金表面上，形成末端为低聚(乙二醇)的自我组装的单分子层。

向9.0mL的金纳米颗粒溶液添加含有摩尔比率为1:9的HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂COOH(OEG₆-COOH,ProChimia)和HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH(OEG₃-OH,ProChimia)的1.0mL的无水乙醇溶液，至0.5mM的终浓度。将混合物伴随温和搅拌室温温育过夜，以在金表面形成混合的SAM。然后，将混合物离心(14000rpm，30min，4℃)，并将上清倒出，之后用PBS缓冲液(0.01M，pH6.0)洗涤沉淀。重复此离心/重悬步骤三次或更多次以除去乙醇和未结合的OEG分子，由此制备羧基稳定化的金纳米种子的水溶液。

实施例1

(1)金纳米种子-DNA复合物的制备

通过逐步法来制备金纳米种子和具有50个或更少寡核苷酸的双链DNA的复合物。将第一DNA结合至金纳米种子，然后将第二和第三DNA序贯结合至其上。

图1是显示形成金纳米种子-DNA复合物的工艺的示意图。

将0.6mL的Para-链霉亲和素修饰的(para-streptavidin-modified)磁性颗粒(PMP)与1.0nmol的脱硫生物素修饰的DNA混合，并将混合物在室温伴随温和振荡温育30分钟。为了防止非特异性结合，添加0.5mL的封闭溶液(0.01MPBS缓冲液，2％BSA和5％PEG)。然后，将混合物再次温育30分钟并洗涤，并向其添加0.1M的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。随后，将金纳米种子水溶液添加至混合物，然后在室温伴随温和振荡温育4小时。随后，洗涤溶液三次以去除未反应的金纳米种子。

随后，将所述溶液悬于1mL的1uM生物素溶液(pH7.4)中。将悬液在室温伴随温和振荡温育3小时。将结合DNA的金纳米种子和PMP用磁力彼此分开，以获得金纳米种子-DNA复合物，然后将其储存在4℃。

(2)金纳米种子-DNA复合物表面上的金离子生长

金离子的生长是通过金纳米种子-DNA复合物上的金离子的还原和金离子的沉积来进行的。用HAuC1₄(四氯金(III)酸)作为金离子源和用羟胺(NH₂OH)作为还原剂来制备生长溶液。

用金纳米种子-DNA复合物来加载生长溶液。随着金离子沉积于金纳米种子-DNA复合物的表面上，生长溶液的颜色发生了可见的变化。图4A是显示沉积于金纳米种子-DNA复合物上的金离子的HR-TEM图像，而图4B是照片，其显示在金离子沉积于金纳米种子-DNA复合物上期间生长溶液颜色的变化作为时间的函数。

(3)金颗粒生长的终止

添加巯基丙酸(MPA)作为反应终止剂以抑制进一步的堆积。由图4可见，随着金离子结合至MPA，金离子不再沉积于金纳米种子-DNA复合物上，指示金离子的生长终止。

图6显示实施例1中制备的纳米结构(纳米星)的HR-TEM图像和示意图。

图7实施例中制备的金纳米结构的X射线衍射光谱；图7A是HR-TEM图像；图7B是FFT图像。

图8是制备的金纳米结构的X射线能量色散(EDX)光谱。在图8中，在约2keV(M行)和10keV(L行)处的峰指示金纳米结构，而其他峰对应于铜、DNA和残基。因此，证实根据本发明的实施例制备了金纳米结构。

实施例2

(1)金纳米种子-DNA复合物的制备

通过单核苷酸和具有末端二硫化物基团的DNA之间的配体交换反应然后进行电泳，来制备金纳米种子和具有50个或更多核苷酸的双链DNA的复合物。作为单核苷酸，使用dATP，因为与其他单核苷酸(dCTP、dGTP和dTTP)相比，dATP强力结合至金纳米颗粒，并显示出强的抗盐性。

将脱氧三磷酸腺苷(dATP)和OEG-OH(HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₃OH(ProChimia)添加至金颗粒的水溶液并在室温温育。向温育的溶液添加末端硫醇化的DNA，并搅拌2小时。向所述溶液添加10vol％(1/5当量)的甘油，然后将其加载到2％琼脂糖凝胶上。在0.5xTris-硼酸盐-EDTA缓冲液中以7V/cm的速率对凝胶进行电泳以去除为反应的材料和dATP，并分离金纳米结构-DNA复合物。如图3中可见，金纳米种子-DNA复合物在琼脂糖凝胶上形成条带，这依赖于结合至金纳米种子的DNA的数量，这指示其可以被分离。

步骤(2)和(3)以与实施例1中所述相同的方式进行。

图9是显示根据实施例2制备的纳米花(nanoflower)的TEM图像。

实施例3至5

(1)金纳米种子-DNA复合物的制备

用1-芘丁酸(PBA)来制备包含质粒DNA的金纳米种子-DNA复合物，所述1-芘丁酸是一种DNA嵌入分子。

从大肠杆菌(E.coli)分离质粒DNA(pUCI9)并在溴化乙锭存在下通过氯化铯梯度离心来纯化。

将质粒DNA与10nMPBA混合并搅拌1小时。在NAP柱(GEHealthcare)上对搅拌的混合物进行脱盐以制备1nM质粒DNA溶液。通过向其添加0.1M的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来激活质粒DNA溶液。

向9.0mL的金纳米种子水溶液添加以10:1的摩尔比率含有OEG-OH和OEG-NH₂((HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OCH₂NH₂)的1.0mL无水乙醇溶液，至终浓度为0.5mM。在室温温和振荡混合物溶液6小时以形成沉淀，然后洗涤以去除未结合的材料。将沉淀悬于10mMPBS缓冲液(pH7.4)中并与激活的质粒溶液混合。搅拌混合物3小时，然后在4℃和14000rpm离心30分钟。去除上清，并用Tris缓冲液(0.01M，pH11、12或13)洗涤剩余的材料。

步骤(2)和(3)按与实施例1中所述相同的方式进行。

图11A是用质粒DNA制备的纳米卷曲的HR-TEM图像，而图11B是用质粒DNA制备的纳米盘的HR-TEM图像。

测量实施例1

实施例1和2中制备的金纳米种子和金纳米结构的局域表面等离子体共振(LSPR)的强度用暗视野显微镜自Rayleigh散射光谱进行测量。为了获得Rayleigh散射光谱，用分光光度计(Microspec2300i,RoperScientifics)和高灵敏度CCD镜头(PIXIS:400B，PrincetonInstruments)来收集暗视野显微镜。首先，使金纳米棒结合至硫醇包被的载玻片。然后，将所述载玻片置于关闭的浴(bath)成像小室内(RC-30,WarnerInstruments,USA)。将小室安装到暗视野显微镜的样品架上并与注射器泵(HarvardApparatus)连接。组装LSPR系统，然后将含有蒸馏水和20％、40％、60％、和80％甘油的溶液序贯注射到运行中的细胞上，并记录来自金纳米棒的Rayleigh散射光谱。应用Lorentzian算法来拟合光谱并用OriginPro7.5软件来提供精确的峰和去噪。通过纳米颗粒基质的折射率(RI)变化的纳米传感器的LSPR灵敏度，通过折射率(RI)变化相对LSPR最大漂移(maximumshift)来确定(单位：nm/RIU，RIU：折射率)。

测量结果在图12中显示。如图12中可见，根据本发明的金纳米结构的局域表面等离子体共振的强度比金纳米种子的高。这指示根据本发明的金纳米结构能有利地用于荧光传感器等等。

工业实用性

如上文所述，用于制备根据本发明的金属纳米结构的方法是基于生物分子的自我组装而不使用表面活性剂，并使所述纳米结构的形状和尺寸能够从制备工艺的起始阶段容易地控制。

此外，通过本发明的方法制备的金属纳米结构能与PDA脂质体一起广泛用于药物载体、荧光传感、药物递送、生物医学成像、超灵敏生物传感器，等等。

用于制备基于生物分子的金属纳米结构的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。