专利摘要

本发明公开了一种加加米宁衍生物及其制备方法及其制备方法及应用。本发明发现了加加米宁衍生物对肿瘤细胞及耐药肿瘤具有较强细胞毒活性，能为抗肿瘤药物的开发提供新的途径和思路，并提供了一套可行的制备方法。本发明材料来源广泛，成本低廉，使用效果理想。

权利要求

1.一种加加米宁衍生物，其特征在于：该衍生物的化学名称为3-O-氯乙酰基-加加米宁，其结构式如式(1)所示：

2.一种如权利要求1所述的加加米宁衍生物的制备方法，其特征在于：将加加米宁、二环己基碳二亚胺及催化剂混合后，加入溶剂充分溶解；滴加吡啶后再加入反应试剂，常温反应，直到反应原料反应完全，第二次加入溶剂后，分别用饱和酒石酸水溶液及饱和碳酸氢钠水溶液萃取，合并萃取液后经浓缩得粗品，通过硅胶柱层析，洗脱得白色无定形粉末样品3-O-氯乙酰基-加加米宁。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：加入的反应试剂与加加米宁的摩尔比为1-2：1，反应试剂为氯乙酰溴、氯乙酰碘或氯乙酸。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的催化剂为DCC、DMAP、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾，催化剂的用量为加加米宁质量的0.1-10％。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：洗脱剂为石油醚与丙酮，石油醚与丙酮的体积比为8:1。

6.一种如权利要求1所述的加加米宁衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及药学领域，尤其是一种加加米宁衍生物及其制备方法及应用。

背景技术

隔山消在中国具有广泛分布，其干燥根长期被用来预防和治疗多种疾病，如心血管疾病、糖尿病、局部缺血诱导性疾病、早衰、阳痿、神经衰弱、腰肌劳损伤及脓肿。

近年来，C21–固醇类皂苷具有广泛的生化活性，引起了广泛的关注，如加加米宁类化合物对醛氧化酶及脂质过氧化具有调节作用从而显示出生物学活性。

发明内容

本发明发现了一种加加米宁衍生物。

本发明还提供该加加米宁衍生物的制备方法。

本发明还发现了该加加米宁衍生物在制备抗肿瘤药物或抗耐药肿瘤药物中的应用。

本发明是这样实现的：加加米宁衍生物，该衍生物的化学名称为3-O-氯乙酰基-加加米宁，其结构式如式(1)所示：

加加米宁衍生物的制备方法，将加加米宁、二环己基碳二亚胺及催化剂混合后，加入溶剂充分溶解；滴加吡啶后再加入反应试剂，常温反应，直到反应原料反应完全，第二次加入溶剂后，分别用饱和酒石酸水溶液及饱和碳酸氢钠水溶液萃取，合并萃取液后经浓缩得粗品，通过硅胶柱层析，洗脱得白色无定形粉末样品3-O-氯乙酰基-加加米宁。

滴加的吡啶的量为加加米宁质量的0.1-10％。

加入的反应试剂与加加米宁的摩尔比为1-2：1，反应试剂为氯乙酰溴、氯乙酰碘或氯乙酸。

所述的催化剂为DCC、DMAP、吡啶、无机碱如碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾，催化剂的用量为加加米宁质量的0.1-10％。

所述的洗脱剂为石油醚与丙酮，石油醚与丙酮的体积比为8:1。

加加米宁衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

加加米宁衍生物在制备抗耐药肿瘤药物中的应用。

发明人结合前期研究工作，发现20-O-salicyl-kidjoranin显示出了对白血病细胞HL-60(IC50 6.72μM)及乳腺癌细胞MCF-7(IC50 2.89μM)的较强细胞毒活性，青阳参苷元及rostratamin也显示出了对白血病细胞K-562(IC50 6.72μM)及乳腺癌细胞MCF-7(IC502.49μM)的较强细胞毒活性。因此，发明人选择加加米宁化合物为原料，设计合成衍生物3-O-氯乙酰基-加加米宁，并评价其抗肿瘤活性，其结构通过核磁共振谱、质谱等数据解析及化学方法进行分析鉴定。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明发现了一种加加米宁衍生物，其对肿瘤细胞及耐药肿瘤具有较强细胞毒活性，能为抗肿瘤药物的开发提供新的途径和思路，并提供了一套可行的制备方法。本发明材料来源广泛，成本低廉，使用效果理想。

附图说明

图1为3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)(编号A611)对T细胞淋巴瘤细胞EL-4白血病细胞CB7及黑色素瘤细胞WM9的诱导凋亡检测；

图2为3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)能抑制Friend病毒诱导BALB/c小鼠发生红白血病；

图3为3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)能延缓人T细胞淋巴瘤细胞致免疫缺陷小鼠死亡。

具体实施方式

本发明的实施例1：3-O-氯乙酰基-加加米宁(3-O-chloroacetyl-gagamine)的制备方法：

在25毫升反应瓶中取100毫克加加米宁(100毫克，0.162毫摩尔)，加入10毫升无水二氯甲烷(DCM)，搅拌，加入吡啶(0.1毫克)，然后加入氯代乙酰氯(1.13当量，0.183毫摩尔)。室温下搅拌24小时，TLC检测，原料消失后，加入30毫升水,20毫升二氯甲烷萃取，然后再用二氯甲烷分两次萃取(2×30毫升)。有机相依次经饱和酒石酸(3×30毫升)、碳酸氢钠(3×30毫升)、饱和氯化钠(2×10毫升)洗涤后，加入无水硫酸镁干燥。过滤，减压蒸去有机溶剂，残留物置于硅胶层析柱，以石油醚：丙酮混合溶剂(8:1)洗脱，分离得到90毫克3-O-chloroacetyl-gagamine(收率80.1％)。

本发明的实施例2：3-O-氯乙酰基-加加米宁(3-O-chloroacetyl-gagamine)的制备方法：在25毫升反应瓶中取100毫克加加米宁(100毫克，0.162毫摩尔)、二环己基碳二亚胺(DCC，0.324毫摩尔)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.06毫摩尔)，加入10毫升无水二氯甲烷(DCM)，搅拌，然后加入氯代乙酰氯(1.13当量，0.183毫摩尔)。室温下搅拌24小时，TLC检测，原料消失后，将反应混合物过滤，残渣用二氯甲烷清洗(2×10毫升)，滤液加入30毫升水，再用二氯甲烷分三次萃取(3×30毫升)。有机相依次经饱和酒石酸(3×30毫升)、碳酸氢钠(3×30毫升)、饱和氯化钠(2×10毫升)洗涤后，加入无水硫酸镁干燥。过滤，减压蒸去有机溶剂，残留物置于硅胶层析柱，以石油醚：丙酮混合溶剂(8:1)洗脱，分离得到70毫克3-O-chloroacetyl-gagamine(收率62.3％)。

3-O-氯乙酰基-加加米宁(3-O-chloroacetyl-gagamine)的制备方法：

3-O-chloroacetyl-gagamine：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ：9.19(s,1H,H-3″),8.74(d,J＝3.7Hz,1H,H-5″),8.11-8.09(t,J＝7.8Hz,1H,H-7″),7.41-7.38(d,J＝16.4Hz,1H,H-3′),7.36-7.32(m,3H,Ar-H),7.25-7.24(m,2H,Ar-H),7.21-7.19(dd,J＝7.8,4.9Hz,1H,H-6″),6.10-6.07(d,J＝16.0Hz,1H,H-2′),5.44(br.s,1H,H-6),4.93-4.89(q,J＝5.95Hz,2H,H-20),4.85-4.82(dd,J＝11.25,4.1Hz,1H,H-12),4.76-4.69(m,1H,H-3),4.55(s,H,-OH),4.04(s,2H,-COCH2Cl),3.90(s,H,-OH),1.64(s,3H,18-CH3),1.38-1.37(d,J＝6.15Hz,3H,21-CH3),1.16(s,3H,19-CH3).

13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:166.7(-COCH2Cl),166.3(C-1′),163.6(C-1″),153.3(C-5″),150.6(C-3″),144.3(C-3′),138.4(C-5),137.4(C-7″),134.0(C-4′),130.3(C-7′),128.7(C-6′,8′),128.0(C-5′,9′),126.1(C-2″),123.3(C-6″),119.6(C-6),118.6(C-2′),87.8(C-14),87.4(C-17),75.8(C-20),75.7(C-3),74.1(C-8),73.3(C-12),56.4(C-13),43.1(C-9),41.1(C-4),38.2(C-1),37.6(-COCH2Cl),36.8(C-10),34.3(C-7),32.8(C-16),32.7(C-15),26.9(C-2),24.8(C-11),18.1(C-19),14.9(C-21),10.5(C-18).

ESI-MS m/z:694.2[M+H]+,716.0[M+Na]+,1409.3[2M+Na]+。

本发明的实施例3：3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)的生物学实验结果：

1、3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)对肿瘤细胞生长的抑制

运用MTT实验检测了3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)对多种细胞生长的抑制作用(表1)，结果发现3-O-氯乙酰基-加加米宁对T细胞淋巴瘤细胞293T、EL-4、CEM-C7H2、MOLT4、BW-5147、B细胞淋巴瘤细胞TK6、白血病细胞K562、DP17-17、CB7及黑色素瘤细胞WM9的生长具有显著的抑制作用，说明3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)对肿瘤细胞生长的抑制作用具有选择性。其中对293T、EL-4、CEM-C7H2、BW-5147、CB7、WM9细胞生长的抑制作用与阳性对照药阿霉素的效果接近。

表1：3-O-氯乙酰基-加加米宁对肿瘤细胞生长的抑制效果

2、3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)(编号A611)能显著诱导白血病细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡的结果如图1所示：5μmol/L的3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)处理人T细胞淋巴瘤细胞EL-4、白血病细胞CB7及黑色素瘤细胞WM9，24小时后有41.1％的EL-4细胞发生凋亡，11.6％的CB7细胞发生凋亡，14.7％的WM9细胞发生凋亡，表明.3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)能显著诱导白血病细胞凋亡。

3、3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)能抑制Friend病毒诱导BALB/c小鼠发生红白血病

给BALB/c小鼠注射Friend病毒会诱导其产生红白血病，最后导致小鼠死亡。注射Friend病毒的同时注射3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)(编号A611)，会延长小鼠的存活时间，会抑制Friend病毒诱导的BALB/c小鼠红白血病的发生，如图2所示。

4、3-O-氯乙酰基-加加米宁能延缓人T细胞淋巴瘤细胞致免疫缺陷小鼠死亡

在体外培养人T细胞淋巴瘤EL-4细胞，收集3×106细胞，注射到免疫缺陷的SCID小鼠，然后直接注射DMSO(对照组)和A611。结果表明对照组的小鼠会迅速的死亡，而注射了3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)(编号A611)的小鼠则延缓死亡，表明3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)能延缓人T细胞淋巴瘤细胞致免疫缺陷小鼠死亡，如图3所示。

本发明的实施例4：将本发明的加加米宁衍生物制备药物时，将其与药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂制备成各种剂型。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。将3-O-氯乙酰基-加加米宁采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型，如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行抑郁症的治疗。

按实施例1的方法制得的3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌职称注射液。

按实施例1的方法先制得3-O-氯乙酰基-加加米宁，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其充分溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封获得粉针剂。

按实施例1的方法制得的3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，支持粉剂。

按实施例1的方法制得的3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)，按其与赋形剂重量比为1:5—1:10的比例加入赋形剂，制成粒压片。

按实施例1的方法制得的3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)，按常规口服液制法制成口服液。

按实施例1的方法制得的3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

按实施例1的方法制得的3-O-氯乙酰基-加加米宁(1)，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

加加米宁衍生物及其制备方法及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。