专利摘要

本发明公开了一株芽孢杆菌及其在工业中的应用，该菌株筛选自从黄海捡回来的腐烂的海带，于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNo.M2019315，其可产褐藻胶裂解酶，并且所产的褐藻胶裂解酶的酶活性适应温度范围较广，在30‑45℃之间。本发明筛选得到的菌株所产的褐藻胶裂解酶的酶活性适应温度范围较广，在工业中具有一定的优势，针对保藏编号为CCTCCNo.M2019315的菌株专门研制的发酵培养基营养充足，菌株可以高密度生长，所以产褐藻胶裂解酶的量较多，降解褐藻胶的能力较强，产物褐藻寡糖的产量较高。

权利要求

1.一株芽孢杆菌，分类命名为Bacillus sp.，其特征在于，该株芽孢杆菌筛选自从黄海捡回来的腐烂的海带，于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2019315，其产褐藻胶裂解酶，并且所产的褐藻胶裂解酶的酶活性适应温度范围较广，在30-45℃之间相对酶活都在75%以上，最适的酶反应温度为35℃。

2.利用权利要求1所述的保藏编号为CCTCC No. M 2019315的芽孢杆菌制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1：将活化后的菌株先用摇瓶在30℃、200rpm的条件下培养24h，然后将摇瓶内的菌液接入到一级发酵罐中，在30℃、200rpm的条件下扩大培养24h，获得种子液；

步骤2：将种子液接入到二级发酵罐中，使菌株发酵产酶，获得发酵液；

步骤3：将发酵液在4℃离心除去菌体，获得粗酶液；

步骤4：将粗酶液加入到褐藻胶溶液中，在30-45℃的温度下酶解22h，得到酶解液——褐藻寡糖溶液；

步骤5：对酶解液依次进行超滤、纳滤、冷冻干燥，得到粉末——褐藻寡糖。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1中，培养菌株所用到的种子培养基的配方为：

葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2中，发酵罐中的发酵培养基的配方为：

葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤2中，菌株发酵产酶时：

在发酵的第0-6h，调整发酵罐的通气量为24m3/h，转速为140rpm，温度为30℃；

在发酵的第6-20h，调整发酵罐的通气量为36m3/h，转速为160rpm，温度为30℃；

在发酵的第20-24h，调整发酵罐的通气量为24m3/h，转速为140rpm，温度为30℃。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤4中，酶解温度为35℃。

说明书

技术领域

本发明涉及一株芽孢杆菌及其在工业中的应用，具体涉及一株可产褐藻胶裂解酶且酶活性适应温度范围广的芽孢杆菌以及该菌株在工业中的应用——利用该菌株制备褐藻寡糖，属于海洋生物技术领域。

背景技术

褐藻胶是由α-L古罗糖醛酸和β-D甘露糖醛酸两种单糖醛酸组成的线性酸性多糖，广泛的存在于海带、裙带菜等大型褐藻类植物细胞壁中。褐藻胶的降解产物褐藻寡糖具有多种生物学活性，例如：降血脂、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等。目前，生产褐藻寡糖的方法有两种：一步法、两步法。一步法是指一步直接完成褐藻寡糖的发酵生产。该方法一方面，产酶和酶解的最佳条件不一致，导致生产效率低；另一方面，发酵生产的过程中产生的褐藻寡糖一部分会被菌体利用，造成产物含量低。两步法是指先制备褐藻胶裂解酶再进一步酶解，排除了一步法的缺点，是目前褐藻寡糖生产的最佳选择。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一株可产褐藻胶裂解酶并且所产的褐藻胶裂解酶的酶活性适应温度范围较广的芽孢杆菌。

本发明的第二个目的在于利用上述芽孢杆菌、结合特定的发酵培养基，提供一种发酵周期短、产物产量高的工业化制备褐藻寡糖的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一株芽孢杆菌，分类命名为Bacillus sp.，其特征在于，该株芽孢杆菌筛选自从黄海捡回来的腐烂的海带，于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2019315，其可产褐藻胶裂解酶，并且所产的褐藻胶裂解酶的酶活性适应温度范围较广，在30-45℃之间。

前述的保藏编号为CCTCC No. M 2019315的芽孢杆菌在制备褐藻寡糖中的应用，其特征在于，利用保藏编号为CCTCC No. M 2019315的芽孢杆菌制备褐藻寡糖的方法具体包括以下步骤：

步骤1：将活化后的菌株先用摇瓶在30℃、200rpm的条件下培养24h，然后将摇瓶内的菌液接入到一级发酵罐中，在30℃、200rpm的条件下扩大培养24h，获得种子液；

步骤2：将种子液接入到二级发酵罐中，使菌株发酵产酶，获得发酵液；

步骤3：将发酵液在4℃离心除去菌体，获得粗酶液；

步骤4：将粗酶液加入到褐藻胶溶液中，在30-45℃的温度下酶解22h，得到酶解液——褐藻寡糖溶液；

步骤5：对酶解液依次进行超滤、纳滤、冷冻干燥，得到粉末——褐藻寡糖。

前述的应用，其特征在于，在步骤1中，培养菌株所用到的种子培养基的配方为：

葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。

前述的应用，其特征在于，在步骤2中，发酵罐中的发酵培养基的配方为：

葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。

前述的应用，其特征在于，在步骤2中，菌株发酵产酶时：

在发酵的第0-6h，调整发酵罐的通气量为24m³/h，转速为140rpm，温度为30℃；

在发酵的第6-20h，调整发酵罐的通气量为36m³/h，转速为160rpm，温度为30℃；

在发酵的第20-24h，调整发酵罐的通气量为24m³/h，转速为140rpm，温度为30℃。

前述的应用，其特征在于，在步骤4中，酶解温度为35℃。

本发明的有益之处在于：

（1）经过选育得到的保藏编号为CCTCC No. M 2019315的菌株可产褐藻胶裂解酶，并且所产的褐藻胶裂解酶的酶活性适应温度范围较广，在工业中具有一定的优势；

（2）针对保藏编号为CCTCC No. M 2019315的菌株专门研制的发酵培养基非常适合该菌株生长，发酵22-24h即可使菌株的生长密度达到最高值，菌株高密度生长可以缩短发酵周期，整个发酵周期只需48h；

（3）专门研制的发酵培养基中含有蛋白胨和酵母浸粉，营养充足，菌株可以高密度生长，所以产褐藻胶裂解酶的量较多，降解褐藻胶的能力较强，产物褐藻寡糖的产量较高。

附图说明

图1是我们构建的菌株22D-12的系统发育树；

图2是制备褐藻寡糖的流程图；

图3是酶解产物的薄板层析图谱；

图4是温度对褐藻胶裂解酶活性影响的研究结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、菌株筛选、鉴定及构建系统发育树

1、菌株筛选

准备MAlg培养基（选择性培养基）：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，琼脂20g/L，自来水配制。

准备种子培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。

2018年3月20日，我们从黄海采集了4棵腐烂的海带，并将这4棵腐烂的海带放到一起进行了均质，取清液按梯度稀释（10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8）后分别涂布于MAlg平板培养基中，对应的平板分别记为1P、2P、3P、4P、5P、6P、7P、8P，将这8个平板于30℃恒温倒置培养24h，之后从这8个平板上共挑出了22个单菌落，将挑出的这22个单菌落分别接到22个种子培养基中，于30℃、200rpm培养24h，之后接菌到22个新的MALg平板培养基中，这22个新的MAlg平板培养基分别记为1D、2D、3D、......、20D、21D、22D，再次于30℃恒温倒置培养24h，其中，标记为22D的平板上出现了多个明显的降解圈，我们对该平板上的菌落依次进行了编号（22D-1、22D-2、22D-3、......、22D-15、22D-16），然后对其中降解圈最明显的菌落（编号为22D-12）进行了分离纯化，并将该菌落对应的菌株记为菌株22D-12。

2、菌株22D-12的鉴定

首先用试剂盒抽提法提取菌株22D-12的DNA，然后经PCR扩增获得菌株22D-12的16S rDNA，运用NCBI中的Blast 程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行相似性比对。

比对结果：菌株22D-12为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的菌株。

3、构建菌株22D-12的系统发育树

获得菌株22D-12的16S rDNA后，用MEGA 5.1 软件（Neighbor-Joining）构建该菌株的系统发育树（见图1），分析各菌株的进化关系。

分析结果：菌株22D-12为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的菌株。

二、菌种保藏

我们筛选得到的菌株22D-12，由于其在MAlg平板培养基上产生了最明显的降解圈，所以该菌株是褐藻胶裂解酶产酶菌，并且所产的褐藻胶裂解酶具有较高的酶活性，所以我们将菌株22D-12保藏在了中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉，保藏日期为：2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC No. M 2019315，分类命名为：芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

三、利用菌株22D-12工业化制备褐藻寡糖

下面我们详细介绍利用菌株22D-12工业化制备褐藻寡糖的方法。参照图2，该方法具体包括以下步骤：

1、制备种子液

种子培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制，灭菌后备用。

将活化后的菌株22D-12用摇瓶（装种子培养基）在温度为30℃、转速为200rpm的条件下培养24h，然后将摇瓶内的菌液以2%的接种量接入到装有50L种子培养基的200L发酵罐中，在温度为30℃、转速为200rpm的条件下扩大培养24h，获得种子液。

2、发酵产酶

发酵培养基：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制，灭菌后备用。

将种子液以10%的接种量接入到装有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，使菌株发酵产酶，获得发酵液，其中：

在发酵的第0-6h，调整发酵罐的通气量为24m³/h，转速为140rpm，温度为30℃；

在发酵的第6-20h，调整发酵罐的通气量为36m³/h，转速为160rpm，温度为30℃；

在发酵的第20-24h，调整发酵罐的通气量为24m³/h，转速为140rpm，温度为30℃。

3、制备粗酶液

将发酵液在4℃温度下8000rpm离心10min除去菌体，获得粗酶液。

4、酶解反应

准备底物：将海藻酸钠溶解制备成浓度为20g/L的海藻酸钠溶液。

将粗酶液以1:9的体积比加入到1000L海藻酸钠溶液（海藻酸钠的量为20kg）中，在35℃的温度下酶解22h，即得到酶解液——褐藻寡糖溶液。

5、分离纯化酶解产物

对酶解液依次进行超滤、纳滤、冷冻干燥，得到13.34kg的粉末——褐藻寡糖，经计算，产物的产率为66.7%。

四、对酶解产物进行定性分析

利用薄层层析法（TLC）对酶解产物——褐藻寡糖进行初步定性分析。

采用 Silica Gel 60 F254 硅胶板（德国默克），上样量为 2 µL，展开剂体系为正丁醇∶甲酸∶水 = 4∶5∶1（V∶V∶V），将硅胶板置于层析缸中，使层析液将其两次展开，每次展开后室温下风干，用10%硫酸-乙醇溶液作为显色剂，再次风干后，对酶解产物进行薄板层析。

酶解产物经薄板层析后，层析图谱如图3所示，其中，左侧为褐藻寡糖标样，从上往下依次为：褐藻二糖、褐藻三糖、褐藻四糖、褐藻五糖、褐藻六糖；右侧为降解产物。

由图3可知，菌株22D-12降解褐藻胶所得到的降解产物中含有褐藻三糖、褐藻四糖、褐藻六糖三种褐藻寡糖。

五、关于酶解反应的最适温度

褐藻胶裂解酶是通过β消除机制在非还原端C4和C5之间形成不饱和双键，此不饱和双键在235nm处有强吸收，在一定范围内吸光值与形成的不饱和双键的量成线性关系。

取0.1ml粗酶液加入到0.9ml褐藻胶溶液中，40℃保温10min，然后置于100℃水浴中灭酶5min终止酶解反应，以灭活酶作对照，测定反应体系在235nm处的吸光值。

酶活力单位的定义：在以上条件下，每min使吸光值增加0.1的酶量为一个酶活力单位（EU，enzyme unit）。

用磷酸盐缓冲溶液与粗酶液混合，在不同的温度下（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃）孵育10min，用紫外分光光度法测定酶活。酶活最高点定义相对酶活为100%。

酶活的测定结果如图4所示。

由图4可知，此褐藻胶裂解酶的适应温度范围较广，在30-45℃之间相对酶活都在75%以上，最适的酶反应温度为35℃。

可见，我们筛选得到的菌株22D-12其所产的褐藻胶裂解酶具有较广的适应温度范围，菌株22D-12在工业中具有一定的优势。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

一株芽孢杆菌及其在工业中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。