专利摘要

本发明涉及用于制备式(I)的碳水化合物T细胞表位缀合物的方法：M(T-B)n(I)，其中M、T、B和n如权利要求1中定义。

权利要求

1.用于制备式(I)的碳水化合物T细胞表位缀合物的方法：

M(T-B)_n (I)

其中：

- M是树枝状聚赖氨酸核心；

- T是T细胞表位；

- B是包含至少一个碳水化合物残基(b)的碳水化合物B细胞表位；

- n是整数并表示共价键合到M的-T-B基团的数目；

所述方法包含步骤：

i）将保护的碳水化合物B细胞表位(B_Pr)与化合物M(T)n偶联，从而形成碳水化合物T细胞表位缀合物M(T- B_Pr)_n，所述保护的碳水化合物B细胞表位(B_Pr)的碳水化合物残基(b)的羟基用保护基团(Pr)保护，所述保护基团(Pr)选自烯丙基、对甲氧基苄基(PMB)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、苄氧基甲基(BOM)、乙酰丙酰基(Lev)、苯甲酰基(Bz)、2,5-二氟苯甲酰基、氯乙酰基、苄基(Bn)或乙酰基(Ac)，或所述保护基团(Pr)和与其结合的两个羟基形成C₅-C₆异亚丙基缩酮或C₅-C₆环烷基碳酸酯；

和

ii）从所获得的缀合物M(T-B_Pr)_n上去除所述保护基团Pr，从而获得所述碳水化合物T细胞表位缀合物M(T-B)_n。

2.权利要求1的方法，其中 M(T-B)_n选自下式(Ia)或(Ib)：

其中K是赖氨酸残基，并且

T和B如权利要求1定义。

3.权利要求1或2中任一项的方法，其中M是下式的(K)₂K-βAla-OH：

。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中T是包含肽的T细胞表位。

5.权利要求4的方法，其中T是CD8⁺或CD4⁺T细胞表位或包含CD8⁺或CD4⁺T细胞表位。

6.权利要求5的方法，其中T是CD4⁺T细胞表位或包含CD4⁺T细胞表位。

7.权利要求6的方法，其中T是脊髓灰质炎病毒(PV)片段蛋白、破伤风毒素片段或PADRE肽或包含脊髓灰质炎病毒(PV)片段蛋白、破伤风毒素片段或PADRE肽。

8.权利要求7的方法，其中T是由QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID No 1)组成的肽。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述碳水化合物残基(b)结合到氨基酸、肽或脂质残基。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中B是选自下列的碳水化合物残基或包含选自下列的碳水化合物残基：

。

11.权利要求10的方法，其中B是残基 (α-GalNAc-Ser/Thr)₃或包含残基 (α-GalNAc-Ser/Thr)₃。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述保护基团Pr是苄基(Bn)或乙酰基(Ac)。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤i)包含步骤：

a）将第一个保护的碳水化合物残基(b_Pr)与化合物M(T)_n偶联，从而形成碳水化合物T细胞表位缀合物M(T- BPr)_n，所述第一个保护的碳水化合物残基(b_Pr)的羟基用如前述权利要求中任一项所定义的保护基团(Pr)保护；并且

b）用进一步保护的碳水化合物残基(b_pr)重复步骤a)，直到获得式(II)M(T-B_Pr)_n 的保护的碳水化合物缀合物。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中Pr是苄基。

15.权利要求14的方法，其中苄基在存在TfOH或H₂的情况下去除。

16.权利要求1到13中任一项的方法，其中Pr是乙酰基。

17.权利要求16的方法，其中乙酰基在存在肼或MeONa的情况下去除。

18.式(II)的碳水化合物T细胞表位缀合物：

M(T-B_Pr)_n   (II)

其中

- M是树枝状聚赖氨酸核心；

- T是T细胞表位；

- B_Pr是包含至少一个碳水化合物残基(b)的保护的碳水化合物B细胞表位，所述保护的碳水化合物B细胞表位的羟基被如权利要求1所定义的Pr基团保护；并且

- n是整数并表示共价键合到M的-T-B基团的数目。

19.权利要求18的碳水化合物T细胞表位缀合物，其中T是肽或包含肽。

20.权利要求18或19中任一项的碳水化合物T细胞表位缀合物，其中Pr是苄基(Bn)或乙酰基(Ac)。

21.权利要求18到20中任一项的碳水化合物T细胞表位缀合物，其中B_Pr是保护的(α-GalNAc-Ser/Thr)₃。

22.权利要求18到21中任一项的碳水化合物T细胞表位缀合物，其中M是HO-βAla-K(K)₂。

23.权利要求18到22中任一项的碳水化合物T细胞表位缀合物，其中T是QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID N°1)。

24.权利要求18到23中任一项的碳水化合物T细胞表位缀合物M(T-B_Pr)_n用于制备如权利要求1-17中任一项所定义的碳水化合物肽缀合物M(T-B)_n 的用途。

说明书

本发明涉及制备式(I)的碳水化合物T细胞表位缀合物的方法和根据所述方法可以使用的式(II)的碳水化合物T细胞表位中间体。

在过去的十年间，已开发了MAG-Tn3，一种新类型的合成免疫原，其展示肿瘤相关的Tn抗原。MAG-Tn3是全合成糖肽(MW = 10’897Da)，其在四价骨架上将碳水化合物Tn抗原(作为三-Tn簇)结合到肽CD4⁺ T细胞表位 [5, 9]。

MAG-Tn3对应下列结构

MAG指多抗原糖肽。

因此，MAG-Tn3对应下式的碳水化合物肽缀合物B4-T4-M：

其中

- KKK是树枝状聚赖氨酸核心(M)，

- T是具有下列序列的肽CD4⁺ T细胞表位：

- Tn3是具有下列序列的三-Tn B细胞表位：

。

基于在小鼠和灵长类 [8, 9]中获得的成功体内结果，MAG-Tn3是治疗癌症的良好的治疗性疫苗候选物，其应当向前进入I/II期临床实验。

在国际专利申请WO 98/43677和美国专利号6,676,946中已经公开了制备肽碳水化合物缀合物，例如尤其是MAG-Tn3的合成途径。在小规模(1-10mg最终化合物)实施的此方法中，碳水化合物Tn3抗原掺入到树枝状肽M(T)₄构件(building block)。应当注意Tn3抗原的掺入是用完全未保护的糖实现的，其可以显得有利的，因为其避免最终的去保护步骤。

但是，发明人已显示该方法在规模放大时失败。的确，Tn残基的外部掺入难以控制并且影响粗纯度和总体得率。并且，这样高分子量糖肽的纯化是复杂的。

因此，需要改进的方法用于制备MAG-Tn3，其克服现有技术的缺点，具体而言允许获得更好的得率和纯度，特别是在更大规模和以可重复的方式时。

因此，本发明，在一方面，提供制备MAG-Tn3、并且更一般地式(I)(M(T-B)_n)的碳水化合物T细胞表位缀合物的新方法，允许大规模生产，具有更好的得率和纯度:

。

根据本发明的方法有利地能够使合成副产物最少，以改善方法的稳健性并以可重复的方式放大合成的规模。

更具体地，已经发现在B细胞表位掺入到M(T)_n构件之前用合适的保护基团(Pr)保护碳水化合物B细胞表位的羟基，能够使B细胞表位掺入的控制更好，并且从而改善得率和纯度两者，尤其在大规模时。

本发明的另一个目标是提供式(II) (M(T-B_Pr)_n)的新的碳水化合物T细胞表位缀合物，该化合物可用于式M(T-B)_n的碳水化合物T细胞表位缀合物的以高得率和纯度的制备。

本发明的进一步的目标是提供通过根据本发明的方法可获得的，具有优于95%纯度级别的式(I)(M(T-B)_n)的碳水化合物T细胞表位缀合物。

根据本发明的方法的这些和其它目标、特征和有利之处将在下面本专利公开的详细描述中公开。

因此，在一方面，本发明涉及用于制备式(I)的碳水化合物T细胞表位缀合物的方法：

其中：

M是树枝状聚赖氨酸核心；

T是包含肽的T细胞表位；

B是包含至少一个碳水化合物残基(b)的碳水化合物B细胞表位；

n是整数并表示共价键合到M的-T-B基团的数目；

所述方法包含步骤：

i）将保护的碳水化合物B细胞表位(B_Pr)(其碳水化合物残基(b)的羟基用保护基团(Pr)保护)与化合物M(T)_n偶联，从而形成碳水化合物T细胞表位缀合物M(T- B_Pr)_n，

所述保护基团(Pr)选自烯丙基、对甲氧基苄基(PMB)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、苄氧基甲基(BOM)、乙酰丙酰基(levulinyl，Lev)、苯甲酰基(Bz)、2,5-二氟苯甲酰基、氯乙酰基、苄基(Bn)或乙酰基(Ac)，

或所述保护基团(Pr)和与其结合的两个羟基形成C₅-C₆异亚丙基缩酮或C₅-C₆环烷基碳酸酯；

和

ii）从所获得的缀合物M(T-B_Pr)_n上去除保护基团Pr，从而获得碳水化合物T细胞表位缀合物M(T-B)_n。

树枝状聚赖氨酸核心(M)

式(I)缀合物的聚赖氨酸核心是树枝状的结构，其可以表示为星形，具有多个分支(-T-B)，其可以是相同或不同的。

该分支共价键合到树枝状核心的每个赖氨酸残基的NH₂末端，特别地通过肽键–NH-C(=O)-。

树枝状聚赖氨酸核心(M)的价m，即每个赖氨酸残基的NH₂末端的数目，是使得m ≥ n，优选m = n，n指示共价键合到M的(-T-B)分支的数目。

在另一方面，(-T-B)分支的数目n的范围为4到16，特别地4到8。

在进一步的方面，树枝状聚赖氨酸核心M包含至少3个赖氨酸残基，具体地是3到15个赖氨酸残基，更具体地3到7个赖氨酸残基。

在额外的方面，缀合物 M(T-B)_n选自下列式(Ia)或(Ib)：

其中：

K是赖氨酸残基，并且

T和B如上面所定义。

有利地，树枝状结构(Ia)和(Ib)在树枝状聚赖氨酸核心M的表面提供高密度的抗原。

在进一步的方面，M是下式的(K)₂K-βAla-OH：

(T-B)分支

式(I)缀合物上的碳水化合物B细胞表位和T细胞表位的存在使式(I)缀合物成为有效的免疫原。

T细胞表位

如本文所用，T细胞表位指抗原，具体而言是肽性质的，能够引发T细胞应答。

这些表位特别地在S. Stevanovic, “Identification of Tumour-associated T-cell epitopes for vaccine development”, Nature Reviews, 第2卷, July 2002, 第1至7页；J.H. Kessler, C.J.M. Melief, “Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy”, Leukemia (2007) 21, 1859-1874，或癌症免疫/肽数据库网址: http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm中描述。

掺入在式(I)缀合物中的T细胞表位可以是相同或不同的，肽或非肽的。

在具体的方面，碳水化合物T细胞表位缀合物是碳水化合物肽缀合物。肽的T细胞表位可以包含2到50个氨基酸。

T细胞表位可以特别地选自CD8⁺或CD4⁺T细胞表位。

CD8⁺T细胞表位，识别为肿瘤标志物，可以选自：

- MUC-1肽(胰腺，乳腺)

- MAGE 1和3 (黑色素瘤，肺) (T. Boon 等(1995), Immunology Today, 第16卷 n°7, 第334-336页)

- pme117/gp 100 (黑色素瘤)

- 酪氨酸酶(黑色素瘤) BAGE (黑色素瘤)

- GAGE(黑色素瘤)LB-33-B(黑色素瘤)

- CDK4

- p185^HER (乳腺，卵巢)

- CEA MART1/Melan-A (黑色素瘤)

- 或选自A. Van Pel等(1995) Immunological. Reviews n° 145, 第229-250页或于P. G. Coulie (1995), Stem Cells, 13, 第393-403页中描述的肿瘤抗原。

在一个具体的方面，T是或包含CD4⁺T细胞表位，其可以特别地是脊髓灰质炎病毒(PV)蛋白片段，破伤风毒素片段或PADRE肽。

作为选自脊髓灰质炎病毒(PV)蛋白片段的CD4⁺T细胞表位的实例，可以提及的是对应于来自1型脊髓灰质炎病毒的VP1蛋白的103-115位序列(KLFAVWKITYKDT) (SEQ ID N°4)的合成肽。

作为选自破伤风毒素片段的CD4⁺T细胞表位的实例，可以提及的是下列片段：

- 破伤风毒素的830-844位序列(QYIKANSKFIGITEL) (SEQ ID N°1)。  

- 破伤风毒素的947-967位序列(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE) (SEQ ID N°2)。  

- 破伤风毒素的1273-1284位序列(GQIGNDPNRDIL) (SEQ ID N°3)。

这些肽的T细胞表位通常结合到多个 II 类MHC(主要组织相容性复合物)人和鼠分子，因而避免CD4⁺T细胞应答遇到、与个体之间存在的MHC分子的多态性相关联的限制性问题。并且破伤风毒素肽的使用应当增加本发明的缀合物上存在的抗原的免疫原性，作为很多个体接种破伤风类毒素的结果。

作为肽T细胞表位的进一步的实例可以参考S. Stevanovic, “Identification of Tumour-associated T-cell epitopes for vaccine development”, Nature Reviews, 第2卷, July 2002, 第1至7页；J.H. Kessler, C.J.M. Melief, “Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy”, Leukemia (2007) 21, 1859-1874，或癌症免疫/肽数据库网址: http://www.cancerimmunity.org/peptide database/tumorspecific.htm。

非肽T细胞表位的实例特别地包括：

- 由C. C. A. M. Peeters (1991), 于The Journal of Immunology, 146,4309-4314所述的肺炎球菌4型多糖的片段，和寡糖破伤风类毒素缀合物，

- 由A. F. M. Verheul (1991)于Detection and Immunity, 第59卷, n°10, 第3566-3573页所述的脑膜炎球菌脂多糖。

B细胞表位

如本文所用，B细胞表位指能够引发B细胞应答的抗原。

如本文所用，碳水化合物指糖，特别地单糖、二糖、寡糖和多糖。

在优选的方面，形成式(I)缀合物的B细胞表位的碳水化合物残基(b)是N-乙酰吡喃半乳糖残基或其衍生物。

在具体的方面，碳水化合物残基(b)结合到氨基酸、肽或脂质残基。在又进一步的方面，碳水化合物残基是O-糖基氨基酸或肽。在进一步的方面，B细胞表位通过所述氨基酸或肽结合到树枝状结构M(T)_n。

B细胞表位可以包含一个或多个碳水化合物残基(b)，特别是1到10，尤其1到6个碳水化合物残基。

该B细胞表位可以选自肿瘤(癌)糖苷抗原，特别地选自：

- 糖脂类，包括酸性糖脂，例如，如，神经节苷脂GD2，GD3和GM3(黑色素瘤)和中性糖脂，例如，如，Lewisy(Ley)(乳腺，前列腺，卵巢)和Globo H(乳腺，前列腺，卵巢)抗原；

- O-糖基肽(或氨基酸)类，例如，如Tn抗原(α-GalNAc-Ser 或 α-GalNAc-Thr), TF 抗原(β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Ser 或 β-Gal-(1-3)-α-GalNAc-Thr)，经常存在于癌中但通常不在正常组织中的两种肿瘤标志物[Springer G. F. Science 224,1198-1206 (1984)] (卵巢，乳腺，肺)，或二-Tn(α-GalNAc-Ser/Thr)₂,三-Tn(α-GalNAc-Ser/Thr)₃或六-Tn(α-GalNAc-Ser/Thr)₆。

根据本发明的缀合物的B细胞表位也可以源自，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitis)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，和链球菌(Streptococcus)的荚膜细菌多糖。

多糖是通过合成方法获得的碳水化合物残基。

本缀合物的B细胞表位还可以是真菌来源，例如如，从酿酒酵母分离的B细胞表位。

在优选的方面，式(I)缀合物的B细胞表位优先是肿瘤标志物，例如，如，Tn和TF抗原。

其可以选自Tn、二-Tn、三-Tn(Tn3)、六-Tn(Tn6)或TF抗原。

在进一步的方面，B是或包含选自下列的碳水化合物残基：

。

在优选的方面，B是或包含残基(α-GalNAc-Ser/Thr)₃，最优选地(α-GalNAc)Ser-(α-GalNAc)Thr-(α-GalNAc)Thr。

在另一个优选的实施方案中，式(I)缀合物是MAG-Tn3。

步骤i)

根据本发明的方法包含步骤i)将保护的碳水化合物B细胞表位(B_Pr)(其碳水化合物残基(b)的羟基用保护基团(Pr)保护)与化合物M(T)_n偶联，从而形成碳水化合物T细胞表位缀合物M(T- B_Pr)_n，

所述保护基团(Pr)选自烯丙基、对甲氧基苄基(PMB)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、苄氧基甲基(BOM)、乙酰丙酰基(levulinyl，Lev)、苯甲酰基(Bz)、2,5-二氟苯甲酰基、氯乙酰基、苄基(Bn)或乙酰基(Ac)，

或所述保护基团(Pr)和与其结合的两个羟基形成C₅-C₆异亚丙基缩酮或C₅-C₆环烷基碳酸酯。

在优选的方面，Pr是苄基(Bn)或乙酰基(Ac)。

在具体的方面，步骤i)包含步骤：

a）将第一个保护的碳水化合物残基(b_Pr)(其羟基用保护基团(Pr)、特别地选自苄基(Bn)或乙酰基(Ac)的保护基团(Pr)保护)与化合物M(T)_n偶联，从而形成碳水化合物T细胞表位缀合物M(T- b_Pr)_n；并且任选地

b）进一步保护的碳水化合物残基(b_pr)重复步骤a)，直到获得式(II)M(T-B_Pr)_n 的保护的碳水化合物缀合物。

有利地，已经证明这些保护基团Pr能够控制步骤i)中的每个碳水化合物残基b或B细胞表位B与M(T)_n的偶联。并且，已经显示去除这些保护基团允许获得所希望的产物，具有改善的得率和纯度间的折衷。

根据常规方法，碳水化合物残基的羟基可以被上述保护基团(Pr)，特别地被苄基或乙酰基保护。

保护的B细胞表位B_Pr或碳水化合物残基(b_Pr)可以商购获得或可以从商购获得的起始材料和/或根据常规方法制备。

在优选的方面，树枝状聚赖氨酸核心M和从而后来的M(T)_n构件固定化在固体支持物上，从而能够重复固相肽合成。

作为固体支持物的实例，可以提及用对苄氧基苄基醇官能化的聚苯乙烯树脂(Wang树脂)，其上的Fmoc-β-Ala-基团可以然后进行接枝或是以商品名Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trt出售的那些。M核心可以特别地通过β-Ala-OH残基进行结合。树脂取代比例，即树脂通过 Fmoc-β-Ala-基团接枝的比例可以范围为0.2到0.05mmol/g，优选地0.10到0.13mmol/g。

在具体的方面，b_Pr是保护的O-糖基氨基酸或肽。保护的O-糖基肽可以通过连续引入保护的组成型O-糖基氨基酸残基b_Pr来偶联到M(T)_n构件上。

在此情况下，固相肽和糖肽合成可以使用标准Fmoc化学方案[5]和[6]进行。N-α-Fmoc氨基酸和糖基化的氨基酸或肽逐步掺入到肽链中。

因此，步骤i)可以通过使第一个保护的N-α-Fmoc O-糖基氨基酸b_Pr与M(T)_n构件反应进行。更具体地，第一个O-糖基氨基酸b_Pr的羧基(COOH)与每个T分支的NH₂末端反应，从而形成肽共价键(-C(=O)NH-)。

例如在存在DMF或NMP中20%哌啶的情况下切割Fmoc。然后第二个保护的N-α-Fmoc O-糖基氨基酸b_Pr可以类似地与第一个保护的氨基酸残基的NH₂基团反应，依次类推。

因此，当B细胞表位包含几个碳水化合物残基(b)时，根据本发明的方法的步骤i)可以包含重复根据步骤a)的偶联的步骤直至获得碳水化合物T细胞表位缀合物M(T-B_Pr)_n。

在存在偶联试剂例如HATU和DIPEA或DIC/HOBt和PyBOP的情况下，这些肽偶联可以在极性质子惰性溶剂例如DMF或NMP中进行。

步骤ii)

在具体的方面，Pr是苄基。在此情况下，去保护步骤ii)可以在存在TfOH的情况下或通过催化加氢进行。

在具体的方面，步骤ii)是催化加氢。

在优选的方面，催化加氢是在存在作为催化剂的Pd/C、特别地10%Pd/C(%w/w)的情况下进行。式(II)缀合物/催化剂的重量比可以从10/2到10/10变化，并且是优选约10/8。催化剂可以经过长时期分批加入。

催化加氢优选地在作为溶剂的NMP/H₂O中进行，特别地体积比为87.5/12.5。

催化加氢反应优选地在温度范围从20到40℃，尤其在约37℃进行。

催化加氢反应优选地在压力范围从1到10巴，更优选地在约5巴进行。

在另一方面，步骤ii)在存在TfOH的情况下进行。

优选地，式(II)缀合物在存在TFA、DMS和间甲酚的情况下与TfOH反应。TfOH/TFA/DMF/间甲酚的相对比例可以是1/5/3/1 v/v/v/v。

在另一方面，保护基团Pr是乙酰基。

步骤ii)中乙酰基保护基团的去保护优选地在存在肼的情况下、在质子极性溶剂(例如醇例如甲醇)中进行。此反应可以在室温下进行，即15和25℃之间。

肼相对式(II)化合物的摩尔比可以从100到1500摩尔当量变化。

乙酰基的去保护可以可选地在存在MeONa的情况下，特别地在作为溶剂的MeOH中，在室温，即15和25℃之间进行。

在具体的方面，当固定化在固体支持物中时，在i)结束时获得的式(II)缀合物在进行去保护步骤ii)之前从固体支持物上初步切割。该切割可以在存在水中TFA和TIS的情况下进行，例如具有下列体积比95/2.5/2.5 v/v/v。

步骤iii)

根据本发明的方法可以进一步包含步骤ii)后续步骤iii)，其包括一个或多个纯化步骤，特别地通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)。

步骤iv)

根据本发明的方法可以进一步包含回收产物的后续步骤iv)。

M(T)_n合成

在具体的方面，根据本发明的方法进一步包含制备缀合物M(T)_n的步骤。

在具体实施方案中，从树枝状聚赖氨酸核心开始并通过逐步引入N-保护的组成肽T细胞表位的氨基酸残基制备缀合物M(T)_n。N-保护的氨基酸残基特别地是Fmoc氨基酸残基。

氨基酸偶联可以在极性质子惰性溶剂例如DMF中，在存在一种或多种肽偶联试剂例如DIC、HOBt、PyBOP、HATU或DIPEA的情况下进行。组合(DIC/HOBt和PyBOP)或可选地(HATU/DIPEA)是具体优选的。可选的偶联试剂还公开在E. Valeur; M. Bradley, Chem Soc Rev (2009) 38, 606 ; A. El-Faham等 Chem Eur J (2009) 15, 9404或R. Subiros-Funosas等 Org Biomol Chem (2010) 8, 3665中。

每个肽偶联后，去除N-氨基酸保护基团。作为实例，Fmoc保护基团可以在存在哌啶的情况下，在极性质子惰性溶剂例如DMF中去除。

至于肽片段SEQ ID n°1的合成，氨基酸残基AA^9-10和AA^15-16可以作为假-脯氨酸二肽掺入。有利地，这些二肽的掺入对产物的粗质量展示了显著的影响。

M合成

在具体的方面，根据本发明的方法进一步包含制备树枝状聚赖氨酸核心M的步骤。

树枝状聚赖氨酸核心M可以根据美国专利号US 6,676,946中公开的方法制备。

碳水化合物T细胞表位缀合物M(T-B)_n

在另一方面，本发明有利地提供根据本发明的方法可以获得的，具有纯度≥95%级别的碳水化合物T细胞表位缀合物M(T-B)_n。

该纯度级别可以通过在步骤ii)后进行纯化步骤iii)获得，特别是反相高效液相色谱(PR-HPLC)。作为实例，RP-HPLC可以用低粒度测定柱进行，特别是具有低于15μm的粒度测定，特别是约10μm或低于5μm和/或具有约300?或更小的孔径，特别是小于200?，尤其小于100?。固定相可以是基于通过十八烷基(也称为C18二氧化硅)接枝的硅胶的反相。洗脱可以用水(0.1% TFA)/乙腈，以浅梯度，例如在约20分钟的时期内从70/30到60/40进行。

式(I)缀合物的纯度级别可以通过任何常规方法特别是通过RP-HPLC确定。

纯度优选≥ 96%，特别是≥ 98%，并且有利地≥ 99%。

碳水化合物T细胞表位缀合物M(T-B_Pr)_n

在额外的方面，本发明提供式(II)的碳水化合物T细胞表位缀合物：

其中

- M是树枝状聚赖氨酸核心；

- T是T细胞表位，优选包含肽残基；

- B_Pr是保护的碳水化合物B细胞表位,包含至少一个碳水化合物残基(b)，其羟基被Pr基团保护，

所述Pr基团选自烯丙基、对甲氧基苄基(PMB)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、苄氧基甲基(BOM)、乙酰丙酰基(levulinyl，Lev)、苯甲酰基(Bz)、2,5-二氟苯甲酰基、氯乙酰基、苄基(Bn)或乙酰基(Ac)，

或所述Pr基团和与其结合的两个羟基形成C₅-C₆异亚丙基缩酮或C₅-C₆环烷基碳酸酯；

和

- n是整数并表示共价键合到M的-T-B基团的数目。

在具体的方面，B_Pr是保护的(α-GalNAc-Ser/Thr)3。

在额外的方面，Pr是苄基或乙酰基。

在进一步的方面，M是 HO-βAla-K(K)₂。

在另一方面，T是 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID N°1)。

在另一方面，本发明提供碳水化合物肽缀合物M(T-B_Pr)_n用于制备如上面所定义的碳水化合物肽缀合物M(T-B)_n，M(T-B_Pr)_n 和 M(T-B)_n的用途。

本发明的其它特征将在下列示例性实施方案的描述中变得显而易见。给出这些实施例为了阐释本发明并且不意图是限制在其中。

附图

图1：根据本发明方法的方案A的MAG-Tn3合成。相对氨基指示摩尔当量。AA^9-10 和AA^15-16 作为假-Pro二肽掺入。

图2：根据本发明方法的方案B的MAG-Tn3合成。相对氨基指示摩尔当量。AA^9-10 和AA^15-16 作为假-Pro二肽掺入。

缩写

AA                氨基酸

Ac                 乙酰基

AcOH          乙酸

Bn               苄基

Boc               叔丁氧基羰基

tBu                叔丁基

DIC               N,N’-二异丙基碳二亚胺

DIPEA         二异丙基乙胺

DIPE           二异丙基醚

DMAP         4-二甲基氨基吡啶

DMF            二甲基甲酰胺

DMS            二甲基硫醚

DVB            二乙烯基苯

EtOH            乙醇

FA                 甲酸

Fmoc            9-芴基甲氧基羰基

HATU           2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯

HOBt           N-羟基苯并三唑

HPLC/MS    高效液相色谱/质谱分析

MAG            多抗原性糖肽

MeOH          甲醇

MeONa        甲醇钠

ESMS          电喷雾质谱

MW             分子量

NMP            N-甲基吡咯烷酮

NMR            核磁共振

PyBOP          苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-膦六氟磷酸盐

RP-HPLC      反相高效液相色谱

RT                  室温

SELDI-TOF MS         表面增强激光解吸/电离-飞行时间质谱

TBS              叔丁基二甲基甲硅烷基

TFA              三氟乙酸

TfOH            三氟甲磺酸

THF              四氢呋喃

TIS               三异丙基硅烷

TMSBr         三甲基甲硅烷基溴

Trt                三苯甲基。

实施例：

实施例1：经由方案A和B制备MAG-Tn3

一般方法

6的合成在固相上使用Fmoc化学逐步进行。所使用的氨基酸侧链保护基团是Gln和Asn上的Trt，Lys⁷和Lys¹¹上的Boc，Tyr 、Ser和Thr上的tBu，，Glu上的OtBu。对于Lys¹⁹和Lys²⁰，保护基团是Fmoc。

通过氮分析或在化合物用6N HCl在110℃水解20小时后使用Beckman6300分析仪定量氨基酸分析确定净肽含量。

在偶联UV检测器2487(220nm)和具有电喷雾电离化(阳性模式)源(Waters)的Q-Tofmicro^TM分光计(Micromass)的Alliance2695系统上进行HPLC/MS分析。样品在自动进样器上冷却到4℃。使用乙腈+0.025%FA(A)/水+0.04%TFA+0.05%FA(B)经过20分钟进行线性梯度。柱子是Zorbax 300SB C18 (3.5μ, 3x150 mm) (Agilent) (梯度13-53% A)或XBridge^TM BEH130 C18 (3.5μ, 2.1x150 mm) (Waters) (梯度15-40% A)。电离化源的温度保持在120℃并且去溶剂化温度在400℃。进样锥电压是40V。

通过在同样的质谱仪中直接进样在阳性模式记录ESMS分析。样品以~5μM浓度溶解于含0.1%甲酸的水/乙腈(1/1)。

在PCS 4000质谱仪(Bio-Rad Labs)上进行 SELDI-TOF分析。用1μL CH₃CN活化H4蛋白芯片阵列表面。点与反应混合物(2.5μL，1mg/mL)在盒中RT孵育20分钟。然后用反应缓冲液(3x1min)和水(3x1min)清洗它们。在每个点上施加基质(2x0.6μL在50％CH₃CN/0.5％TFA中饱和的芥子酸)，并允许空气干燥。用设置~3μJ的激光从每个阵列点产生谱。设备用牛泛素、牛细胞色素C、β-乳球蛋白和如上面所述的基质和设置外部校正。

使用具有在220nm的UV检测器的Agilent1200泵系统通过RP-HPLC分析6的纯度。柱子是Zorbax 300SB C18 (3.5μ, 3x150 mm) (Agilent)并且使用乙腈+0.1%TFA(A)/水+0.1%TFA(B)经过40分钟，从13到53%A(0.8mL/min，保留时间20.5min)进行梯度。

相对氨基指示所有试剂的摩尔当量。基于起始Fmoc-β-Ala-树脂1取代计算保护的中间体4和5的摩尔量。总体得率(表)包括来自1的所有合成步骤。根据来自Fmoc-β-Ala-树脂1取代的最终产物6的净肽含量计算它们。

方案A(图1)

Fmoc-β-Ala-树脂(低-取代的树脂) 1

2g对苄氧基苄基醇树脂(Wang树脂，0.91mmol/g,100-200目，聚合物基质：共聚(苯乙烯-1％DVB)，Novabiochem)在干燥的圆底烧瓶中在DMF(Applied Biosystems)中溶胀1小时。311mg (1mmol)干燥的Fmoc-β-Ala-OH (Novabiochem, Merck Chemicals Ltd)溶解于8mL无水CH₂Cl₂ (Acros)。加入4滴DMF以完成溶解。加入77μL (0.5mmol)DIC(Fluka)后，反应混合物在氩气中室温下搅拌20分钟。蒸发反应混合物到干燥并且旋转蒸发仪在氩气下打开。残留物溶解于最小体积的DMF(6mL)中并且溶液加到树脂上。加入溶解于0.5mL DMF的6mg(0.05mmol)DMAP(Acros)，悬液在室温温和搅拌2小时。

通过树脂样品的UV分析根据下列程序测量树脂取代率。2到6mg树脂用巴斯德吸管转移到小的烧结的玻璃漏斗中。树脂用DMF，CH₂Cl₂ (Carlo Erba)清洗并干燥。树脂转移到UV池中，精确称量并然后加入2.8mL溶于DMF的20%哌啶(Aldrich)。悬液在巴斯德吸管的帮助下搅动2分钟。读取在300.5nm(ε= 7800)的吸收，参比池含溶于DMF的20%哌啶。发现负载的程度是0.1mmol/g。

树脂用DMF清洗3次。残留的羟基使用下列方案加帽。树脂重悬在13mLDMF中。加入溶于1mL DMF的1.55mL (16.4mmol)Ac₂O (Sigma)，并且然后是溶于1mL DMF的660mg (5.41mmol) DMAP。在室温下温和搅拌30分钟后，悬液在烧结玻璃漏斗中过滤，随后用DMF清洗3次，CH₂Cl₂三次，并且然后在干燥器中干燥过夜。树脂1保存在4℃。

[QYIKANSKFIGITEL]₄-K₂-K-β-Ala-树脂(保护的肽)2

从250mg(25μmol)Fmoc-β-Ala-树脂 1在Applied Biosystems肽合成仪433A上使用Fmoc化学合成四价肽。按照应用的标准合成方案，除了在每个偶联步骤后额外的清洗步骤。简而言之，用22%的溶于NMP中的哌啶(Applied Biosystems)去除Fmoc基团，并且通过电导监测去保护。通过依次偶联两级Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(Applied Biosystems)(第一个循环：40eq，第二个循环：20eq)构建赖氨酸核心，使用HATU(Applied Biosystems)(第一个循环：40eq，第二个循环：20eq)/ DIPEA(Applied Biosystems)(第一个循环：80eq，第二个循环：40eq)作为偶联试剂和NMP作为溶剂(注意：使用此非常大过量试剂对于反应效率应该是没有必要的，并且仅是由于预装柱装填了1mmol氨基酸的事实)。使用溶于NMP的HATU(10eq/胺)/DIPEA (20eq/胺)进行后续的携带标准的侧链保护基团的Fmoc保护的氨基酸(Applied Biosystems，10eq/胺)的逐步引入。15-16位和9-10位的AA分别以Fmoc-Ile-Thr(Ψ^Me,Mepro)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-Ser(Ψ^Me,Mepro)-OH (10eq/胺) (Novabiochem, Merck Chemicals Ltd)用HATU(10eq/胺)和DIPEA (20eq/胺)掺入。

从2(25μmol)开始，糖基化的构件手工掺入：Fmoc-T(α-D-GalNAc(OBn)₃)-OH (Ficher Chemicals AG) (第1个循环), Fmoc-T(α-D-GalNAc(OBn)₃)-OH (第2个循环) 和Fmoc-S(α-D-GalNAc(OBn)₃)-OH (Ficher Chemicals AG) (第3个循环)。简而言之，干燥构件(0.3mmol, 3eq/游离氨基)溶于最小量的DMF(~2 mL)中。加入在0.5mL DMF中的55mg (0.145mmol)HATU (Novabiochem)溶液并且将所获得的混合物加到树脂。加入52μL (0.3mmol)DIPEA (Aldrich)后，机械搅动悬液。三个偶联步骤通过Kaiser检验[1]监测，并且分别在1小时，1小时和1小时内完成。每个偶联步骤后，树脂用DMF清洗(4次)。通过用DMF中的20%哌啶处理树脂进行所有的Fmoc切割。每次去保护后，树脂依次用DMF (6次), CH₂Cl₂ (6次)，和DMF(6次)清洗。合成结束时，树脂用DMF和CH₂Cl₂充分清洗并在干燥器中干燥。在4℃向树脂加入10mL TFA (Applied Biosystems) /水/ TIS (Acros) (95/2.5/2.5 v/v/v)并且混合物在室温搅拌1小时30分钟。树脂过滤后，浓缩溶液并且粗产物用二乙醚沉淀。离心后，沉淀溶于水并且冻干以获得229mg粗糖肽5。

从5，

- 用TfOH [2-4]

200mg(0.014mmol)5在RT溶于2.96mL TFA，1.78mL DMS (Sigma-Aldrich)和587μL间甲酚(Sigma-Aldrich)。溶液冷却到-10℃并且加入587μL TfOH(Fluka)，并且混合物在-10℃搅拌1小时15分钟(TfOH/TFA/DMS/间甲酚 1/5/3/1 v/v/v/v)。产物用二乙醚沉淀并且，离心后，沉淀溶于水并冻干以获得372mg粗糖肽。产物溶于7.7mL的0.05M 乙酸铵缓冲液并且pH用1M氨水调节到7。在室温下1小时后，溶液冻干以获得412mg粗产物。使用具有在230nm的UV检测器的Agilent1200泵系统通过RP-HPLC纯化产物。柱子是Zorbax C18 (5 μ, 300?, 9.4 x 250 mm) (Agilent)并且用水(0.1% TFA)/乙腈经过20分钟从73/27到60/40进行梯度。纯化得到3.9mg(净肽含量)的95.90%纯度的6。总体得率是1.6%。

方案B(图2)

[QYIKANSKFIGITEL]₄-K₂-K-β-Ala-树脂  (保护的肽)  2

直至Tyr⁵掺入，从36.9g(4.8mmol)Fmoc-β-Ala-Tentagel R Trt树脂1 (0.13mmol/g) (Rapp Polymere)在装备Schmizo反应器的人工肽合成仪上合成四价肽。在延长过程之前，树脂在DMF中溶胀2到3小时并且用240mL DMF清洗(3次，2min/循环)。每次偶联之后，用240mL DMF中20%哌啶去除Fmoc基团(3步，每个20分钟)。在Glu¹⁷、Asn⁹和Gln⁴的情况，向去保护溶液中加入2% HOBt。每次去保护后，树脂依次用240mL DMF (4 次, 2min/循环), 240mL DMF中2% HOBt (两次, 5min/循环), 和240 mL DMF(两次, 2min/循环)清洗。

在DMF(111mL)中在室温下用DIC/HOBT (1.5到2eq每个/胺)进行氨基酸偶联(1.5到2eq/胺)(参见下面的细节)。15-16位和9-10位的AA分别以Fmoc-Ile-Thr(Ψ^Me,Mepro)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-Ser(Ψ^Me,Mepro)-OH掺入。30分钟后，向反应混合物中加入新鲜部分的DIC(1.5到2eq)。偶联步骤通过Kaiser检验监测 [1]。从 Leu¹⁸到Ser¹,与DIC/HOBT(等量)偶联1小时后，加入PyBOP试剂(参见下面细节)并且pH通过逐滴加入DIPEA调节到7。30分钟后，树脂用240mL DMF(5次，2分钟/循环)清洗并且从Leu¹⁸到Thr²进行乙酰化步骤。乙酰化在室温下用乙酸酐(1eq/胺)在存在111mL DMF中吡啶(1eq/胺)的情况下进行。20分钟后，用240mL DMF清洗树脂(6次, 2min/循环)。掺入Tyr⁵后，树脂用240mL DMF(8次, 2min/循环)和240mL CH₂Cl₂(8次, 2min/循环)充分清洗，然后干燥。

掺入Tyr⁵后，在0.15mmol规模或4.65mmol规模使用同样的方案继续组装，并且分别为4和5提供肽-树脂2。

如先前对2所述，从2(0.15mmol)进行合成。使用下列AA构件 [5] 和试剂进行偶联步骤。

合成结束时，糖肽-树脂(0.15mmol)悬浮于TFA/TIS/H₂O(95/2.5/2.5 v/v/v)(10mL/g糖肽-树脂)并在20℃±2℃搅拌1小时。过滤后，树脂用同样的TFA混合物清洗两次(每次清洗2mL/g糖肽-树脂)。收集滤液和清洗液并在20℃±2℃继续搅拌30分钟。浓缩后(浴温度 ≤ 35℃)，粗产物用DIPE沉淀(~35mL/g糖肽-树脂)。过滤和用DIPE清洗后，干燥固体(t°≤30℃)并得到750mg粗品4。

如先前对2所述，从2(4.65mmol)进行合成。使用下列AA构件(Ficher Chemicals AG)和试剂进行偶联步骤。在合成结束时，获得84.87g糖肽-树脂。

如先前对4所述处理糖肽-树脂(20g, 1.096mmol)并提供9.95g粗品5。

注：此方案得到与根据方案A(即从Fmoc-β-Ala-对苄氧基苄基醇树脂(Wang树脂)开始(参见上面))获得的相当的粗化合物。

从4

- 用肼 [7]

100mg (20μmol)4溶于3.2mL MeOH。加入567μL (11.3mmol)肼单水合物并且溶液在室温下搅拌。2小时30分钟后，溶液冷却到0℃并且加入3.2mL丙酮。1小时后，浓缩溶液并且用丙酮共蒸馏5次。冻干粗糖肽以获得117mg。使用具有在230nm的UV检测器的Agilent1200泵系统通过RP-HPLC纯化产物。柱子是Zorbax C18 (5 μ, 300?, 9.4 x 250 mm) (Agilent)并且用水(0.1% TFA)/乙腈经过20分钟从72/28到62/38进行梯度。纯化得到5.8mg(净肽含量)的96.4%纯度的6。总体得率是2.7%。

- 用MeONa

24mg (4.8μmol)4溶于3.2mL MeOH。用MeOH中1% MeONa调节pH到14(pH计，潮湿pH试纸~10.5)并且溶液在RT搅拌。通过RP-HPLC监测反应。2小时后，反应用干冰中和并蒸发到干燥。粗肽溶于1%TFA水溶液并冻干。使用具有在230nm的UV检测器的Agilent1200泵系统通过RP-HPLC纯化产物。柱子是Kromasil C4 (5 μ, 100?, 10x250 mm) (AIT) 并且用0.1%TFA水溶液(VWR)/乙腈(Carlo Erba)经过30分钟从73/27到62/38进行梯度。纯化得到754μg(净肽含量)的91.4%纯度的6。总体得率是1.4%。

从5，

- 用 H₂

10g (1.1mmol) 5溶于800mL NMP/H₂O 87.5/12.5。加入4g 10% 39型Pd/C(Johnson Matthey)后，反应在37℃和5巴搅拌170小时。72小时(2g)和120小时(2g)后分部分加入两次额外量的催化剂。反应结束时，在硅藻土上过滤催化剂并且用NMP/H₂O 87.5/12.5清洗。收集所获得的滤液与其它源自类似反应的滤液(总共1.35mmol)。用H₂O稀释后(直至 NMP/H₂O 10/90)，在两个步骤中通过RP-HPLC纯化滤液。在Vydac C18柱(300?, 10-15μm, 50mL/mn)上用TFA/H₂O/CH₃CN 0.1/94.9/5.0 v/v/v (A) 和用TFA/H₂O/CH₃CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v (B)进行初步纯化。梯度是0%B经过15分钟，0-40%B经过5分钟，40-80%B经过60分钟。在Vydac C18柱(300?, 10-15μm, 50mL/mn)上用AcOH/H₂O/CH₃CN 0.5/94.5/5.0 v/v/v (A) 和用AcOH/H₂O/CH₃CN 0.5/49.5/50.0 v/v/v (B)进行第二次纯化。梯度是0%B经过15分钟，0-20%B经过5分钟，20-60%B经过60分钟。在Daisogel SP-300-10-ODS-AP柱上通过RP-HPLC浓缩(20mL/mn，等度TFA/H₂O/CH₃CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v)后，溶液在旋转蒸发仪上蒸发并冻干以提供225mg(净肽含量)纯度95.3%的6。总体得率是1.5%。

结论

所获得的结果总结于下表中：

¹ 参考文献5和9，（参考文献11，WO 9843677，Multiple antigen glycopeptide carbohydrate, vaccine comprising the same and use thereof)

² 根据从Fmoc-βAla-树脂取代（包括所有从1的合成步骤）的净肽含量计算。  

³ 如RP-HPLC所确定：柱子Zorbax 300SB C18 (3.5μ, 3x150 mm) (Agilent), 0.8 mL/min, A: 乙腈+0.1% TFA, B: 水+0.1% TFA，梯度经过40分钟13%到53%A，在220 nm检测。  

⁴ 指最终产物(净肽含量)。

相比使用未保护的碳水化合物合成子的初始合成(图1和2)，新方法(涉及保护的碳水化合物，II，图1和2)允许：

- 使合成副产物最小化

- 改善方法重现性

- 以可重复的方式放大合成规模。

在新方法中所测试的方案中(表，图1和2)，三个作为最佳策略出现：Ac/肼，Bn/TfOH和Bn/H₂ (保护基团/去保护方法) (表)。它们均以可重复的方式导致具有纯度≥95%的MAG-Tn3。

Bn/TfOH法提供具有总体得率1.6%的MAG-Tn3。此方法依赖于完全去保护和降解之间的折衷。可选地，Bn/H₂法提供具有类似得率(1.5%)的MAG-Tn3并且，最重要的是，该方法已经在225mg规模上经过验证。最后，Ac/肼法获得最高的总体得率(2.7%，相比1.6%和1.5%)。

基于另一个肽(PV=KLFAVWKITYKDT) (SEQ ID N°4)的MAG-Tn3也已经根据本发明的方法(Ac/肼，Bn/TfOH)进行制备。

实施例2：树脂取代率和用于MAG-Tn3纯化的固定相性质的影响

根据方案B从用Fmoc-β-Ala(以商品名Fmoc-β-Ala-TentaGel R Trt出售)官能化的聚苯乙烯树脂制备MAG-Tn3，具有两个不同的取代率：0.13或0.1 mmol/g(即相对未接枝树脂重量的Fmoc-β-Ala接枝基团的数目)。

然后在基于被十八烷基接枝的硅胶的三个不同的固定相(反相)(即Vydac?、Jupiter?和Daisogel?)上通过RP-HPLC进行粗MAG-Tn3的纯化。用TFA/H₂O/CH₃CN 0.1/94.9/5.0 v/v/v (A)和用TFA/H₂O/CH₃CN 0.1/49.9/50.0 v/v/v (B)进行初步纯化。梯度是0%B经过15分钟，0-40%B经过5分钟，40-80%B经过60分钟。用AcOH/H₂O/CH₃CN 0.5/94.5/5.0 v/v/v (A) 和用AcOH/H₂O/CH₃CN 0.5/49.5/50.0 v/v/v (B)进行第二次纯化。梯度是0%B经过15分钟，0-20%B经过5分钟，20-60%B经过60分钟。

结果报告于下表中。  

^a 粉末重量

^b 通过RP-HPLC分析：Zorbax 300SB C18 (3.5μ, 3x150 mm, Agilent), A: 乙腈+0.1% TFA, B:H₂O+0.1% TFA, 15-53% A (40 min)。  

^c 得率包括所有从Fmoc-β-Ala-树脂的合成步骤并且根据最终产物的净肽含量计算。

这些结果表明，根据本发明的缀合物的制备方法的得率，和所获得的缀合物的纯度两者可以通过减少树脂的取代率和/或通过使用适当的固定相来高度提高。

制备多抗原糖肽碳水化合物缀合物的方法专利购买费用说明

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