专利摘要

本发明公开了一种纳米金的制备方法、纳米金及应用。所述制备方法，包括以下步骤：(1)提供耐辐射奇球菌素溶液；(2)提供包含Au3+的溶液；(3)将步骤(1)和(2)中溶液混合反应；(4)反应完成后收集、纯化产物获得所述纳米金。本发明制备纳米金的方法具有简便可控、高效节能、环境友好的优势，合成出的纳米金水溶性好、纯度高、均一性好、大小适中(29.83±4.18nm)、稳定性高、抗氧化能力强、有抑癌作用，可以应用在抗氧化或抑癌方面。

权利要求

1.一种纳米金的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提供耐辐射奇球菌素溶液；

（2）提供包含Au3+的溶液；

（3）将步骤（1）和（2）中溶液混合反应；

（4）反应完成后收集、纯化产物获得所述纳米金，

步骤（3）反应体系中，耐辐射奇球菌素的初始浓度为0.15mg/mL~0.45mg/mL，Au3+的初始浓度为1 mM ~3 mM，

所述耐辐射奇球菌素溶液的制备方法，包括以下步骤：

（a）细菌培养；

（b）菌体收集；

（c）分离纯化获得耐辐射奇球菌素；

（d）将耐辐射奇球菌素配置成耐辐射奇球菌素溶液，

其中，所述细菌为耐辐射奇球菌，保藏号为ATCC13939，

步骤（3）中反应时间不小于2h，反应温度为25℃~50℃，反应pH为2.5~8.5，

包含Au3+的溶液中溶质为HAuCl4、KAuCl4中的一种或混合，

耐辐射奇球菌素溶液的溶剂为乙醇与水的混合物，乙醇与水的体积比为1∶1~9，

步骤（c）中分离纯化方法包括：使用丙酮/醇溶剂萃取收集上层有机相，上层有机相再经氯仿/水溶剂萃取收集下层有机相，下层有机相经液相色谱纯化后，使用氮气吹除溶剂获得耐辐射奇球菌素，

所述丙酮/醇溶剂中的醇为甲醇或乙醇，丙酮与醇的体积比为2~4∶1，氯仿/水溶剂中氯仿与水的体积比为1~4∶2。

2.如权利要求1所述的制备方法制备的纳米金。

3.如权利要求2所述的纳米金在制备抗氧化或抑癌的药物中的应用，其中，癌症种类为肾癌或乳腺癌。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种纳米金的制备方法、纳米金及应用。

背景技术

类胡萝卜素，即为C40的碳氢化合物及其含氧衍生物两大类色素，普遍存在于光合细菌、藻类、植物和部分非光合细菌中。羟基化类胡萝卜素包括虾青素(astaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)、叶黄素(1utein)等含氧类胡萝卜素，具有较强的抗氧化、清除自由基、增强免疫、预防肿瘤等功能。然而，具有较强的亲脂性的类胡萝卜素，易溶于氯仿、丙酮、苯或二硫化碳等有机溶剂，几乎不溶于水。很大程度上限制了这些类胡萝卜素的广泛应用。研究发现，与纳米金属颗粒结合后的色素，水溶性更好，特性更加显著，应用更加广泛。

纳米金(gold nanoparticles，AuNPs)，即任一维度直径为1～100nm的金的微小颗粒，具有较大的比表面积、高电子密度、介电特性和催化作用等，能与多种生物分子结合，增强生物活性，因此在生物医学、催化、生物传感以及光学等领域有着广泛的应用。通过还原氯金酸(HAuCl4·3H2O)可以制备不同粒径的纳米金，其颜色根据直径的大小而呈现微红至深紫色。

生物合成纳米金的方法，绿色环保、不需要外加化学还原剂和保护剂、避免了理化合成方法中的污染和毒性，而且反应条件温和，能耗低，经济高效。因此，发展安全、经济、稳定、高效的生物方法制备纳米金具有很大的研究价值。

发明内容

本发明提供了一种纳米金的制备方法，本发明研究发现来源于耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的有着强大的抗氧化能力的羟基化类胡萝卜素——耐辐射奇球菌素可以绿色高效制备纳米金，合成的纳米金稳定可控、水溶性好，抗氧化能力增强，抑癌作用明显。

耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)是一种外观呈红色的非致病极端微生物，体内因富含大量的耐辐射奇球菌素等多种抗氧化物质，组成体内强大的抗氧化系统，能够耐受多种极端环境如电离辐射、氧化压力、UV和干燥等。耐辐射奇球菌素的化学结构如式(Ⅰ)所示，为一种羟基化类胡萝卜素。

一种纳米金的制备方法，包括以下步骤：

(1)提供耐辐射奇球菌素溶液；

(2)提供包含Au3+的溶液；

(3)将步骤(1)和(2)中溶液混合反应；

(4)反应完成后收集、纯化产物获得所述纳米金。

步骤(3)反应体系中，耐辐射奇球菌素的初始浓度为0.15mg/mL～0.45mg/mL，Au3+的初始浓度为1mM～3mM。耐辐射奇球菌素的使用量以及Au3+的使用量并没有严格的限制，只要溶液中有这两种物质的存在，能够发生反应即可生产纳米金。上述浓度范围则提供了一种较为优选的使用量，在该范围内，纳米金的生成率等都较好。

步骤(3)中反应时间不小于2h，反应温度为25℃～50℃，反应pH为2.5～8.5。

所述的制备方法，包含Au3+的溶液中溶质为HAuCl4、KAuCl4中的一种或混合。Au3+的来源可以是常用于制备纳米金的氯金酸或氯金酸盐，其中氯金酸盐中钾盐使用较多。

所述耐辐射奇球菌素溶液的制备方法，包括以下步骤：

(a)细菌培养；

(b)菌体收集；

(c)分离纯化获得耐辐射奇球菌素；

(d)将耐辐射奇球菌素配置成耐辐射奇球菌素溶液，

其中，所述细菌为耐辐射奇球菌，保藏号为ATCC13939。菌株来源于美国模式菌种保藏中心(ATCC)。

耐辐射奇球菌素溶液的溶剂为乙醇与水的混合物，乙醇与水的体积比为1∶1～9。

步骤(c)中分离纯化方法包括：使用丙酮/醇溶剂萃取收集上层有机相，上层有机相再经氯仿/水溶剂萃取收集下层有机相，下层有机相经液相色谱纯化后，使用氮气吹除溶剂获得耐辐射奇球菌素。

所述丙酮/醇溶剂中的醇为甲醇或乙醇，丙酮与醇的体积比为2～4∶1，氯仿/水溶剂中氯仿与水的体积比为1～4∶2。提取时，先使用丙酮/甲醇溶剂萃取效率会比使用丙酮/乙醇溶剂萃取效率更高一些。

本发明又提供了所述的制备方法制备的纳米金。本发明制备的纳米金为一种基于羟基化类胡萝卜素制备的纳米金，使用本发明方法制备的纳米金，通过UV/Vis波长扫描，特征吸收峰在539nm附近；通过EDS能谱、DLS动态光散射分析，在2.12keV位置也有明显的特征峰，纳米金表面含有耐辐射奇球菌素。

本发明还提供了所述的纳米金在制备抗氧化或抑癌的药物中的应用。

本发明制备方法通过将耐辐射奇球菌发酵、溶剂萃取、半制备液相色谱纯化，可以有效获得耐辐射奇球菌素。利用耐辐射奇球菌素制备纳米金的方法具有绿色高效、来源广泛、经济便捷的优势，避免使用毒性稳定剂或分散剂，克服了理化合成方法的缺点，提高了耐辐射奇球菌素的利用率。利用耐辐射奇球菌素合成的纳米金的抗氧化能力要强于等量的耐辐射奇球菌素，而且浓度越高、时间越长(一定范围内)，抗氧化效应越明显，说明两者之间具有协同作用。

本发明制备纳米金的方法具有简便可控、高效节能、环境友好的优势，合成出的纳米金水溶性好、纯度高、均一性好、大小适中(29.83±4.18nm)、稳定性高、抗氧化能力强、有抑癌作用，可以应用在抗氧化或抑癌方面。

附图说明

图1为实施例1制备的纳米金合成剂的鉴定图，其中图A为液相色谱图，图B为吸收光谱检测结果图。

图2为本发明合成纳米金的外观鉴定图，其中图A为纳米金合成剂；图B为纳米金溶胶；图C为作为对照用的溶剂与金离子的混合液。

图3为纳米金制备反应后UV/Vis波长扫描结果图，其中Au(Ⅲ)表示三价的金离子。

图4为纳米金透射电镜检测结果图。

图5为纳米金扫描电镜-能谱分析结果图，其中图A为扫描电镜结果图；图B为图A中各元素的鉴定图。

图6为纳米金的X射线衍射分析结果图。

图7为纳米金的动态光散射分析结果图。

图8为在不同理化因素下制备的纳米金的对比图，其中图A反映了反应时间的影响；图B反映了耐辐射奇球菌素浓度的影响；图C反映了反应温度的影响；图D反映了反应pH的影响。

图9为纳米金抗氧化能力比较图，其中DX代指耐辐射奇球菌素、DX-AuNPs为本发明制备的纳米金，2×DX-AuNPs为2倍浓度的纳米金。

具体实施方式

菌株：耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)，购买自美国模式菌种保藏中心(ATCC)，保藏号为ATCC13939。

TGY培养基：5g蛋白胨、3g酵母粉和1g葡萄糖溶于1L水中，后于高压灭菌锅中121℃灭菌20min。

实施例1

细菌培养及纳米金合成剂制备。

(1)细菌培养：将耐辐射奇球菌涂板活化培养，挑取单菌落接种于5mL TGY培养基中，用摇床在32℃的条件过夜培养，摇床转速为220rpm；然后按1∶100的比例转接到1L培养瓶(内含500mL TGY培养基)，于32℃、220rpm的条件下培养24h至细菌的稳定期(OD600nm＝1.0)。

(2)收集、洗涤菌体：细菌培养至稳定期后，在8000g，10min的条件下离心收集，得到新鲜菌体。通过pH为7.2的0.01M的磷酸缓冲液将其重悬浮，充分震荡，再8000g，10min离心，收集菌体。

(3)制备纳米金合成剂：将收集的菌体用预冷的丙酮/甲醇溶剂(2/1，v/v)在室温避光的条件下振荡30min，离心(8000g，8min)取上清，重复抽提至菌体无色。提取液加入等体积的氯仿和水(1/2，v/v)，再次萃取，收集下层有机相，减压蒸馏浓缩，经半制备液相色谱纯化后，得到单一组分的物质(液相色谱结果如图1A所示，保留时间3.993min)，收集得到的产物外观如图2A所示，溶液颜色为浅橙色，经吸收光谱分析发现在480nm处有吸收峰(图1B)，使用氮气吹干，即得纳米金合成剂(耐辐射奇球菌素)。

实施例2

细菌培养及纳米金合成剂制备。

(1)细菌培养：将耐辐射奇球菌涂板活化培养，挑取单菌落接种于5mL TGY培养基中，用摇床在30℃的条件过夜培养，摇床转速为200rpm；然后按1∶100的比例转接到1L培养瓶(内含500mL TGY培养基)，于30℃、200rpm的条件下培养24h至细菌的稳定期(OD600nm＝1.2)。

(2)收集、洗涤菌体：细菌培养至稳定期后，在10000g，8min的条件下离心收集，得到新鲜菌体。通过pH为7.2的0.01M的磷酸缓冲液将其重悬浮，充分震荡，再10000g，8min离心，收集菌体。

(3)制备纳米金合成剂：将收集的菌体用预冷的丙酮/乙醇溶剂(4/1，v/v)在室温避光的条件下振荡30min，离心(10000g，15min)取上清，重复抽提至菌体无色。提取液加入等体积的氯仿和水(2/1，v/v)，再次萃取，收集下层有机相，减压蒸馏浓缩，经半制备液相色谱纯化后，得到单一组分的物质，溶液呈浅橙色，经吸收光谱分析发现在480nm处有吸收峰，使用氮气吹干，即得纳米金合成剂(耐辐射奇球菌素)。

实施例3

基于羟基化类胡萝卜素的纳米金制备。

(1)配制合成反应液：将1.5mg的耐辐射奇球菌素(实施例1制备)溶于10mL乙醇/水溶剂(1/9，v/v)，加入1mM Au3+溶液(氯金酸，HAuCl4·3H2O)，在室温(pH 7，25℃)条件下使其充分混合、反应。

(2)监测反应过程：随着反应的进行，溶液颜色发生变化，逐渐趋于稳定，反应2h后进行波长扫描(539nm处有峰值)。

(3)纯化纳米金溶液：用0.22μm针头式过滤器过滤上述呈红紫色的溶液，15000g，60min离心，收集沉淀，蒸馏水数次洗涤后(纳米金的水溶性较好)，用截留量8KD的透析袋透析24h以除去残存的反应物，再次收集溶液。获得溶液状态下的纳米金(图2B)，UV/Vis波长扫描(450-600nm)，发现在539nm位置附近有峰值(图3)，标志着纳米金颗粒的形成；而作为对照用的溶剂与金离子的混合液并未变紫和出现特征吸收峰(图2C，图3)。

(4)收集纳米金：将收集的溶液置于置于-80℃、6h，然后将冰冻的溶液置于冷冻干燥机中，温度为-60℃，干燥12h。将干燥物从冷冻干燥机中取出，即为纳米金颗粒。10mL的溶液共得到纳米金颗粒2.1mg。

实施例4

基于羟基化类胡萝卜素的纳米金制备。

(1)将3mg的耐辐射奇球菌素(实施例2制备)溶于10mL乙醇/水溶剂(1/4，v/v)，加入2mM Au3+溶液(氯金酸，HAuCl4·3H2O)，在室温条件下使其充分混合、反应。

(2)监测反应过程：随着反应的进行，溶液颜色发生变化，逐渐趋于稳定，反应2h后进行波长扫描(539nm处有峰值)。

(3)纯化纳米金溶液：用0.42μm针头式过滤器过滤上述呈紫色的溶液，15000g，45min离心，收集沉淀，蒸馏水数次洗涤后，用截留量14KD的透析袋透析24h以除去残存的反应物，再次收集溶液。

(4)收集纳米金：将收集的溶液置于-1℃、24h，然后将冰冻的溶液置于冷冻干燥机中，温度为-50℃，干燥36h。将干燥物从冷冻干燥机中取出，即为纳米金颗粒。10mL的溶液共得到纳米金颗粒3.9mg。

实施例5

基于羟基化类胡萝卜素的纳米金制备。

(1)将4.5mg的耐辐射奇球菌素(实施例1制备)溶于10mL乙醇/水溶剂(1/1，v/v)，加入3mM Au3+溶液(氯金酸，HAuCl4·3H2O)，在室温条件下使其充分混合、反应。

(2)监测反应过程：随着反应的进行，溶液颜色发生变化，逐渐趋于稳定，反应2h后进行波长扫描(539nm处有峰值)。

(3)纯化纳米金溶液：用0.22μm针头式过滤器过滤上述呈紫色的溶液，15000g，30min离心，收集沉淀，蒸馏水数次洗涤后，用截留量14KD的透析袋透析36h以除去残存的反应物，再次收集溶液。

(4)收集纳米金：将收集的溶液置于-20℃、12h，然后将冰冻的溶液置于冷冻干燥机中，温度为-55℃，干燥24h。将干燥物从冷冻干燥机中取出，即为纳米金颗粒。10mL的溶液共得到纳米金颗粒5.6mg。

实施例6

实施例3制备的纳米金颗粒，进行检测。

图4为TEM(透射电镜)检测结果图，箭头所指为球形的、均一性好的纳米金颗粒(下同)，经测量平均大小约为29.83±4.18nm。

图5为SEM-EDXA(扫描电镜-能谱分析)的结果，其中图5A是扫描电镜的结果图，图5B是图5A中各元素的鉴定图，在2.12keV位置有极强的纳米金特征峰的出现，表明该合成剂可以高效合成分散度高的纳米金。图5B中包含的C、O元素可能来源于耐辐射奇球菌素分子(化学结构详见式(Ⅰ)，C40H54O3)。

图6为XRD(X射线衍射)分析结果，在布拉格衍射峰的图谱中38.16°、44.36°、64.70°、77.82°及81.74°衍射角处的衍射峰分别对应于面心立方金的(111)、(200)、(220)、(311)及(222)的晶面，无杂质峰，表明该合成剂合成的纳米金为较纯的晶体结构。

图7为DLS(动态光散射)分析结果，展示了溶液状态纳米金的粒径分布以及近单分散体系，其平均大小为42.44±0.59nm，多分散指数为0.136±0.017，电动电势为-24.95±0.38mV。所测得的粒径值大于透射电镜的测量值，表明纳米金颗粒表面有耐辐射奇球菌素分子。

实施例7

表征不同条件如反应时间、耐辐射奇球菌素浓度、反应温度和pH值对纳米金合成量及粒径大小的影响。借助UV/Vis波长扫描，根据539nm位置附近峰值的有无，判断纳米金颗粒合成与否；通过峰值的高低，判断合成量的多少；通过峰值位置的变化，判断合成的纳米金颗粒的粒径变化。

使用实施例1制备的纳米金合成剂，浓度为0.15mg/mL，按实施例3中方法制备纳米金，每次改变其中一个参数。其中，纳米金合成剂的浓度与Au3+浓度对纳米金合成的影响近似等同，因此，选择改变合成剂浓度来研究其对纳米金合成的影响，具体实验设置及结果如下所示：

反应时间对合成量的影响如图8A所示，将终浓度为1mM的Au3+溶液与0.15mg/mL耐辐射奇球菌素充分混合后于室温条件下反应，利用多功能酶标仪(SpectraMax M5)进行波长扫描(450～600nm)；反应4h左右后，峰值趋于稳定，达到反应平衡。

耐辐射奇球菌素浓度对合成量及粒径大小的影响如图8B所示，将终浓度为0、0.15、0.30、0.45mg/mL的耐辐射奇球菌素与1mM的Au3+溶液均匀混合，室温反应4h后，进行波长扫描(450～600nm)；随着耐辐射奇球菌素浓度的升高(0.15～0.45mg/mL)，纳米金的合成量逐渐提高，粒径也不断加大。

温度对粒径大小及合成量的影响如图8C所示，将0.15mg/mL耐辐射奇球菌素与1mM的Au3+溶液混合后分别在25℃、30℃、37℃或50℃，pH 7的条件下反应4h后，进行波长扫描，由图可知，较高的温度有利于纳米银的合成(25～50℃)，但过高的温度会导致耐辐射奇球菌素分解等不利影响；而且温度越高合成出的纳米金粒径越大。

pH值对粒径大小、合成量的影响如图8D所示，分别用HCl或NaOH将0.15mg/mL耐辐射奇球菌素与1mM的Au3+的反应液的pH调节至2.5、4、7或8.5，室温下反应4h后，进行波长扫描。由图可知，碱性条件下有利于粒径较小的纳米金合成；合成量，碱性较多，酸性欠佳。

实施例8

对实施例3制备的纳米金颗粒的抗氧化能力进行评估，步骤如下：

a.配制反应溶液：分别配置0.2mL的0.15mg/mL耐辐射奇球菌素及其合成的纳米金，0.4mL的0.2mM DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶液，其中溶剂为乙醇/水(1/9，v/v)。

b.监测反应液的抗氧化能力：将上述的耐辐射奇球菌素、纳米金(样品)分别与DPPH(对照)混合，监测不同时间下的吸收值，根据公式“清除率(％)＝[(A对照–A样品)/A对照]×100”，估算其抗氧化能力。

c.评价纳米金的抗氧化能力：根据图9的结果可知，耐辐射奇球菌素合成的纳米金的抗氧化能力要强于等量的耐辐射奇球菌素，而且浓度越高、时间越长(一定范围内)，抗氧化效应越明显。(DX代指耐辐射奇球菌素、DX-AuNPs为本发明制备的纳米金，2×DX-AuNPs为2倍浓度的纳米金。)

实施例9

对实施例3制备的纳米金颗粒的特性进行评估，以商品化的羟基金纳米粒子溶液作为对比(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号G120408-5ml)，步骤如下：

a.配制纳米金溶液：配制浓度为500μg/mL的纳米金溶液，备用。

b.培养细胞：将ACHN细胞(人肾癌细胞)在10％FBS+DMEM+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素的培养基中及5％CO2、37℃的条件下培养，密度达到5×103cells/mL后，用细胞消化液(0.5％胰蛋白酶：EDTA＝1∶1，v/v)收集细胞备用。

c.检测纳米金的细胞毒性：向上述的细胞中添加10％的纳米金溶液，使其终浓度为50μg/mL，培养24h后，加入20％MTS孵育2h，利用多功能酶标仪(SpectraMax M5)测量OD490nm。

d.评价纳米金：耐辐射奇球菌素合成的纳米金对ACHN癌细胞有明显的抑癌特性(实施例3制备的纳米金处理后细胞存活率为38％左右，而商品化的纳米金处理的细胞存活率为77％左右)，在用作抗癌药物方面有较大的潜力。

实施例10

对实施例3制备的纳米金颗粒的特性进行评估，以商品化的羟基金纳米粒子溶液作为对比(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号G120408-5ml)，步骤如下：

a.配制纳米金溶液：配制浓度为500μg/mL的纳米金溶液，备用。

b.培养细胞：将MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)在10％FBS+DMEM+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素的培养基中及5％CO2、37℃的条件下培养，密度达到5×103cells/mL后，用细胞消化液(0.5％胰蛋白酶：EDTA＝1∶1，v/v)收集细胞备用。

c.检测纳米金的细胞毒性：向上述的细胞中添加10％的纳米金溶液，使其终浓度为50μg/mL，培养24h后，加入20％MTS孵育2h，利用多功能酶标仪(SpectraMax M5)测量OD490nm。

d.评价纳米金：耐辐射奇球菌素合成的纳米金对MCF-7癌细胞有明显的抑癌特性(实施例3制备的纳米金处理后细胞存活率为50％左右，而商品化的纳米金处理的细胞存活率为94％左右)，在用作抗癌药物方面有较大的潜力。

一种纳米金的制备方法、纳米金及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。