专利摘要

本发明提供了一种采用不同接种方式来提高红树林内生真菌Fusariumproliferatum(No.1403)产抗癌蒽醌类化合物1403C产量的方法。采用带挡板的锥形瓶培养种子进行研磨接种、带挡板的锥形瓶培养的种子直接接种、在普通锥形瓶中加入玻璃珠培养种子进行接种，发酵所得1403C产量比采用传统接种方式培养种子(对照组)进行发酵所得产量均有不同程度的提高，其中最大1403C产量为1.13g/L，比对照组产量0.29g/L提高了289.7％。本发明对于进一步进行1403C的抗癌药理药效实验具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及通过六种接种方式培养种子从而提高红树林内生真菌Fusarium proliferatum(No.1403)产蒽醌类抗癌化合物1403C产量的方法。

背景技术

红树林内生真菌(Endophytic fungi)1403#为Fusarium proliferatum.，来自中国南海红树林树叶内部，由香港城市大学Vrijmoed教授等分离得到。中山大学林永成教授带领的研究组已从其发酵液中分离出20多种化合物，包括灰黄霉素(Griseofulvin)和多种蒽醌(Anthraquinone)、萘醌(Naphthoquinone)和咕吨酮(Xanthone)类等物质，这些化合物大多具有抗肿瘤、抗菌活性。1403C是已分离化合物中的一种结构新颖的蒽醌类化合物(姜广策林永成周世宁等.中国南海红树林内生真菌No.1403次级代谢物研究[J].中山大学学报(自然科学)，2000，39(6)：68-72)，经中山大学黎孟枫教授等评定，该物质能明显抑制体外培养的多种肿瘤细胞系且毒副作用小。

在Fusarium proliferatum(No.1403)的摇瓶发酵中，采用常规的接种及发酵方式，1403C产量极低(约为1.3mg/L，见姜广策林永成周世宁等.中国南海红树林内生真菌No.1403次级代谢物研究[J].中山大学学报(自然科学)，2000，39(6)：68-72)，难以满足进一步的药理药效研究，因此有必要提高1403C的发酵产量，为开发新型、高效、低毒的抗肿瘤候选药物奠定基础。本发明旨在通过对接种方式的优化，以期获得高产量的1403C。

发明内容

本发明的主要目的在于解决1403C产量过低的问题，提供了不同的接种方式来培养种子从而提高1403C产量。

为了解决上述问题，本发明采用的技术路线如下：

一种通过改变接种方式来提高1403C产量的方法，利用海洋丝状内生真菌Fusarium proliferatum(No.1403).CCTCC M201018，采用不同的接种方式来培养种子，从而获得较高产量的1403C。

所述的不同的接种方式是通过带挡板的锥形瓶培养种子进行研磨接种、带挡板的锥形瓶培养的种子直接接种或者在普通锥形瓶中加入一到十颗玻璃珠培养种子进行接种。

在普通锥形瓶中加入一到十颗玻璃珠培养种子进行接种时，在上述普通锥形瓶中加入一到十颗玻璃珠，装入种子培养基，经常规灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。加入的玻璃珠的直径推荐为1-10mm，进一步推荐1-3mm。

采用带挡板的锥形瓶培养种子进行研磨接种或者带挡板的锥形瓶培养的种子直接接种时，在上述带挡板的锥形瓶中装入种子培养基，经常规灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中，待种子生长好，进行或不进行无菌研磨。所述的带挡板的锥形瓶中的挡板推荐为1～6块，进一步推荐带挡板的锥形瓶中的挡板为3块。所述的锥形瓶推荐为500ml的，所述的带挡板的锥形瓶中挡板的位置推荐瓶中挡板中心离瓶口13-19cm，离瓶底部0.1-1cm，挡板轴向叶端宽度0.1-2cm，较佳的范围18.4-18.6cm，离瓶底部0.4～0.6cm，挡板轴向叶端宽度0.8-1cm。例如挡板中心离瓶口18.5cm，离瓶底部0.5cm，挡板轴向叶端宽度0.9cm。上述带挡板的锥形瓶中的挡板与瓶子主体为一体吹制而成。

具体例如：

M1：采用带有三个挡板的500mL锥形瓶，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，进行无菌研磨。

M2采用带有三个挡板的500mL锥形瓶，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。

M3采用无挡板的500mL普通锥形瓶，加入十颗玻璃珠，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。

M4采用无挡板的500mL普通锥形瓶，加入六颗玻璃珠，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。

M5采用无挡板的500mL普通锥形瓶，加入三颗玻璃珠，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。

M6采用无挡板的500mL普通锥形瓶，加入一颗玻璃珠，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。

菌株

本发明所用的内生真菌1403保存在中国典型微生物保藏中心(CCTCC中国武汉大学)，编号为CCTCC M201018。菌种由中山大学林永成教授提供提供。

培养基

菌种保存用斜面培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH7；人工海水(ASW)1000mL：琼脂15-20g。

种子培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH7；人工海水(ASW)1000mL。

发酵培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH7；人工海水(ASW)200mL；去离子水800mL。

培养方法

从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经121℃(0.1MP)高温灭菌20min的种子培养基，培养3d后接入同样经高温灭菌的发酵培养基，接种量5％(相对于培养基的体积百分比)。将250mL锥形瓶放在摇床上转速170r/min，培养温度28℃。培养时间160h。

分析方法

(1)1403C的粗提取

摇瓶发酵结束后，吸取发酵液10ml加入到含20颗3mm直径的玻璃珠的250ml三角瓶中并与加入30mL的乙酸乙酯萃取，汲取上层有机相萃取液减压蒸馏浓缩后，用1.5ml甲醇溶解后用RP-HPLC检测。

(2)1403C的含量测定：

用HP 1100液相色谱仪，Kramasil C18反相柱(250×4.6mm，5μm)，温度26℃，进样量15μl，检测波长为280nm，流速1ml/min，流动相为1％冰醋酸水溶液(A相)和甲醇(B相)，进行梯度洗脱，方法见表1。1403C含量根据色谱峰面积与标准品的峰面积对比以及浓缩倍数计算。

表1HPLC梯度洗脱表

本发明的有益效果如下：

本发明通过不同的接种方式来培养种子，应用该发明，能够获得相对于对照组产量的不同程度的提高，M1、M2、M3、M4、M5、M6最终产量分别为1.13g/L、0.97g/L、0.8g/L、0.74g/L、0.7g/L、0.6g/L，比对照组的最终产量0.29g/L分别提高了289.7％、234.5％、175.9％、155.2％、141.4％、106.9％。本发明大大提高了抗癌蒽醌化合物1403C的产量，对进一步进行Fusariumproliferatum(No.1403)的药理药效实验具有重要的意义。

附图说明

图1反映了采用不同接种方式对抗癌蒽醌化合物1403C产量的影响，其中：

图1(M1)采用接种方式M1进行发酵所获得1403C产量的过程曲线；

图1(M2)采用接种方式M2进行发酵所获得1403C产量的过程曲线；

图1(M3)采用接种方式M3进行发酵所获得1403C产量的过程曲线；

图1(M4)采用接种方式M4进行发酵所获得1403C产量的过程曲线；

图1(M5)采用接种方式M5进行发酵所获得1403C产量的过程曲线；

图1(M6)采用接种方式M6进行发酵所获得1403C产量的过程曲线；

图1(对照)采用常规的接种方式(对照)进行发酵所获得1403C产量的过程曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

对照例1  采用常规的接种方式进行发酵所获得1403C产量

采用500mL普通锥形瓶，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，以5％的接种量接入发酵培养基中。如图1(对照)所示，25h后1403C产量缓慢增加，在发酵106h后产量达到最大，为0.29g/L。

实施例1  采用接种方式M1进行发酵所获得1403C产量

采用带有三个挡板的500mL锥形瓶(挡板中心离瓶口18.5cm，离瓶底部0.5cm，挡板轴向叶端宽度0.9cm。挡板形状为梯形，挡板与瓶子主体为一体吹制而成)，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，进行无菌研磨。以5％的接种量接入发酵培养基中。如图1(M1)所示，25h后1403C产量迅速增加，在发酵130h后产量达到最大，为1.13g/L，比对照组0.29g/L提高了289.7％。

实施例2  采用接种方式M2进行发酵所获得1403C产量

采用带有三个挡板的500mL锥形瓶(挡板中心离瓶口18.5cm，离瓶底部0.5cm，挡板轴向叶端宽度0.9cm。挡板形状为梯形，该带挡板的锥形瓶中的挡板与瓶子主体为一体吹制而成)，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，以5％的接种量接入发酵培养基中。如图1(M2)所示，36h后1403C产量迅速增加，在发酵130h后产量达到最大，为0.97g/L，比对照组0.29g/L提高了234.5％。

实施例3  采用接种方式M3进行发酵所获得1403C产量

采用无挡板的500mL锥形瓶，加入十颗玻璃珠(直径3mm)，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，以5％的接种量接入发酵培养基中。如图1(M3)所示，36h后1403C产量迅速增加，在发酵130h后产量达到最大，为0.8g/L，比对照组0.29g/L提高了175.9％。

实施例4  采用接种方式M4进行发酵所获得1403C产量

采用无挡板的500mL锥形瓶，加入六颗玻璃珠(直径3mm)，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，以5％的接种量接入发酵培养基中。如图1(M4)所示，36h后1403C产量迅速增加，在发酵130h后产量达到最大，为0.74g/L，比对照组0.29g/L提高了155.2％。

实施例5  采用接种方式M5进行发酵所获得1403C产量

采用无挡板的500mL锥形瓶，加入三颗玻璃珠(直径3mm)，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，以5％的接种量接入发酵培养基中。如图1(M5)所示，36h后1403C产量迅速增加，在发酵130h后产量达到最大，为0.7g/L，比对照组0.29g/L提高了141.4％。

实施例6  采用接种方式M6进行发酵所获得1403C产量

采用无挡板的500mL锥形瓶，加入一颗玻璃珠(直径3mm)，装入100mL种子培养基，经121℃、20min灭菌，从斜面培养基上挑取生长良好的种子接入上述瓶中。待种子生长好，以5％的接种量接入发酵培养基中。如图1(M6)所示，36h后1403C产量迅速增加，在发酵130h后产量达到最大，为0.6g/L，比对照组0.29g/L提高了106.9％。

一种采用不同接种方式来提高红树林内生真菌产抗癌蒽醌类化合物产量的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。