专利摘要

本发明公开了一株高产赖氨酸氨肽酶的瑞士乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。此瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)CCFM1035具有具有生长速率快、产酸快且赖氨酸氨肽酶(Lys‑pNA)产量高的优势，能有效增强发酵食品中蛋白的代谢能力、减少发酵食品苦味的形成、改善发酵食品的风味，在发酵乳、发酵乳饮料、奶酪、马奶酒、酸马奶(Koumiss)、酸奶油、曲奇饼干、醋或酱油等发酵食品的制备中具有很重要的应用。

权利要求

1.一株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，其特征在于，所述瑞士乳杆菌已于2018年09月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60452，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.含有权利要求1所述瑞士乳杆菌的发酵剂。

3.如权利要求2所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂为直投式发酵剂；

所述直投式发酵剂的制备方法为将权利要求1所述瑞士乳杆菌接种至培养基中培养至瑞士乳杆菌活菌浓度不低于1×108CFU/mL，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用缓冲液清洗2～3次后用冻干保护剂重悬至菌浓度不低于1×108CFU/mL，得到菌悬液；将悬浮液干燥，得到直投式发酵剂。

4.权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂在制备发酵食品方面的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵食品为使用权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂生产得到的发酵乳制品、发酵面食或发酵调味料。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述发酵乳制品包含发酵乳、发酵乳饮料、奶酪、马奶酒、酸马奶(Koumiss)或酸奶油；所述发酵面食包含曲奇饼干；所述发酵调味料包含醋或酱油。

7.一种发酵食品的制备方法，特征在于，所述方法为使用权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述发酵食品为奶酪时，制备方法为将牛乳经均质、巴氏杀菌后冷却，得到发酵原料；在发酵原料中接种权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂进行发酵，得到发酵乳；在发酵乳中再次接种权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂，同时在发酵乳中加入凝乳酶，使发酵乳进行凝乳，得到凝乳块；将凝乳块进行切割、搅拌排乳清、凝块堆酿、切碎加盐、压榨，得到奶酪；将奶酪进行成熟，得到奶酪成品；

或所述发酵食品为酸马奶时，制备方法为将马奶杀菌后冷却，得到发酵原料；在发酵原料中接种权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂，同时，在发酵原料中接种酿酒酵母进行发酵，得到酸马奶。

9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵食品为奶酪时，制备方法为将牛乳在压力14MPa～21MPa、温度40～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，得到灭菌后的牛乳；将灭菌后的牛乳冷却至21～30℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂后于37℃下发酵10～12h，得到发酵乳；在发酵乳中再次接种权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂，同时在发酵乳中加入凝乳酶，使发酵乳进行凝乳，得到凝乳块；将凝乳块先进行切割，然后于39℃搅拌排乳清，再凝块堆酿至酸度达到45～55°T，再切碎加盐，最后于14℃压榨18h，得到奶酪；将奶酪于温度8℃、湿度85％的条件下进行成熟，得到奶酪成品；

或所述发酵食品为酸马奶时，制备方法为将马奶于温度90～95℃的条件下维持10～15min进行杀菌后冷却至35℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种权利要求1所述瑞士乳杆菌或权利要求2或3所述发酵剂，同时，在发酵原料中接种酿酒酵母于37℃下发酵96h至酸度达到70～120°T、酒精度达到1.0～3.0°P，得到酸马奶。

10.应用权利要求7-9任一所述的制备方法制备得到的发酵食品。

说明书

技术领域

本发明涉及一株高产赖氨酸氨肽酶的瑞士乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

牛乳中的游离肽和氨基酸含量较少，具有更高的蛋白水解活性，而瑞士乳杆菌呈现出多氨基酸营养缺陷型的特点，因此，瑞士乳杆菌在奶酪成熟等发酵食品的制备过程中具有加速风味形成的能力，在发酵食品领域占据重要地位。

瑞士乳杆菌的蛋白水解系统主要包括细胞壁蛋白酶(Cell-envelopeproteinase,CEP)，其作用是把蛋白质水解成一系列肽段，这些水解得到的肽段会由寡肽转运系统(Opp)、二肽和三肽转运系统(Dpp和DtpT)运输至细胞内，被胞内肽酶(氨基酸肽酶、肽链内切酶、Pro-特异性肽酶等)进一步水解为氨基酸或更小的肽类，满足菌体的营养需求从而更好的生长。

虽然，蛋白质水解生成的多肽、寡肽和少量氨基酸，其溶解性、营养特性及口感风味较蛋白质本身而言均可得到明显改善，但是，这些蛋白质水解液往往呈现苦味，这种苦味是由末端为疏水性氨基酸的多肽(苦味肽)所导致的，这无疑大大限制了蛋白质水解物的应用。因此，减少、阻止和去除瑞士乳杆菌的蛋白水解物的苦味，就显得尤为重要。

经研究发现，在瑞士乳杆菌的胞内肽酶中，氨基酸肽酶属于肽链端解酶，可使氨基酸从多肽链的N-末端顺序逐个的水解，因此，氨基酸肽酶不但对于瑞士乳杆菌菌体的生长至关重要，也可从N端切除疏水性氨基酸残基从而达到脱苦的目的，因此，得到高产氨基酸肽酶的瑞士乳杆菌无疑可降低蛋白水解物的苦味。

但是，目前在瑞士乳杆菌菌株中分离出的氨肽酶种类较少，不能有效的针对Leu、Pro、Arg、Lys等对苦味有影响的疏水性氨基酸残基，并且，这些可产氨肽酶的瑞士乳杆菌产量均不高，不足以起到明显的降低蛋白水解物的苦味的效果。

因此，找到一种高产氨基酸肽酶的瑞士乳杆菌，以期作为发酵剂应用于发酵乳、发酵乳饮料、奶酪、马奶酒、酸马奶(Koumiss)、酸奶油、曲奇饼干、醋或酱油等发酵食品的发酵，以增强发酵食品中蛋白的代谢能力、减少发酵食品苦味的形成、改善发酵食品的风味，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035，此瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035具有具有生长速率快(将此菌株以1×106CFU/mL的接种量接种至脱脂乳中发酵10h，即可使发酵乳中瑞士乳杆菌的活菌数达4.3×108CFU/mL)、产酸快(将此菌株以1×106CFU/mL的接种量接种至脱脂乳中发酵10h，即可使发酵乳的pH为4.71、酸度为50.57°T，至发酵终点)且赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)产量高(将此菌株以2％的接种量接种至MRS液体培养基中培养16h，即可使赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)的酶活达177.464nmol/min*mg)的优势，能有效增强发酵食品中蛋白的代谢能力、减少发酵食品苦味的形成、改善发酵食品的风味，在发酵乳、发酵乳饮料、奶酪、马奶酒、酸马奶(Koumiss)、酸奶油、曲奇饼干、醋或酱油等发酵食品的制备中具有很重要的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035，所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035已于2018年09月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60452，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035是从青海西宁藏区传统发酵牦牛曲拉中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示此菌株为瑞士乳杆菌，命名为瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)CCFM1035。

所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035的在MRS固体培养基上生长时的菌落呈圆形、较小、半透明、光滑；所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在脱脂乳中生长14h即进入稳定期，在脱脂乳中发酵10h即达发酵终点，生长快，产酸快。

本发明提供了含有上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035的发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂为直投式发酵剂；

所述直投式发酵剂的制备方法为将权利要求1所述瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)CCFM1035接种至培养基中培养至瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035活菌浓度不低于1×108CFU/mL，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用缓冲液清洗2～3次后用冻干保护剂重悬至菌浓度不低于1×108CFU/mL，得到菌悬液；将悬浮液干燥，得到直投式发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基或LBS培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂为甘油或脱脂乳。

在本发明的一种实施方式中，所述干燥为真空冷冻干燥。

本发明提供了上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂在制备发酵食品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为使用上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂生产得到的发酵乳制品、发酵面食或发酵调味料。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵乳制品包含发酵乳、发酵乳饮料、奶酪、马奶酒、酸马奶(Koumiss)或酸奶油；所述发酵面食包含曲奇饼干；所述发酵调味料包含醋或酱油。

本发明提供了一种发酵食品的制备方法，所述方法为使用上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为奶酪时，制备方法为将牛乳经均质、巴氏杀菌后冷却，得到发酵原料；在发酵原料中接种上述瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)CCFM1035或上述发酵剂进行发酵，得到发酵乳；在发酵乳中再次接种上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂，同时在发酵乳中加入凝乳酶，使发酵乳进行凝乳，得到凝乳块；将凝乳块进行切割、搅拌排乳清、凝块堆酿、切碎加盐、压榨，得到奶酪；将奶酪进行成熟，得到奶酪成品；

或所述发酵食品为酸马奶时，制备方法为将马奶杀菌后冷却，得到发酵原料；在发酵原料中接种上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂，同时，在发酵原料中接种酿酒酵母进行发酵，得到酸马奶。

在本发明的一种实施方式中，所述牛乳包含原料乳、复原乳或脱脂乳。

所述脱脂乳是指是将牛乳中的脂肪脱去后得到的乳液；所述原料乳是指从奶牛乳房挤出未经过任何处理的生牛奶；所述复原乳是指把牛奶浓缩、干燥成为浓缩乳或乳粉，再添加适量水，制成与原乳中水、固体物比例相当的乳液。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为奶酪时，制备方法为将牛乳在压力14MPa～21MPa、温度40～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，得到灭菌后的牛乳；将灭菌后的牛乳冷却至21～30℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂后于37℃下发酵10～12h，得到发酵乳；在发酵乳中再次接种上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂，同时在发酵乳中加入凝乳酶，使发酵乳进行凝乳，得到凝乳块；将凝乳块先进行切割，然后于39℃搅拌排乳清，再凝块堆酿至酸度达到45～55°T，再切碎加盐，最后于14℃压榨18h，得到奶酪；将奶酪于温度8℃、湿度85％的条件下进行成熟，得到奶酪成品；

或所述发酵食品为酸马奶时，制备方法为将马奶于温度90～95℃的条件下维持10～15min进行杀菌后冷却至35℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种上述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或上述发酵剂，同时，在发酵原料中接种酿酒酵母于37℃下发酵96h至酸度达到70～120°T、酒精度达到1.0～3.0°P，得到酸马奶。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为奶酪时，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或发酵剂在发酵原料中的接种量为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在发酵原料中的活菌数达106～108CFU/mL、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或发酵剂在发酵乳中的接种量为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在发酵原料中的活菌数达106～108CFU/mL、凝乳酶在发酵乳中的添加量占发酵乳总质量的0.002％、盐在凝乳块中的添加量占凝乳块总质量的3‰；

或所述发酵食品为酸马奶时，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035或发酵剂在发酵原料中的接种量为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在发酵原料中的活菌数达106～108CFU/mL、酿酒酵母在发酵原料中的接种量为酿酒酵母在发酵原料中的活菌数达106～108CFU/mL。

本发明提供了应用上述制备方法制备得到的发酵食品。

有益效果：

(1)本发明的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035具有具有生长速率快、产酸快且赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)产量高的优势，能有效增强发酵食品中蛋白的代谢能力、减少发酵食品苦味的形成、改善发酵食品的风味，在发酵乳、发酵乳饮料、奶酪、马奶酒、酸马奶(Koumiss)、酸奶油、曲奇饼干、醋或酱油等发酵食品的制备中具有很重要的应用；

(2)将本发明的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035以1×106CFU/mL的接种量接种至脱脂乳中发酵10h，即可使发酵乳中瑞士乳杆菌的活菌数达4.3×108CFU/mL；

(3)将本发明的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035以1×106CFU/mL的接种量接种至脱脂乳中发酵10h，即可使发酵乳的pH为4.71、酸度为50.57°T，至发酵终点；

(4)将本发明的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035以2％的接种量接种至MRS液体培养基中培养16h，即可使赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)的酶活达177.464nmol/min*mg。

生物材料保藏

一株瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035，分类学命名为Lactobacillushelveticus，已于2018年09月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.60452，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：本发明菌株的革兰氏染色特征；

图2：本发明菌株在脱脂乳中的生长状况；

图3：本发明菌株在脱脂乳中发酵的pH变化情况；

图4：本发明菌株在脱脂乳中发酵的酸度变化情况；

图5：本发明菌株在MRS培养基中的赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)酶活。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的脱脂乳购自光明乳品股份有限公司；所述瑞士乳杆菌ATCC15009购自北纳生物公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1mL/L、无水乙酸钠2.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L，加入蒸馏水完全溶解后按1.5％(m/v)的量添加纯化琼脂粉，115℃灭菌20min。

MRS液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1mL/L、无水乙酸钠2.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L，加入蒸馏水完全溶解后，115℃灭菌20min。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

pH检测方法：采用pH计测量。

酸度检测方法：采用国标GB 431334-2010。

赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)酶活检测方法：

1、对硝基苯胺标准曲线的绘制：

配制不同浓度(20～160μM)的对硝基苯胺溶液，在405nm测吸光度，获得标准标准曲线；

2、底物溶液的制备

将1mM的显色底物(H-Lys-pNA)溶于pH 7.5的50mmol L-1磷酸钠缓冲液中；

3、赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)酶活检测

将50μL底物溶液和50μL CFE在30℃培养30分钟后，在405nm测量吸光度；无阳性对照，无商用酶，空白对照用buffer代替CFE；

赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)酶活的计算公式为：酶活＝(对硝基苯胺生成量*100*0.001))/(蛋白浓度*50*0.001*30)；

(可参考文献：Stefanovic E,Kilcawley K N,Rea M C,et al.Genetic,enzymatic and metabolite profiling of the Lactobacillus casei group revealsstrain biodiversity and potential applications for flavour diversification[J].Journal of Applied Microbiology,2017,122(5).)

实施例1：菌株的筛选及鉴定

1、筛选

(1)制备合适的样品稀释梯度并培养

称取0.5g青海西宁藏区传统发酵牦牛曲拉，加入到装有4.5mL无菌水中，然后依次取0.5mL菌液稀释在4.5mL无菌水，使该样品浓度梯度稀释至10-4，取4个稀释度分别为10～104的菌悬液各50μL分别涂布于MRS固体培养基上，在温度37℃下培养46～48h，并及时观察。

(2)划线分离与纯化

将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。

(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验

挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果；并挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果以鉴定挑选的菌株是否具有乳酸菌的特征。

(4)菌种保藏

将纯化完成后的每株菌株的单菌落挑入5mL MRS液体培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20～24h，吸取1mL菌液至保菌管中，4000rpm离心5min，倾去上清，加入1mL 30％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。

2、鉴定

(1)16S rDNA序列扩增

吸取1mL上述菌液离心倾去上清，用1mL无菌水吹打清洗两次，离心倾去上清液，获得菌泥，以此为模板，进行PCR扩增，流程如下：

1)扩增体系50μL：

其中Mix为25μL、27F(SEQ ID No 2：AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA)1μL、1492R(SEQ ID No 3：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)1μL、ddH2O为23μL；扩增片段长度1500bp。

2)扩增条件：

Lid：105℃、MBY-16s、V：20μL；

循环次数：29次循环

将DNA双链在94℃保持10min、94℃保持30s、50℃保持30s、72℃保持80s，循环29次后，72℃保持7min。

(2)琼脂糖凝胶电泳

称取0.8g琼脂糖加入锥形瓶中，加入80mL 1xTAE，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入8μLEB染料；加入电泳板冷却半小时，待其凝结成固体胶状，用移液枪将3～5μL的样品打入胶板的小孔内，并在每行末端加一个Marker；插上电极，调电压120V，运行半小时；取出胶板，在UV下曝光10s，保存电泳条带的图像；将得到清晰电泳条带的样品测序。

(3)16S rRNA序列分析鉴定

根据华大基因反馈的序列结果，结合NCBI菌株序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录，PCR成功的两株菌株均为瑞士乳杆菌，分别命名为为瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)CCFM1035以及瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)DNM-B1M10。

实施例2：菌株的培养

将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在MRS固体培养基上培养48h，观察并挑取菌落进行镜检、革兰氏颜色和生长特性测定。

经观察，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035的在MRS固体培养基上生长时的菌落呈圆形、较小、半透明、光滑。

实施例3：菌株在乳体系中的生长特性

1、瑞士乳杆菌在脱脂乳中生长14h的生长曲线

将-80℃保存的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)DNM-B1M10以及瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009分别接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度达108～109CFU/mL；取出在MRS中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的菌量达到106CFU/g；将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔2h取样，检测发酵过程菌量的变化，结果如图2所示。

由图3可知，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在发酵10h后菌量达到4.3×108CFU/mL，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)DNM-B1M10和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009在发酵10h后菌量分别达到8.3×106CFU/mL、3.4×107CFU/mL，因此，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在脱脂乳中生长速率更快。

2、瑞士乳杆菌在脱脂乳中生长10h的pH和滴定酸度变化

将-80℃保存的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)DNM-B1M10以及瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009分别接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，传代培养2～3次，至菌浓度达108～109CFU/mL；取出在MRS中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的菌量达到106CFU/g；将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔2h取样，每隔2h取样，检测发酵过程中pH和滴定酸度的变化，实验结果如图3-4所示。

由图4可知，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035在发酵10h后pH为4.71、酸度为50.57°T，至发酵终点，产酸速率比瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)DNM-B1M10和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009快。

实施例4：菌株的赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)酶活

将-80℃保存的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)DNM-B1M10以及瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009分别接种于200mL MRS培养基中，使MRS培养基中菌浓度达106CFU/g；将接种后的样品于37℃下培养16h；将培养得到的菌液通过12000g、5min、4℃离心，收集菌体；菌体用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液清洗2次，加入液氮研磨5min，溶于3ml pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，用12000g、5min、4℃离心，取上清，得到粗酶液。

检测粗酶液中赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)酶活，结果如图5所示。

由图5可知，反应30min后，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035的赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)活力为177.464nmol/min*mg，瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)DNM-B1M10和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009的赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)活力分别为9.131nmol/min*mg、46.469nmol/min*mg，因此，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035的赖氨酸氨肽酶(Lys-pNA)活力高。

实施例5：菌株的应用(制备奶酪)

将牛乳在压力14MPa～21MPa、温度40～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，得到灭菌后的牛乳；将灭菌后的牛乳冷却至21～30℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035至菌浓度为106～108CFU/mL后于37℃下发酵10～12h，得到发酵乳；在发酵乳中再次接种瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035至菌浓度为106～108CFU/mL，同时在发酵乳中加入0.002％(w/w)凝乳酶，使发酵乳进行凝乳，得到凝乳块；将凝乳块先进行切割，然后于39℃搅拌排乳清，再凝块堆酿至酸度达到45～55°T，再切碎并加入3‰盐，最后于14℃压榨18h，得到奶酪；将奶酪于温度8℃、湿度85％的条件下进行成熟，得到奶酪成品。

将此奶酪成品进行品尝，奶香风味十足，无苦味。

实施例6：菌株的应用(制备Koumiss)

将马奶于温度90～95℃的条件下维持10～15min进行杀菌后冷却至35℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1035至菌浓度达106～108CFU/mL，同时，在发酵原料中接种酿酒酵母至菌浓度达106～108CFU/mL，将接种后的发酵原料于37℃下发酵96h至酸度达到70～120°T、酒精度达到1.0～3.0°P，得到酸马奶。

将此酸马奶进行品尝，酸味适中，酒香、奶香风味兼具，无苦味。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株高产赖氨酸氨肽酶的瑞士乳杆菌及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcgtt ctgatccgcg attactagcg 60

attccagctt cgtgcagtcg agttgcagac tgcagtccga actgagaaca gctttcagag 120

attcgcttgc cttcgcaggc tcgcttctcg ttgtactgtc cattgtagca cgtgtgtagc 180

ccaggtcata aggggcatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttatcaccg 240

gcagtctcat tagagtgccc aacttaatgc tggcaactaa taacaagggt tgcgctcgtt 300

gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcac cacctgtctt 360

agcgtccccg aagggaactc ctaatctctt aggatggcac tagatgtcaa gacctggtaa 420

ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 480

attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc 540

tgcagcactg agaggcggaa acctcccaac acttagcact catcgtttac ggcatggact 600

accagggtat ctaatcctgt tcgctaccca tgctttcgag cctcagcgtc agttgcagac 660

cagagagtcg ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcattcca ccgctacaca 720

tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gaaaaacagt ttccgatgca gttcctcggt 780

taagccgagg gctttcacat cagacttatt cttccgcctg cgctcgcttt acgcccaata 840

aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 900

actttctggt tgattaccgt caaataaagg ccagttacta cctctatcct tcttcaccaa 960

caacagagct ttacgatccg aaaaccttct tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt 1020

gcgtccattg tggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc cgtgtctcag 1080

tcccaatgtg gccgatcagt ctctcaactc ggctatgcat cattgccttg gtaagccgtt 1140

accttaccaa ctagctaatg caccgcgggg ccatcccata gcgacagctt acgccgcctt 1200

ttataagctg atcatgcgat ctgctttctt atccggtatt agcacctgtt tccaagtggt 1260

atcccagact atggggcagg ttccccacgt gttactcacc catccgccgc tcgcgtcccc 1320

agcgtcatta ccgaagtaaa tctgctggtt ctgctcgctc gacttg 1366

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggcctca 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

一株高产赖氨酸氨肽酶的瑞士乳杆菌及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。