IPC分类号 : C08F289/00,C08F220/36,C08F220/28,C08H1/00,A61L27/22,A61L27/38,A61L27/52,A61L27/54,A61L27/58
专利摘要
本发明公开了一种温敏聚合物及其合成方法与温敏可注射水凝胶。该温敏聚合物制备时，先合成GelMA、UPyMA；然后将UPyMA、GelMA和MEOnMA三种单体分散于pH为8～11的碱性水溶液中，去除氧气，在室温下，加入氧化还原引发剂或水溶性引发剂发生聚合反应并至反应充分，纯化产物，除去溶剂，得到温敏聚合物。该温敏聚合物可以在不高于对应的低临界相转变温度且不低于水凝固温度的常压环境下配制可注射的水相温敏聚合物溶胶，该溶胶在对应的低临界相转变温度以上可立即形成凝胶。温敏可注射水凝胶兼具动态力学性能和良好的生物相容性，可应用于组织工程、药物控释与细胞三维培养等生物医用领域。
权利要求
1.一种温敏聚合物的合成方法，其特征在于包含如下步骤：
1)GelMA合成：在40～45℃下用水相缓冲体系将明胶溶解，加入甲基丙烯酸酐，控制pH为7.4～11.0；反应1～5小时，终止反应，溶解产物，纯化产物，除去溶剂，得到产物甲基丙烯酸酰化明胶GelMA；
2)UPyMA合成：在150～180℃下将2-氨基-6-甲基-4(1H)-嘧啶酮溶于无水极性有机溶剂得到2-氨基-6-甲基-4(1H)-嘧啶酮溶液；加入甲基丙烯酸异氰基乙酯，降温至室温，充分搅拌至出现白色沉淀；除去溶剂，得到产物UpyMA；所述的UPyMA的结构式为：
3)聚合反应：将质量比为1：(1～5)：(5～10)的UPyMA、GelMA和MEO
4)纯化产物，除去溶剂，得到温敏聚合物。
2.根据权利要求1所述的温敏聚合物的合成方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酸酐与明胶的体积质量比为1：0.5～10；质量单位为g；体积单位为ml；所述的2-氨基-6-甲基-4(1H)-嘧啶酮与甲基丙烯酸异氰基乙酯的摩尔比为1：1～2。
3.根据权利要求1所述的温敏聚合物的合成方法，其特征在于，所述的2-氨基-6-甲基-4 (1H)-嘧啶酮与无水极性溶剂的质量比为1：20～30；所述甲基丙烯酸酐以滴加的方式加入，滴加的速度不快于0.4ml/min。
4.根据权利要求1所述的温敏聚合物的合成方法，其特征在于，步骤1)所述的终止反应是使用pH为7.4的水相缓冲体系3～10倍稀释反应体系或调节体系pH为7.4；所述的溶解产物是在40～45℃利用终止反应的水相缓冲体系溶解0.5～2小时。
5.根据权利要求1所述的温敏聚合物的合成方法，其特征在于，步骤1)所述的纯化产物是通过透析、超滤或色谱分离去除分子量小于3000的溶质以及不溶于水的产物；步骤1)所述的除去溶剂是通过冻干或再沉淀脱去溶剂，得到干态的GelMA；步骤2)所述的除去溶剂是用丙酮反复洗涤白色沉淀，或者步骤2)所述的除去溶剂是用色谱分离实现，然后干燥；步骤4)所述的纯化产物是通过透析、超滤或色谱分离纯化分子量3000～15000的溶质。
6.根据权利要求1所述的温敏聚合物的合成方法，其特征在于，步骤1)所述的水相缓冲体系为Na
7.根据权利要求1所述的温敏聚合物的合成方法，其特征在于，所述的氧化还原引发剂中的氧化剂为过氧化氢、过硫酸盐、氢过氧化物；还原剂为无机还原剂或有机还原剂；所述的无机还原剂为NaHSO
8.一种温敏聚合物，其特征在于，其由权利要求1-7任一项所述的合成方法得到。
9.应用权利要求8所述的温敏聚合物制备的温敏可注射水凝胶，其特征在于，所述温敏可注射水凝胶的制备方法为，将温敏聚合物以5-20wt％的固含量分散于水相体系内，形成温敏聚合物水相分散体系，即为所述的温敏可注射水凝胶。
说明书
技术领域
本发明属于高分子物理、高分子化学、生物医用材料与组织工程技术领域，具体是一种具有良好生物相容性的温敏聚合物合成及其对应的温敏可注射水凝胶的制备和应用方法。
背景技术
水凝胶是以水相体系为分散介质的凝胶。凝胶网络中的分子组成和结构复杂多变，具有良好的可设计性；水相分散体系可赋予凝胶良好的生物相容性。水凝胶由于以上特点，可以为细胞提供留存或增殖的环境，也可以包载药物或蛋白进行可控缓释，任务完成后可被生物降解并作为代谢废物排出体外，在生物医用方面具有很大的应用价值和潜力。因此，含有具备生物相容性成分的水凝胶经常被用于生物医用材料或组织工程技术等领域。
当水凝胶用于体内的组织工程时，植入方式根据凝胶种类的不同分为两种：不可逆化学交联宏观水凝胶大多数需要手术植入；可逆交联宏观水凝胶或微凝胶可以进行注射植入。相较于手术，注射更为温和、简便。同时化学交联水凝胶也经常具有潜在的毒性。可逆交联水凝胶实现注射植入主要分为剪切变稀、pH响应、温度响应(温敏)三种方式。剪切变稀和pH响应可能使凝胶内包载的药物或细胞在注射时或注射前处于高剪切模量或不合适的pH范围，均有可能对凝胶内包载的生物活性成分受到损害从而影响治疗效果。而温敏可注射凝胶经过设计，使溶胶-凝胶转变点处于室温到体温的范围内，可以实现温和的溶胶注射并在目标植入部位快速形成凝胶。
中国发明专利2011103868703公开了一种可原位增强温敏聚合物的合成方法，包括以下步骤：在含羟基引发剂以及胺类催化剂的存在下，由双键功能单体均聚得到，或者由双键功能单体与碳酸酯、内酯、交酯中的一种共聚得到，其中，均聚或共聚反应的温度为50-80℃，反应时间为1-4h。本发明所提出的水凝胶在较低温时为液体形态，而在生理温度下为凝胶形态，本发明所提出的水凝胶材料，能方便的引入生物活性分子和生物信号，赋予材料特殊的生物活性。本发明所提出的水凝胶在生理环境下，能逐渐降解。类似现有的基于低临界相转变温度的温敏水凝胶主要依靠低临界相转变温度以上的聚合物疏水聚集形成交联结构，而这种疏水聚集形成的交联点强度低，造成了不稳定的凝胶力学性能以及不耐溶胀的交联结构，从而极大地限制了其应用范围。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明目的提供一种温敏聚合物及其合成方法，该方法简便易行，可重复性好，安全，产率高。
本发明另一目的应用温敏聚合物制备的温敏可注射水凝胶；该水凝胶具有良好的生物相容性，尤其体现在细胞易于在凝胶内部留存、黏附、增殖；该水凝胶具有实用的温敏性能，室温时流动性好，处于易于注射的溶胶态，在人体体温时呈稳定的凝胶态。凝胶的力学强度与稳定性良好，细胞毒性极低是指温敏可注射水凝胶的特点吧
温敏聚合物分为两种，一种为基于高临界相转变温度的温敏聚合物，低于相转变温度时发生聚合物链段的聚集、交联，高于相转变温度时发生聚合物链段的分散、解交联；一种为基于低临界相转变温度的温敏聚合物，低于相转变温度时发生聚合物的分散、解交联，高于相转变温度时发生聚合物的聚集、交联。本发明中所制备的温敏聚合物属于基于低临界相转变温度的温敏聚合物。一般的基于低临界相转变温度的温敏水凝胶力学强度较弱，稳定性差。本发明通过UPyMA片段带来的动态四重氢键自组装增强结构在不影响溶胶态流动性的情况下显著提升了凝胶的力学强度与稳定性。而且本发明中的温敏水凝胶只通过超分子相互作用形成交联网络，在交联网络的形成中不需要任何引发剂的参与也不发生化学键的形成，因此具有极低的细胞毒性。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种温敏聚合物的合成方法，包含如下步骤：
1)GelMA合成：在40～45℃下用水相缓冲体系将明胶溶解，加入甲基丙烯酸酸酐，控制pH为7.4～11.0；反应1～5小时，终止反应，溶解产物，纯化产物，除去溶剂，得到产物甲基丙烯酸酰化明胶GelMA；
2)UPyMA合成：在150～180℃下将氨基嘧啶酮溶于无水极性有机溶剂得到氨基嘧啶酮溶液；加入甲基丙烯酸异氰酸乙酯，降温至室温，充分搅拌至出现白色沉淀；除去溶剂，得到产物UpyMA；所述的UPyMA的结构式为：
3)聚合反应：将质量比为1：(1～5)：(5～10)的UPyMA、GelMA和MEOnMA三种单体分散于pH为8～11的碱性水溶液中，去除氧气，在室温下，加入氧化还原引发剂或水溶性引发剂发生聚合反应并至反应充分；所述的MEOnMA的结构式为：
n为大于或等于2的整数；
4)纯化产物，除去溶剂，得到温敏聚合物。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述的甲基丙烯酸酸酐与明胶的体积质量比为1：0.5～10；质量单位为g；体积单位为ml；所述的氨基嘧啶酮与甲基丙烯酸异氰酸乙酯的摩尔比为1：1～2。
优选地，所述的氨基嘧啶酮与无水极性溶剂的质量比为1：20～30；所述甲基丙烯酸酸酐以滴加的方式加入，滴加的速度不快于0.4ml/min。
优选地，步骤1)所述的终止反应是使用pH为7.4的水相缓冲体系3～10倍稀释反应体系或调节体系pH为7.4；所述的溶解产物是在40～45℃利用终止反应的水相缓冲体系溶解0.5～2小时。
优选地，步骤1)所述的纯化产物是通过透析、超滤或色谱分离去除分子量小于3000～15000的溶质以及不溶于水的产物；步骤1)所述的除去溶剂是通过冻干或再沉淀脱去溶剂，得到干态的GelMA；步骤2)所述的除去溶剂是用丙酮反复洗涤白色沉淀，或者步骤2)所述的除去溶剂是用色谱分离实现，然后干燥；步骤4)所述的纯化产物是通过透析、超滤或色谱分离纯化分子量3000～15000的溶质。
优选地，步骤1)所述的水相缓冲体系为Na2CO3-NaHCO3碳酸氢钠水溶液或PBS；所述的明胶与水相缓冲体系的质量比为1：9～1：20；所述溶解的时间为1～2小时，至呈淡黄色澄清液体。
优选地，所述的氧化还原引发剂中的氧化剂为过氧化氢、过硫酸盐、氢过氧化物；还原剂为无机还原剂或有机还原剂；所述的无机还原剂为NaHSO3、Na2SO3和Na2S2O3中的一种或多种；所述的有机还原剂为醇、胺、草酸和葡萄糖中的一种或多种；所述的氧化剂与UPyMA的摩尔比为2:3～1:6。
一种温敏聚合物，由上述的合成方法得到；该为温敏聚合物在水相溶剂内有低临界相转变温度。
应用所述的温敏聚合物制备的温敏可注射水凝胶：将温敏聚合物以5-20wt％的固含量分散于水相体系内，形成温敏聚合物水相分散体系；将细胞或辅助治疗的物质均匀混合进温敏聚合物水相分散体系内，得生物活性物质溶胶包封体系；对生物活性物质溶胶包封体系原位升温至溶胶的低临界相转变温度以上形成生物活性物质凝胶包封体系；或在生物活性物质溶胶包封体系的低临界相转变温度以下、凝固温度以上先形成溶胶，然后移入溶胶至注射工具内注射到温度高于低临界相转变温度的部位原位贴合形成凝胶。
优选地，所述的细胞为自体来源的干细胞、角膜内皮细胞、角膜上皮细胞或软骨细胞的自体；或所述的细胞为符合伦理的用于治疗或研究的异体来源细胞；
所述的辅助治疗的物质为抗肿瘤药物、促分化药物、抗生素药物。
本发明MEOnMA为带有双键的且包含聚乙二醇重复单元的单体。
本发明引发溶胶凝胶转变的LCST与聚合物浓度负相关，最低约为21℃，对应固含量约为8wt％～20wt％，最高约为29℃，对应固含量约为4～7wt％。
本发明将温敏聚合物以5wt％至20wt％的固含量分散于水相体系内，此固含量应使得到的聚合物水性分散体系在常压下、室温范围内，静置的情况下处于溶胶态，从而得到温敏聚合物溶胶；该温敏聚合物溶胶具有低临界相转变温度，高于这一温度时可凝胶，这种温敏聚合物水相体系具有温敏和触变等动态力学性能以及良好的生物相容性，可以作为生物医用材料。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
1)聚合物当中的UPyMA片段在低临界相转变温度以上可以显著增强原本较弱的疏水聚集交联结构，提高凝胶的力学稳定性，而在低临界相转变温度以下，由于疏水结构的坍塌，又可以很好地分散于水相环境中，不影响溶胶的流动性以及可注射性，从而在整体上提高了该温敏水凝胶的应用潜力。
2)本发明的聚合物合成与凝胶制备简便、安全、成本低，原料价廉易得。成品简单的混合、注射的应用实现方式极易操作，对于临床上的广泛应用具有很大的意义。
3)本发明作为一种潜在的注射植入物，在生理环境内可逐步被降解，降解产物为氨基酸、胞嘧啶等无毒性的生物分子，具有良好的生物相容性。相比于大部分人工合成高分子植入物，将排异反应的可能性降至极低，也避免了手术取出的麻烦。
附图说明
图1为UPyMA的核磁谱图。
图2为GelMA与温敏聚合物Gel-MEO-UPy的核磁谱图。
图3为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶在37℃下的振幅扫描。
图4为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶在37℃下的频率扫描。
图5为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶在37℃下的触变性。
图6为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶的温度扫描。
图7A为20℃下溶胶的剪切粘度曲线和10wt％Gel-MEO-UPy溶胶注射到37℃水中成胶的照片。
图7B为20℃下10wt％Gel-MEO-UPy溶胶注射到37℃模具后成凝胶形状照片。
图8A为Gel-MEO-UPy聚合物的细胞毒性测试柱状图；
图8B为CCK-8实验定量表征细胞在凝胶内的增殖情况柱状图。
图9为10wt％Gel-MEO-UPy溶胶包裹骨髓间充质干细胞注射到37℃模具后成胶进行三维培养并进行活死染色实验所拍摄的激光共聚焦照片。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.温敏聚合物的合成
(1)利用明胶和甲基丙烯酸酸酐合成GelMA(甲基丙烯酸酰化明胶)：
①放有4cm两头尖聚四氟乙烯磁力转子的250ml圆底烧瓶内加入6g明胶固体和60ml的1×PBS，密闭容器，300rpm匀速搅拌，在40℃水浴下溶解1小时至容器内物质为淡黄色澄清液体；
②升温步骤①得到的明胶溶液至50℃，保持300rpm搅拌随后向其中慢速注射滴加12ml甲基丙烯酸酸酐，滴加速度为0.2ml/min；
③滴加结束后在50℃水浴，300rpm搅拌速率下充分反应4小时；
④停止反应，溶解产物，使用1×PBS以10倍体积稀释反应体系，并随后在40℃水浴下溶解1小时；
⑤纯化产物，5升超纯水透析步骤④得到的液体，使用截留分子量为8000～14400的透析袋，每12小时换一次水，透析7天，7天后取出完成透析的液体，以9000rpm的转速离心，取上清液；
⑥冻干步骤⑤得到的上清液，得到干燥的白色固态GelMA；
(2)利用氨基嘧啶酮和甲基丙烯酸异氰基乙酯合成UPyMA(2-(3-(6-甲基-4-氧代-1,4-二氢嘧啶-2-酮)-脲基)甲基丙烯酸乙酯)；
1)放有两头尖4cm聚四氟乙烯磁力转子的干燥密封的150ml圆底烧瓶内加入2g氨基脲嘧啶和50ml无水二甲基亚砜，300rpm下搅拌并油浴加热至170℃，随后继续搅拌至氨基脲嘧啶完全溶解；
2)移去加热，立即在步骤1)得到的氨基嘧啶酮溶液中慢速注射加入2.75g甲基丙烯酸异氰酸乙酯以形成反应体系；
3)使用水浴对反应体系降温以发生反应，同时以500rpm的转速充分搅拌，体系内逐渐出现白色沉淀；
4)使用丙酮反复洗涤步骤3)得到的悬浊液留下白色固体，随后真空干燥除去剩余的丙酮和二甲基亚砜，得到产物白色粉末状UPyMA；
对本实施例制备的超分子单体UPyMA溶解于氘代氯仿进行
(3)购买市售的2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯作为MEO2MA；
(4)放有4cm两头尖聚四氟乙烯磁力转子的250ml圆底烧瓶内加入0.5gGelMA和100ml去离子水，40℃水浴加热，300rpm搅拌，1小时后GelMA完全溶解；
加入2ml 1M的NaOH水溶液，加入0.1g UPyMA，保持搅拌，10分钟后UPyMA完全溶解，随后水浴降温至20℃；
加入1ml MEO2MA，0.03g过硫酸钾，搅拌至溶解；
密封体系，插入通氮气的长针至体系液面以下，另外插短针在瓶口，20℃水浴下以300rpm搅拌，持续1小时以除净体系内的氧气，随后拔出所有针头并密封容器；
于5ml样品瓶内加入1ml去离子水，随后滴入50μl四甲基乙二胺，混匀后用通有氮气的针头伸入液面以下5分钟以除去氧气，随后立即用注射器吸出并注射进反应体系开始反应；
反应10小时后，用5L超纯水透析反应液，透析袋截留分子量为8000～14400，每6小时换一次水，透析3天，随后取出透析袋内的液体冻干，最终得到白色干态固体温敏聚合物Gel-MEO-UPy(氢键自组装低临界相转变温敏杂化聚合物)。
对本实施例制备的大分子单体GelMA和温敏聚合物Gel-MEO-UPy进行
2.温敏可注射水凝胶的制备与应用
(1)将温敏聚合物Gel-MEO-UPy在20℃以10wt％的固含量浸没于pH值为7.4的，成分为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L的磷酸盐缓冲液内，溶胀完全后，缓慢搅拌至分散均匀，得到聚合物溶胶；
(2)将骨髓间充质干细胞均匀混合进温敏聚合物溶胶内；细胞浓度10
(3)将步骤(2)所得的温敏聚合物溶胶在室温下移入至注射工具(医用注射器)内注射到温度为37℃的细胞完全培养基内(89％高糖培养基，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗溶液)内形成凝胶，进行干细胞的三维培养。每天更换新鲜的处于37℃的完全培养基。随着天数的增加，干细胞在凝胶内稳定增殖。第三天细胞数量扩增约10倍，第五天细胞数量扩增约15倍，第七天扩增至约30倍，视使用需要，在不同的天数将凝胶降低至室温，在1000rpm下离心5min得到扩增后的干细胞。
对本实施例制备的温敏水凝胶进行震荡流变测试，结果见图3～图6。实心数据点为聚合物体系的储存模量，空心数据点为聚合物体系的损耗模量。当储存模量大于损耗模量时，聚合物体系处于凝胶态；当储存模量小于损耗模量时，聚合物体系处于溶胶态。图3为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶在37℃下的振幅扫描，角频率为10rad/s，随着振幅从0.01％变化到40％，储存模量始终大约损耗模量，并且储存模量与损耗模量基本无明显变化，故水凝胶在此范围内表现出线性黏弹性，此振幅范围为线性黏弹区，当振幅超过1000％时，凝胶才发生破坏，变为溶胶态，相比于大部分的基于LCST的温敏水凝胶，Gel-MEO-UPy水凝胶有着更长的线性黏弹区，更大的破坏应变，说明了Gel-MEO-UPy水凝胶有着稳定的线性黏弹性。图4为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶在37℃下的频率扫描，振幅为1％，频率越低代表的时区越长，从代表较长时区的0.1rad/s的频率到代表较短时区的100rad/s的频率，储存模量始终大于损耗模量，且储存模量没有明显的减小，说明在长短时区内Gel-MEO-UPy水凝胶皆有着良好的力学稳定性。图5为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶在37℃下的触变性，角频率恒为10rad/s，振幅在1％和2000％之间周期性切换，1％的振幅范围内，储存模量始终大于损耗模量，且二者没有明显变化，处于稳定的凝胶态，储存模量在2000％时损耗模量大于储存模量，说明凝胶结构被大振幅的振荡破坏，当振幅从2000％恢复到1％时，储存模量立即恢复到大于损耗模量的状态，并随着时间的推移，储存模量稳步增大，储存模量和损耗模量的差值也逐渐增大，说明Gel-MEO-UPy水凝胶面对结构破坏可以进行自愈合，自愈合性能是利于水凝胶在复杂动态力学环境中应用的一种优越的力学稳定性。图6为10wt％Gel-MEO-UPy水凝胶的温度扫描，角频率为10rad/s，振幅为1％，升温速率为1℃/min，在温度低于21℃的范围内，损耗模量大于储存模量，说明聚合物体系处于溶胶态，在温度大于21℃的区域，储存模量大于损耗模量，同时，储存模量、储存模量与损耗模量的差值皆随着温度的升高不断增大，聚合物体系处于不断增强的凝胶态，说明Gel-MEO-UPy水凝胶具有基于低临界相转变温度的温敏溶胶凝胶转变点，这种性能可以用来达成温敏可注射方面的应用。
对本实施例制备的温敏水凝胶进行注射成胶性能的验证，结果见图7。图7A为流变仪测试得到的20℃下不同聚合物浓度溶胶的粘度随剪切速率在对数变化式升高时的变化曲线和10wt％Gel-MEO-UPy溶胶混合了四甲基罗丹明染料后注射到37℃水中成胶的照片，曲线中粘度随剪切速率升高的降低，说明了溶胶具备剪切变稀性质，1～10 1/s为肌肉注射、皮下注射或静脉注射时的剪切速率，此时溶胶的粘度不高于0.2Pa.s，大致相当于食用橄榄油的粘度；图7A中，处于室温的溶胶通过注射器注射到37℃的水中后立即形成了线型的凝胶，图7A的粘度曲线和注射照片共同说明了溶胶态良好的可注射性。图7B为20℃下10wt％Gel-MEO-UPy溶胶注射到温度为37℃的不同形状的模具后成符合模具形状的凝胶；说明了Gel-MEO-UPy水凝胶有着良好的温敏可注射性能，也说明该可注射水凝胶有良好的可塑性，对于其注射到体内充分填充不同形状的组织缺损有着重要的意义。
使用CCK-8试剂盒对本实施例制备的温敏聚合物Gel-MEO-UPy进行细胞毒性测试，结果见图8A，对本实施例应用部分制备的三维包封了骨髓间充质干细胞的温敏水凝胶利用活死染色试剂盒与CCK-8试剂盒进行细胞增殖的定性与定量表征，结果见图9与图8B。
图8A为Gel-MEO-UPy聚合物的细胞毒性，通过测定被不同Gel-MEO-UPy聚合物浓度的完全培养基(89％高糖培养基，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗溶液)孵育过48小时的骨髓间充质干细胞的细胞活力得到，细胞活力在1～5mg/mL的聚合物浓度范围内，随着聚合物浓度升高而提高，说明在聚合物在1～5mg/mL的极低的浓度下，有促进细胞增殖的作用，无细胞毒性；说明Gel-MEO-UPy聚合物对细胞增殖有促进作用，体现了其良好的生物相容性。
图9为10wt％Gel-MEO-UPy溶胶包裹骨髓间充质干细胞注射到37℃模具后成胶进行三维培养并进行活死染色实验定性表征细胞的增殖和分布，浅色区域代表活细胞，浅色区域的数量随天数增加明显增多，说明细胞随天数的增加进行着稳定的增殖，图9右下角为活死染色照片的进一步放大，展示活细胞在凝胶内的群落式的三维分布。
图8B为CCK-8实验定量表征细胞在凝胶内的增殖情况，吸光度正比于细胞数量，吸光度随培养天数增多的升高说明了细胞量对应的增多。
图9与图8B中细胞的稳定增殖和极高的存活率说明了Gel-MEO-UPy水凝胶良好的三维培养细胞的能力，说明它是一种生物相容性极好的水凝胶。
本发明Gel-MEO-UPy水凝胶在亲水环境内进行三维培养的第七天时依然能提供稳定的凝胶环境支撑细胞的三维生长，而普朗尼克水凝胶在一天内即发生崩塌。
从图3-图9可见，本发明得到的水凝胶要求具有良好的生物相容性，尤其体现在细胞易于在凝胶内部留存、黏附、增殖；该水凝胶具有实用的温敏性能，室温时流动性好，处于易于注射的溶胶态，在人体体温时呈稳定的凝胶态。
实施例2
1.温敏聚合物的合成
(1)利用明胶和甲基丙烯酸酸酐合成GelMA(甲基丙烯酸酰化明胶)
①放有4cm两头尖聚四氟乙烯磁力转子的250ml圆底烧瓶内加入10g明胶固体和100ml的0.3M(0.09M Na2CO3，0.21M NaHCO3)Na2CO3-NaHCO3碳酸氢钠水溶液，密闭容器，300rpm匀速搅拌，在40℃水浴下溶解1小时至容器内物质为淡黄色澄清液体，使用5M NaOH水溶液调节pH值为9.0；
②升温步骤①得到的明胶溶液至50℃，保持300rpm搅拌随后向其中慢速注射滴加1ml甲基丙烯酸酸酐，滴加速度为0.2ml/min；
③滴加结束后在50℃水浴，300rpm搅拌速率下充分反应2小时；
④停止反应，溶解产物，使用5M HCl水溶液调节pH为7.4，并随后在40℃水浴下溶解1小时；
⑤纯化产物，5升超纯水透析步骤④得到的液体，使用截留分子量为8000～14400的透析袋，每12小时换一次水，透析7天，7天后取出完成透析的液体，过滤，取清液；
⑥冻干步骤⑤得到的清液，得到干燥的白色固态GelMA；
酸酐在明胶上的取代度略有提高，主要提高了反应速度，减少了酸酐用量。说明缓冲液碱性的提高增加了明胶上的氨基与羟基的反应活性，加快了反应速度。
(2)利用氨基嘧啶酮和甲基丙烯酸异氰基乙酯合成UPyMA；
1)放有两头尖4cm聚四氟乙烯磁力转子的干燥密封的150ml圆底烧瓶内加入4g氨基脲嘧啶和100ml无水二甲基亚砜，300rpm下搅拌并油浴加热至170℃，随后继续搅拌至氨基脲嘧啶完全溶解；
2)移去加热，立即在步骤1)得到的氨基嘧啶酮溶液中慢速注射加入4.5g甲基丙烯酸异氰酸乙酯以形成反应体系；
3)使用冰浴对反应体系降温以发生反应，同时以500rpm的转速充分搅拌，体系内逐渐出现白色沉淀；
4)使用丙酮反复洗涤步骤3)得到的悬浊液留下白色固体，随后真空干燥除去剩余的丙酮和二甲基亚砜，得到产物白色粉末状UPyMA；
(3)购买市售的2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯作为MEO2MA；
(4)放有4cm两头尖聚四氟乙烯磁力转子的250ml圆底烧瓶内加入0.4g GelMA和100ml去离子水，40℃水浴加热，300rpm搅拌，1小时后GelMA完全溶解；加入2ml 1M的NaOH水溶液，加入0.2g UPyMA，保持搅拌，10分钟后UPyMA完全溶解，随后水浴降温至20℃；加入1mlMEO2MA，0.02g过硫酸钾，搅拌至溶解；
密封体系，插入通氮气的长针至体系液面以下，另外插短针在瓶口，20℃水浴下以300rpm搅拌，持续1小时以除净体系内的氧气，随后拔出所有针头并密封容器；
于5ml样品瓶内加入1ml去离子水，随后滴入100μl四甲基乙二胺，混匀后用通有氮气的针头伸入液面以下5分钟以除去氧气，随后立即用注射器吸出并注射进反应体系开始反应；
反应10小时后，用5L超纯水透析反应液，透析袋截留分子量为8000～14400，每6小时换一次水，透析3天，随后取出透析袋内的液体冻干，最终得到白色干态固体温敏聚合物Gel-MEO-UPy。
2.温敏可注射水凝胶的制备与应用
在室温下将温敏聚合物Gel-MEO-UPy在20℃以12wt％的固含量浸没于完全培养基中，溶胀完全并分散均匀后得到Gel-MEO-UPy完全培养基溶胶，向其中以10
实施例3
1.温敏聚合物的合成
(1)利用明胶和甲基丙烯酸酸酐合成GelMA
①放有4cm两头尖聚四氟乙烯磁力转子的250ml圆底烧瓶内加入10g明胶固体和100ml的0.2M(0.03M Na2CO3，0.17M NaHCO3)Na2CO3-NaHCO3碳酸氢钠水溶液，密闭容器，300rpm匀速搅拌，在40℃水浴下溶解1小时至容器内物质为淡黄色澄清液体，使用5M NaOH水溶液调节pH值为9.0；
②升温步骤(1)①得到的明胶溶液至50℃，保持300rpm搅拌随后向其中慢速注射滴加1ml甲基丙烯酸酸酐，滴加速度为0.2ml/min；
③滴加结束后在50℃水浴，300rpm搅拌速率下充分反应2小时(1)②得到的体系；
④停止反应，溶解产物，使用6M HCl水溶液调节pH为7.4，并随后在40℃水浴下溶解1小时；
⑤纯化产物，5升超纯水透析(1)④得到的液体，使用截留分子量为8000～14400的透析袋，每12小时换一次水，透析7天，7天后取出完成透析的液体，过滤，取清液；
⑥冻干(1)⑤得到的清液，得到干燥的白色固态GelMA；
(2)利用氨基嘧啶酮和甲基丙烯酸异氰基乙酯合成UPyMA；
①放有两头尖4cm聚四氟乙烯磁力转子的干燥密封的150ml圆底烧瓶内加入4g氨基脲嘧啶和100ml无水二甲基亚砜，300rpm下搅拌并油浴加热至170℃，随后继续搅拌至氨基脲嘧啶完全溶解；
②移去加热，立即在(2)①得到的氨基嘧啶酮溶液中慢速注射加入4.5g甲基丙烯酸异氰酸乙酯以形成反应体系；
③使用冰浴对反应体系降温以发生反应，同时以500rpm的转速充分搅拌，体系内逐渐出现白色沉淀；
④使用丙酮反复洗涤(2)③得到的悬浊液留下白色固体，随后真空干燥除去剩余的丙酮和二甲基亚砜，得到产物白色粉末状UPyMA；
(3)购买市售的2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯作为MEO2MA；
(4)①放有4cm两头尖聚四氟乙烯磁力转子的250ml圆底烧瓶内加入0.5g GelMA和100ml去离子水，40℃水浴加热，300rpm搅拌，1小时后GelMA完全溶解；
②向(4)①得到的体系内加入2ml 1M的NaOH水溶液，加入0.1g UPyMA，保持搅拌，10分钟后UPyMA完全溶解，随后水浴降温至20℃；
③向体系内加入2ml MEO2MA，0.04g过硫酸钾，搅拌至溶解；
④密封体系，插入通氮气的长针至体系液面以下，另外插短针在瓶口，20℃水浴下以300rpm搅拌，持续1小时以除净体系内的氧气，随后拔出所有针头并密封容器；
⑤于5ml样品瓶内加入1ml去离子水，随后滴入200μl四甲基乙二胺，混匀后用通有氮气的针头伸入液面以下5分钟以除去氧气，随后立即用注射器吸出并注射进反应体系开始反应；
⑥反应10小时后，用5L超纯水透析反应液，透析袋截留分子量为8000～14400，每6小时换一次水，透析3天，随后取出透析袋内的液体冻干，最终得到白色干态固体温敏聚合物Gel-MEO-UPy。
2.温敏可注射水凝胶的制备与应用
(1)将温敏聚合物Gel-MEO-UPy以15wt％的固含量分散于完全培养基内得到聚合物溶胶；
(2)将肿瘤细胞以10
(3)移入溶胶至注射工具(医用注射器)，注射到实验用裸鼠的体内的任意部位，制造肿瘤模型，七天内得到成熟的肿瘤模型。其优势在于，传统的制造肿瘤模型的方式只能将癌细胞悬液注射到血液循环充分的部位，否则模型极易建立失败，如背部皮下注射的癌细胞悬液很难形成肿瘤模型。但Gel-MEO-UPy水凝胶建立起的具有良好生物相容性和生物活性的微环境为癌细胞提供了舒适的生存条件，为其在任意部位建立起成功的肿瘤模型制造了条件。
本发明的实施方式不受以上实施例的限制，其它的在本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都属于本发明的保护范围。
一种温敏聚合物及其合成方法与温敏可注射水凝胶专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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