专利摘要

本发明提供一种抑制黑色素合成的偶联物，其对于酪氨酸酶具有很好的抑制活性，同时将偶联物制备成为化妆品后不仅对皮肤无刺激，还具有较好的美白作用。

权利要求

1.一种能够显著抑制黑色素合成的偶联物，其结构式如式II所示：

（式II）。

2.一种制备权利要求1所述偶联物的方法，偶联是通过如下条件实现的： 50m反应瓶中加入1mmol化合物，1mmol O-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脈四氟硼酸醋（TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0.5mmol) N，N-二异丙基己胺值（DIEA)，25°C揽拌1.5h后，加入0.1g多肽，25°C揽拌2h后，终止反应，使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗产物。

3.一种抑制黑色素合成的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的偶联物。

4.权利要求1所述的偶联物用于制备美白化妆品中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：其中化妆品是美白水。

6.一种美白水，其组分为权利要求1所述的偶联物0.01%，甘油3%，山梨糖醇2%，硫酸锌0.2%，柠檬水0.1%，OP-10 1%，乙醇5%，柠檬精油0.4%，尼泊金丙酯0.1%，NaOH 0.3%，去离子水添加至100mL。

7.权利要求1所述的偶联物在用于制备抑制黑色素细胞的增殖的药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抑制黑色素合成的偶联物及其在药品和化妆品中的应用。

背景技术

我国化妆品市场整体规模全球第二。随着国民经济的快速发展，2018 年赶超美国拥有世界最大的化妆品市场。护肤品是整个化妆品行业中规模最大、绝对增幅最大的子行业，其中，美白类产品受到中国消费者青睐。

当前化妆品中的美白原理主要是消除黑色素，随着皮肤生理学的发展，使人们逐渐发现了黑色素的生成原理，通过模型筛选，很多新的美白成分被发现，在化妆品里添加这些成分，它们可以从抑制黑色素生成、转移及代谢等途径来达到美白效果。跟随科学技术的进步，人们逐渐对黑色素的形成有了最新的认识。在黑色素的形成过程中，酪氨酸酶、多巴色素巨变酶、DHICA氧化酶、内皮素等起了巨大的作用。黑色素的生成机理：皮肤内黑素细胞负责生产黑色素。紫外线(尤其是290-400 nm)可以激活黑素细胞，提高酪氨酸酶的活性。在黑色素细胞中，酪氨酸(人体必需氨基酸)在酪氨酸酶的作用转变成“多巴”，多巴进一步氧化形成“多巴醌”，多巴醌再经过氧化反应形成黑色素，这些黑色素会通过基底细胞的分裂传递到表皮细胞，再通过新陈代谢排出。当新陈代谢减弱时，黑色素就会蓄积起来，形成色斑、雀斑和暗沉。除了紫外线，其他因素如皮肤炎症、压力、废气、活性氧等也会促使黑色素细胞活跃，产生过剩的黑色素。

市面上美白化妆品的种类很多，其中最主要的思路还是抑制酪氨酸酶活性、加速表皮角质细胞的代谢。下面列举几种常见的美白剂及对应的美白机理：氢醌：氢醌为一种白色针状结晶，水溶性较好，可溶于14倍的水，是一种传统且有效的美白祛斑成分，在一段时间内，氢醌是市面上的主流美白化妆品成分，它通过凝结酪氨酸酶中的氨基酸，使酶冻结而失去催化活性，然而氢醌在一定浓度下可致黑色素细胞变性、死亡。氢醌的性质不稳定，极容易被氧化。后来发现其对肌肤刺激性强，可造成刺激性或接触性皮肤炎，更甚者，若用量不当，会使皮肤产生过度脱色，导致局部反白的现象。因此，氢醌被禁用于化妆品中。后来，科学家们发现了氢醌的衍生物-熊果苷，其作用机制与氢醌类似，由于熊果苷是氢醌的糖配体，结构上对黑素细胞的毒性明显降低，但是高浓度下也会出现与氢醌类似的不良反应。曲酸及衍生物：曲酸的美白作用发现非常的偶然，在日本人们发现酿酒师的手部皮肤非常的白皙，后来经过研究发现了其中的曲酸，而我们日常食用的酱油、豆瓣酱等食物中也含有该成分。曲酸的结晶为无色棱柱形，易溶于水。曲酸的美白机理与氢醌略不同，它是通过螯合酪氨酸酶中的铜离子使络氨酸酶失活来达到美白效果。由于曲酸的不稳定性，刺激性，致敏性等，曲酸在日本禁用，在美国属于药品管理范围。因此人们开发了曲酸衍生物来克服以上缺点，曲酸的修饰方式主要有酯化和烷基化。曲酸二棕榈酸盐是常见的一种曲酸衍生物，具有性质稳定，刺激性低等特点。曲酸衍生物的美白作用机理与曲酸相同，但是显示了更好的美白效果。Vc及衍生物：很早人们就知道Vc的美容效果比较好，这得归功于Vc较好的还原性和清除自由基的能力，但是由于Vc的水溶液不稳定以及难以被皮肤吸收等特点，便使人们开发出了一系列Vc的衍生物来提高这方面的性能，常见的衍生物有Vc脂肪酸酯、Vc磷酸酯盐、Vc棕榈酸酯等，其中Vc棕榈酸酯是应用最广泛的衍生物，它是油溶性的，具有更加稳定、高效的美白特点。果酸：果酸具有很强的软化角质层的能力，通过剥落含有大量黑色素的角质细胞来使皮肤细腻、有光泽。天然的果酸主要有乳酸、苹果酸、水杨酸及其衍生物，但是研究表明，α-型的果酸对皮肤具有较强的刺激性，因此主要是开发刺激性较小的β-型果酸。内皮素拮抗剂：内皮素-1和内皮素-2是黑色素形成过程中不可缺少的2种细胞外物质，它可以从植物中提取，也可以生物发酵制备，它通过抑制络氨酸酶的活性以及抑制黑色素细胞的分裂来达到美白效果。胎盘提取物：胎盘素是一种复合物，胎盘素美白的应用历史也很悠久，它主要成份有氨基酸、酵素、激素等，虽然对胎盘中起作用的成份还不明确，但是临床上证明胎盘提取物确实具有很好的美白效果。植物提取物在化妆品上的应用，迎合了当前回归自然的号召，由于植物提取物独特的成份特点，其对络氨酸酶的抑制率高于传统的美白剂。例如，甘草提取物是较常见的植物美白成份，研究表明其中的甘草黄酮可以多途径抑制酶活性来减少黑色素生成，因此美白的效果特别好。但是价格昂贵，只有在高档化妆品里才添加。

CN103211725B公开了一种具有美白功效的植物油脂组合物化妆品及其制备方法。所述化妆品的具有美白功效的美白植物油脂全部都是植物油脂，不含任何其它化学合成油脂、矿物油和动物油等，所含的植物油脂有：香橼果皮油、红缨合耳菊枝/叶油、山茶籽油、红叶酢浆草油等。但是该发明成分复杂，制备不变，而且美白有效率也不高。

CN1311834C公开了麦角甾醇衍生物可以用于制备黑色素生成抑制剂，其抑制黑色素形成的最低浓度为0.5微克/ml，效果也有待进一步的提高。

从现有技术来看，针对美白的化妆品特别是能够高效抑制黑色素生成的化妆品仍有很大的需求空间。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明提供了一种高效的能够显著抑制黑色素合成的偶联物。

进一步的，所述的偶联物是式（I）所示的化合物与肽偶联获得。

其中式（I）的化合物结构式如下：

式（I）

所述式（I）化合物名称为5- [ [ 4- [[吗琳-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]氨基]吡嗪-2-腈。

所述肽为靶向穿膜活性肽TMT2，具体序列为RQQKRRKTWRRRQHDHIQKKKLHRRPC。

所述的靶向穿膜活性肽TMT2是申请人在前期研究发现的二个富含赖氨酸和精氨酸的多肽之一，可以在低温下穿过细胞膜，该过程不需要能量的参与。此外，肽的带正电荷的残基( 精氨酸和赖氨酸) 最开始与细胞膜上带负电荷的磷脂结合，因此能够与膜融合，形成了含有TMT2 的口袋状胶束。接着，TMT2穿过该胶束内的细胞膜朝向细胞质一侧。当这些胶束穿过膜后，它们便发生反转，释放TMT2和它的运载物进入细胞。

具体的，本发明的偶联是通过如下条件实现的：

50m反应瓶中加入1mmol化合物，1mmol O-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脈四氟硼酸醋（TBTU)，5ml DMF，氮气保护，滴加0.5mmol N，N-二异丙基己胺值（DIEA)，25℃揽拌1.5h后，加入0.1g多肽，25℃揽拌2h后，终止反应。使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗产物。

进一步的，所述偶联物的结构如式II所示：

（式II）

进一步的，本发明提供一种抑制黑色素合成的方法。

根据优选实施方案，本发明的肽-化合物偶联物以剂量依赖方式抑制黑素生成。

根据优选实施方案，本发明的肽-化合物偶联物抑制酪氨酸酶的活性。

本发明提供一种美白化妆品，其包含多肽-化合物偶联物以及合适的辅料。

附图说明

图1 偶联物处理后的流式细胞图。

图2 酪氨酸酶活性的测定结果图。

有益效果

本发明通过将化合物偶联细胞靶向活性肽之后，大大提高了化合物对于酪氨酸酶抑制活性，将偶联物制备成为化妆品后不仅对皮肤无刺激，还具有较好的美白作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。

实施例1 多肽-化合物偶联物的制备

按照CN104302635A中化合物合成路径合成本发明式（I）的化合物。将50m反应瓶中加入1mmol式（I）化合物，1mmol O-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脈四氟硼酸醋（TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0.5mmol) N，N-二异丙基己胺值（DIEA)，25℃揽拌1.5h后，加入0.1g靶向穿膜活性肽TMT2，25℃揽拌2h后，终止反应。使用MS-IT-TOF确定分子量正确后，使用HPLC纯化粗产物。通过结构分析得到偶联后的偶联物结构式如下所示：

。

实施例2 MTT法检测B16细胞的增殖

取对数生长期B16细胞，用0.05%胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA溶液消化后，以新鲜培养液配成密度为6×10³ 个/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔180 μL，于CO₂培养箱中孵育过夜。每个样品设置4个样品质量浓度梯度，每个梯度重复3次。在96孔细胞培养板中，加入样品稀释液，并以PBS补充至20 μL，使细胞培养板中的样品(分别为化合物、多肽、偶联物)终质量浓度分别为1ug/L ，1 mg/L，10 mg/L，100 mg /L；空白对照孔加入20 μLPBS，混匀。将细胞板置于CO₂培养箱中孵育48 h后，吸去培养液，每孔加入100 μL PBS、5mg/mL的MTT溶液10 μL，再将其置于CO₂培养箱中孵育4-6 h，每孔加入100 μL SDS溶液后继续于CO₂培养箱中孵育过夜。用酶标仪于570 nm处测定其吸光度，计算细胞增殖抑制率（%）。结果如下表1所示：

注：与同质量浓度化合物比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

从表1可以看出，偶联药物与同质量浓度化合物对B16细胞增殖抑制率比较，都有显著性差异（P＜0.05）；偶联物的细胞抑制效率随着浓度提高而显著提高，通过分析主要原因可能是在多肽与化合物偶联后，多肽的带正电荷的残基( 精氨酸和赖氨酸) 最开始与细胞膜上带负电荷的磷脂结合，因此能够与膜融合，形成了含有TMT2 的口袋状胶束。接着，TMT2穿过该胶束内的细胞膜朝向细胞质一侧。当这些胶束穿过膜后，它们便发生反转，释放TMT 2和它的运载物进入细胞。从而使得药物能够进入到细胞中行使其相应的功能，而不是仅仅在培养基中没有进入到细胞内，无法真正的行使药效。

实施例3 流式细胞仪检测细胞凋亡：PI单染色法

取对数生长期B16细胞，用0.05%胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA溶液消化后，以新鲜培养液配成密度为6×10³ 个/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔180 μL，于CO₂培养箱中孵育过夜。每个样品设置4个样品质量浓度梯度，每个梯度重复3次。在96孔细胞培养板中，加入样品稀释液，并以PBS补充至20 μL，使细胞培养板中的样品(分别为化合物、多肽、偶联物)终质量浓度分别为1ug/L ，1 mg/L，10 mg/L，100 mg /L；空白对照孔加入20 μLPBS，混匀。将细胞板置于CO₂培养箱中孵育48 h后，吸去培养液，500 r/min离心10min，弃去培养液。3ml PBS洗涤1次。离心去除PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。用1ml PI染液染色，4℃避光30min。流式细胞仪检测。从说明书附图1的结果可以看出：当偶联物浓度为1ug /L，凋亡细胞与正常细胞相比占比为2.40%。而随着处理偶联物的浓度增加，其细胞凋亡比例也随之增加，浓度为100mg/L后，细胞凋亡比例达到96.1%，说明该化学物能够大程度的抑制黑色素细胞的增殖。

实施例4 B16细胞内酪氨酸酶活性的测定

取对数生长期B16细胞，用0.05%胰蛋白酶+0.53 mmol/LEDTA溶液消化后，以新鲜培养液配成密度为6×10³ 个/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔180 μL。细胞板置于CO₂培养箱中孵育过夜后，每孔细胞加入终浓度为1 mmol/L的茶碱。每个样品设置4个样品浓度梯度。在96孔细胞培养板中，加入样品稀释液，并以PBS补充至20 μL，使细胞培养板中的化合物、多肽偶联物终质量浓度分别为1ug /L，1 mg/L，10 mg/L，100 mg /L。空白对照孔加入20μLPBS，混匀。细胞板置于CO₂培养箱中孵育48 h后，吸去培养液，加入100 μL体积分数为1%的Triton X-100溶液，-80 ℃下放置60 min。取出细胞板恢复至室温后，取10 μL培养液用BCA法测定蛋白含量。另取80 μL培养液，加入0.1% L-Dopa溶液50 μL，37 ℃下孵育2h。用酶标仪于490 nm处测定吸光度并计算酪氨酸酶活性抑制率。当各种样品的浓度为100mg /L时，酪氨酸酶活性抑制率结果如附图2所示：偶联物对于酪氨酸酶活性抑制率达到接近96.3%，而化合物只有16.23%，多肽只有10%，这充分说明偶联物具有较好的效果。

实施例5 化妆品的安全性评价

选取偶联物0.01%，甘油3%，山梨糖醇2%，硫酸锌0.2%，柠檬水0.1%，OP-10 1%，乙醇5%，柠檬精油0.4%，尼泊金丙酯0.1%，NaOH 0.3%，去离子水添加至100mL，按照常规润肤水的制备步骤制备得到相应润肤水。

选择5 名志愿者作为受试对象，直接涂约0.5 mL上述润肤水受试物于皮肤上，并覆盖上两层纱布( 2. 5 cm × 2. 5 cm) 和一层玻璃纸，然后以无刺激性绷带和胶布固定。另一侧皮肤则作为对照。进行封闭试验，敷用4 h。 结束后的残留物用无刺激性溶剂或温水清除，清除受试物后的1、24、48 和72 h 观察涂抹部位的皮肤反应，对皮肤反应的评分按表2 进行，刺激强度以各观察时间点最大积分的平均值进行评价。

表2皮肤刺激性反应评价表

皮肤刺激强度分级：0 ～ ＜ 0. 5 无刺激性；0. 5 ～ ＜ 2. 0 轻刺激性；2. 0 ～＜ 6. 0 中刺激性；6. 0 ～ 8. 0 强刺激性。结果显示，本发明制备得到的润肤水皮肤刺激强度分级为无刺激性强度，适合人类皮肤使用。

实施例6 美白效果评价

将上述实施例的美白润肤水对年龄在20-40岁之间，肤质分别为油性、中干性、混合型、敏感性的志愿者共30名进行实验检测，测试周期为28天，每天涂抹两次。试用结果见表3。

表3

从表3中的数据可以看出，美白有效率达93.3%左右。

上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

抑制黑色素合成的偶联物II及其在药品和化妆品中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。