专利摘要

本发明公开了一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。本发明多肽由22个氨基酸组成，其氨基酸序列SEQIDNo.1所示。本发明多肽利用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，分子量为2448.8Da。本具有特异与聚糖链结合的活性，可用来设计与糖生物学研究的工具或用来设计相关药物制剂。

权利要求

1.一种聚糖结合多肽，其特征在于，所述聚糖结合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的聚糖结合多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为固相化学合成，包括以下步骤：

(1)将Fmoc保护氨基酸在2-CL树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链；

(2)将步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下，反应2-4小时，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品；

(3)步骤(2)得到的多肽粗品经纯化，得到多肽纯品。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中将Fmoc保护氨基酸在2-CL-树脂上偶合并去除Fmoc保护基的方法为：称取1g 2-CL树脂放入反应器中，加入10mLDCM，加入4mmol Fmoc保护氨基酸和1mmol DIEA，用氮气鼓泡反应3h，然后加入1mL甲醇和1mL DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净，加入2-4mL哌啶去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的裂解液为87.5％的TFA水溶液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中滤液的纯化包括如下步骤：滤液中加入冰乙醚使多肽沉降出来，离心得到多肽粗品。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中多肽粗品纯化的方法包括高效液相色谱法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽及其应用，特别涉及一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。

背景技术

聚糖是组成机体组织细胞的重要生物大分子之一。除了糖原在细胞内作为葡萄糖储存形式参与能量代谢外，聚糖常与蛋白质、或脂类以共价键结合，以糖蛋白或糖脂的形式分布于细胞表面。因其结构及细胞表面分布这一特征，聚糖具有非常重要的生物学功能，其主要作用是参与细胞表面事件，包括细胞与细胞外基质分子、细胞与细胞之间的识别结合以及对外环境的应答等。因此，聚糖的功能牵涉到机体的胚胎发育、神经发生、肿瘤的转移、免疫反应以及表面抗原如血型抗原的形成等。干预聚糖结构或合成将影响其功能。这也是目前研究聚糖功能或设计相应药物的理论基础。

目前，干预或研究聚糖功能最常用的方法是通过基因敲除技术，抑制相应糖基转移酶的表达。但这一方式只能用来在体外研究聚糖的功能，以目前的技术，远不能应用于临床治疗。再一个方法就是寻找能与聚糖链特异结合的分子，以阻断聚糖链的功能。其中应用最多的是凝集素。凝集素是能与某种特异结构糖链识别结合的蛋白质或糖蛋白。但凝集素是来源于植物或动物的大分子，具有抗原性。另外凝集素具有凝集细胞活性，对机体是毒素，故只能做为糖生物学研究的工具，不能应用于临床治疗。因此，寻找无免疫原性，安全无毒性的、能与聚糖特异结合的分子是这一研究领域的重要内容。

多肽(50个以下氨基酸组成的肽链)具有分子量小、低毒性、高活性、无免疫原性，容易制备等。但目前为止，尚没有发现能与聚糖特异性结合的多肽。

发明内容

在长期从事多肽结构及功能的经验基础上，经反复体外和体内实验，设计出一种能与聚糖特异性结合的多肽。体外实验证明，该多肽可与蛋白结合聚糖和脂结合聚糖特异的识别结合。体内实验安全无毒性。

本发明的目的是基于多肽分子设计理论和固相化学合成技术，提供一种聚糖特异性结合的多肽。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供一种聚糖结合多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明多肽由22个氨基酸组成，分子量为2446.8Da。

本发明还提供所述的多肽在制备干预聚糖结构或合成的药物中的应用。所述制剂可以为本发明所述的多肽，也可以为含有本发明多肽和其他药学上可允许的辅料的制剂。

本发明还提供所述的聚糖结合多肽的制备方法，该多肽用固相化学合成法制备得到，包括以下步骤：

(1)将Fmoc保护氨基酸在2-CL树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链；

(2)将步骤(1)得到的多肽链中加入裂解液，在25～35℃温度下，反应2-4小时，抽滤，滤液经纯化得到多肽粗品；

(3)步骤(2)得到的多肽粗品经纯化，得到多肽纯品。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的将Fmoc保护氨基酸在2-CL-树脂上偶合并去除Fmoc保护基的方法为：称取1g 2-CL树脂放入反应器中，加入10mLDCM，加入4mmol Fmoc保护氨基酸和1mmol DIEA，用氮气鼓泡反应3h，然后加入1mL甲醇和1mL DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净，加入2-4mL哌啶去除Fmoc保护基，得连接有树脂的多肽链。

进一步地，在上述技术方案中，步骤(2)中所述的裂解液为87.5％的TFA水溶液。

进一步地，在上述技术方案中，步骤(2)中所述的滤液的纯化包括如下步骤：滤液中加入冰乙醚使多肽沉降出来，离心得到多肽粗品。

进一步地，在上述技术方案中，步骤(3)中所述的纯化方法包括高效液相色谱法。

对于上述获得的本发明的多肽纯品，用质谱仪检测该序列分子量的正确性。

经体内外实验证明，该多肽可与蛋白结合聚糖和脂结合聚糖特异的识别结合。对机体安全无毒性。

发明有益效果

本发明公开一种由22个氨基酸组成的多肽，其特点是分子量小，是目前发现的第一个可与聚糖特异性结合的多肽。该多肽经与荧光、生物素或酶结合，可做为特异的分子探针，在聚糖生物学研究中，用来检测细胞糖链表达。因其分子量小，无免疫原性，安全无毒，可用来设计开发治疗相关疾病如抑制肿瘤转移、抑制病毒、调节免疫等的药物制剂。本发明的多肽已被证明可以有效地抑制多种不同组织来源的肿瘤细胞在体内的肺转移灶的形成。且安全，无毒副作用。

附图说明

图1为本发明多肽的HPLC检测图谱。

图2为本发明多肽的质谱检测图谱。

图3本发明多肽与细胞膜糖蛋白聚糖链识别结合(A：考马斯亮蓝染色图谱；B：本发明多肽结合显色图谱；其中，M：分子量标准；1：胞膜蛋白样品；2：胞浆蛋白样品)。

图4本发明多肽与糖蛋白标准品结合(A：考马斯亮蓝染色图谱；B：糖蛋白染色试剂盒染色图谱；C：本发明多肽结合显色图谱；其中，1：糖蛋白标准品；2、3：非糖蛋白标准品)。

图5本发明多肽与包被到硅胶小球上的鞘糖脂糖链结合(A：对照组；B：磷脂包被的硅胶小球；C：糖鞘脂包被的硅胶小球)。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

本发明中所出现的缩略语的说明：

2-CL树脂：二氯树脂、Fmoc：9-芴甲氧羰基、DMF：二甲基甲酰胺、DCM：二氯甲烷、HOBT：1-羟基苯并三唑、DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺、DIEA：N,N-二异丙基乙胺吡啶、PIP：哌啶、TFA：三氟乙酸。

实施例1制备本发明多肽

以下制备多肽的2-CL树脂，Fmoc保护氨基酸及缩合试剂、裂解试剂均购买于国内生化试剂公司。

1.1本发明多肽树脂的合成

本发明多肽树脂为：

Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Phe-Ile-Ser(tbu)-Val-Leu-Gln(trt)-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Leu-Arg(Pbf)-Met-Gly-Ala-Tyr(tbu)-2-CL树脂。

使用2-CL树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得本发明多肽树脂。本实施例所使用的保护氨基酸从树脂起算第1至第22个氨基酸相对应的保护氨基酸如下表所示：

表1.保护氨基酸

1.2接入第22～1个氨基酸。

1.2.1接入第22个氨基酸。

制备从C端到N端逐个进行。称取1g二氯树脂放入反应器中，加入10mL DCM，加入4mmol Fmoc-Tyr(tbu)(L型酪氨酸)和1mmol的DIEA；用氮气鼓泡反应3h。然后加入1mL甲醇，1mL DIEA，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、DCM洗净。加入2-4ml哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测。

1.2.2接入第21～1个氨基酸

采用上述同样方法，依次接入表1中对应的第21～1个保护氨基酸，接完所有保护氨基酸后，即得到的Fmoc-多肽树脂，加入适量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，过滤洗涤后，即得本发明多肽树脂。

1.3本发明多肽粗品的制备

向取得的多肽树脂中加入87.5％的TFA水溶液作为裂解试剂，温度控制30度，反应三个小时；然后抽滤得到液体，用冰乙醚沉降出来，氮气吹去大部分的溶剂后，向残液中倒人20mL无水乙醚，出现白色絮状沉淀，在4000rpm转速，5℃条件下离心5分钟，倒去溶剂乙醚，向沉淀中加入无水乙醚20mL，振荡，同样条件下离心5分钟，再重复一次，除去大部分的杂质。沉淀真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体，得本发明多肽粗品的固体粗品。

1.4本发明多肽粗品的纯化

将冻干的粗品多肽，溶于0.1％TFA/乙腈溶液进行高效液相色谱(HPLC)分离。HPLC在Waters-600E多通道系统上进行，选用Gemini-NX 10μm，C18，100A，4.6×250mm半制备柱，Waters-2487紫外检测器(L＝215和254nm)，用0.1％TFA/乙腈溶液进行梯度洗脱。收集主要峰产物，减压旋蒸除去HPLC的样品峰中的乙腈。在冷冻干燥机上冷冻干燥，获得目标产物多肽，纯化的多肽质谱图见图1，多肽纯度为98.89％。

1.5本发明多肽纯品的质谱鉴定

最终产物经过ESI-MS方法鉴定。本发明多肽的理论分子量为2446.8Da(100％M+H)，质谱条件：样品溶解于甲醇，通过Cole-Panner 74900注射泵打入电喷雾质谱。电喷雾质谱条件：喷雾器压力为7.0或11.0Psi，干燥器(N)流速为4.0L或8.0L/分钟，温度为300℃。喷雾针电压为4.0kV。质谱分析表明，纯化多肽的分子量为2446.8Da，其分子量与计算值相符。纯化的多肽质谱图见图2。

上述制备得到的本发明多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

KKKKSFISVLQTSSSSLRMGAY，即H-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Phe-Ile-Ser-Val-Leu-Gln-Thr-Ser-Ser-Ser-Ser-Leu-Arg-Met-Gly-Ala-Tyr-OH

实施例2本发明多肽与细胞膜糖蛋白聚糖链识别结合

细胞膜蛋白和胞浆蛋白的制备(胞浆蛋白不含聚糖结构，膜蛋白均为糖蛋白)：SW620肿瘤细胞(ATCC号，CCL-227TM)于含10％胎牛血清的L-15培养基培养。离心收集细胞，加入500μL细胞渗透液(10％Digitonin生理盐水)。室温下于摇床上缓慢摇动30min。500rpm离心5min；吸走上清(为胞浆蛋白样品)，向沉淀加入200μL细胞裂解液，为膜蛋白样品。

SDS-电泳分离胞浆蛋白和膜蛋白：用常规SDS-电泳分离胞浆蛋白和膜蛋白。上样顺序自左至右为:分子量标准(Marker)、胞膜蛋白和胞浆蛋白。同样的顺序做俩份。电泳完毕，将一份凝胶切割下来用考马斯亮蓝染色、脱色以获得总蛋白条带(图3A)；另一份行转移电泳。转膜后于含5％脱脂奶粉TBST(Tris-H2Cl-吐温缓冲液)中封闭。封闭后依次结合生物素标记本发明多肽、碱性磷酸酶标记的卵白素。最后以碱性磷酸酶底物BCIP/NIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝)显色(图3B)。结果显示，生物素标记本发明多肽只与膜蛋白结合。上述结果说明本发明多肽可特异的识别结合糖蛋白糖链。

实施例3本发明多肽与糖蛋白标准识别结合

糖蛋白与非糖蛋白标准品(Pierce Glycoprotein Staining Kit,ThermoScientific)行常规SDS-电泳分离，相同样品同时做三份。电泳完毕后。采用不同方式进行染色。图4A是以考马斯亮蓝染色的图谱，以显示所有蛋白条带。图4B是以常规糖蛋白染色技术染色图谱，用糖蛋白染色试剂盒(Pierce Glycoprotein Staining Kit,ThermoScientific)按照说明操作。结果显示仅有糖蛋白标准品显色。图4C为本发明多肽染色图谱。SDS-电泳分离后行转移电泳。转膜后于含5％脱脂奶粉TBST(Tris-H2Cl-吐温缓冲液)中封闭。封闭后依次结合生物素标记本发明多肽、碱性磷酸酶标记的卵白素。最后以碱性磷酸酶底物BCIP/NIP显色。结果证明，本发明多肽只使糖蛋白标准品显色。

实施例4本发明多肽与鞘糖脂糖链结合。

细胞表面除蛋白质含聚糖链外，还有一部分与脂类结合以糖脂的形式存在。因此，本实施例进行了鞘糖脂糖链结合实验。

细胞总脂提取以及磷脂与鞘糖脂的分离：收集细胞，沉淀加入10倍体积的氯仿:甲醇:水(8:4:3)吹打混匀。室温静置2h，3000RPM离心10分钟。吸取水溶性上相，氮气吹干为鞘糖脂样品。吸取有机下相，氮气吹干为磷脂和其他脂类样品。

硅胶微球包被：取适量硅胶(Itrobeads)，置于烘箱中，140℃活化1h。活化后的硅胶浸泡到氯仿：甲醇2:1中。将上述提取的鞘糖脂和磷脂样品溶于氯仿：甲醇2:1中。将各样品150μL加入活化硅胶中，在37℃摇床上摇动2h。对照组只加入150μL氯仿：甲醇(2:1)。用氮气吹干溶剂，向各组硅胶微球加入含5％脱脂奶粉的PBST(磷酸盐-吐温缓冲液)封闭液，于37℃摇床封闭2h。然后依次与生物素标记的本发明多肽、FITC-Streptavidin(异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素)结合。最后在倒置荧光镜下观察拍照。结果如图5所示，本发明多肽只与鞘糖脂包被的硅胶微球结合。

以上所有结果证实本发明多肽可与细胞表面聚糖链特异结合。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学

<120> 一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Lys Lys Lys Ser Phe Ile Ser Val Leu Gln Thr Ser Ser Ser Ser

1 5 1015

Leu Arg Met Gly Ala Tyr

20

一种聚糖结合多肽及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。