专利摘要

本发明提供了一种耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌及其应用，属于生物工程技术在微生物采油中的应用。本发明的基因工程菌是保藏编号为CGMCC No.3909的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，该基因工程菌的受体菌株为一株不耐高温、可在37℃时产胞外水不溶性多糖的JD菌(Enterobacter sp.)，供体菌为嗜热菌GW菌(Geobacillus kaustophilus)，本发明通过电击转化法将GW菌的基因组DNA转移至JD菌中，得到可在50℃以上高温条件下产生胞外水不溶性多糖的基因工程菌，该基因工程菌可用于高温油藏的调剖，通过对高渗透层进行选择性封堵，达到提高原油采收率的目的，本发明还为微生物采油所用菌株适用范围的扩大提供了有效的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术在微生物采油育种中的应用，具体涉及一种利用电击转化法构建的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，以及该基因工程菌在选择性封堵高温油藏高渗透层、提高其原油采收率中的应用。

背景技术

在各种能源需求量日益增加的今天，全世界对石油开采空前关注，寻找既有效又廉价的三次采油新技术是各国一直探索的目标。多年的经验证明，必须选择最有效的三次采油方法，才能保证在有限的基本建设投资条件下最大限度地采出原油。油田开发进入中后期，增产挖潜的难度不断加大，仅靠注水开发已很难提高原油采收率。

微生物采油法通常是指向油藏注入合适的菌种及营养物，使菌株在油藏中繁殖，代谢石油，产生气体或活性物质，降低油水界面张力，以提高石油采收率。微生物提高原油采收率(Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR)是继热力驱、化学驱、聚合物驱等传统方法之后的利用微生物的有益活动及代谢产物来提高原油采收率的一项综合性技术。与其他三次采油技术相比，MEOR具有适用范围广、工艺简单、投资少、见效快、功能多、费用低、不损伤油层和无污染等优点，是目前很具发展前景的一项提高原油采收率的技术。

我国于1955年开始微生物勘探研究。20世纪60年代，胜利油田和新疆油田开展过短期的微生物采油技术研究工作；大庆油田在“七五”到“九五”期间的相关研究和试验取得一定进展；20世纪80年代末至90年代初，中国科学院与吉林油田合作开展单井吞吐技术研究和试验，一些高校和科研院所单独或与油田合作开展室内研究和现场试验；20世纪90年代初，国外(主要是美国)公司为国内微生物采油提供技术服务，主要进行井筒处理或单井吞吐。微生物采油的大部分现场试验取得成功，引起了油田重视，特别是一些进入开发后期的老油田。

微生物提高原油采收率的真正成功或突破的关键在于“超级菌”的组建，因此，培养较强竞争力的基因工程菌是现代微生物采油技术的主要目标之一。从自然界筛选得到的野生菌种性能各异，很难同时既具有优良驱油性能，又具有很好的环境适应性，其矿场应用范围也往往因此受到很大的限制。利用基因工程，可针对性地培养有利菌株，拓宽微生物采油的菌种资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温产胞外水不溶性多糖的基因工程菌，该菌株能够在高温下产生胞外水不溶性多糖。

本发明的另一目的在于提供利用所述的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌产水不溶性多糖的方法，以及所生产得到的水不溶性多糖。

本发明的另一目的在于提供所述的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌在选择性封堵高温油藏的高渗透层、调剖和/或提高高温油藏的高渗透层的原油采收率中的应用。

本发明提供了一种耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，本发明中将其命名为GJ，其具有在高温下高产胞外水不溶性多糖的能力。根据本发明的具体实施方案，本发明的该基因工程菌GJ是通过提取供体菌嗜热菌Geobacillus kaustophilus的基因组DNA，利用电击转化法将其转移至受体菌肠杆菌属Enterobacter sp.菌中而得到的。

本发明中所述的受体菌Enterobacter sp.(根据本发明的具体实施方案，是从吉林油田采集的水样中筛选得到的一株Enterobacter sp.菌，命名为JD菌)，在37℃时够以单糖为碳源代谢产生胞外水不溶性多糖，这种水不溶性聚合物吸水性很强，湿重是干重的200倍。矿场先导试验表明JD菌可以对高渗透油藏进行选择性封堵，但是其代谢产生胞外水不溶性多糖的性能受环境温度影响较大，当温度超过40℃时，难以形成多糖聚合物，不能应用于温度较高的油藏。

本发明中所述的供体菌Geobacillus kaustophilus，是从大庆高温油田采出水中分离得到的一株嗜热菌(命名为GW菌)，其最适温度60℃～70℃，但不具有产胞外水不溶多糖的性状。

本发明旨在提高JD菌代谢产生胞外水不溶性多糖的耐温性能，通过提取GW的基因组DNA，利用电击转化法将其转移至JD菌中，得到一株工程菌，本发明命名为GJ，该基因工程菌GJ可在温度低于56℃条件下利用废糖蜜稳定代谢产生胞外水不溶性多糖，当培养温度为50℃时所产胞外水不溶性多糖的干重为受体菌在37℃所产胞外水不溶性多糖干重的2～3倍。本发明的基因工程菌GJ产胞外水不溶性多糖温度低于56℃，pH 6～8，可耐受30000mg/L盐浓度。

本发明的工程菌菌株GJ已于2010年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.3909。

本发明还提供了一种耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌制剂，该基因工程菌制剂中含有本发明的保藏编号为CGMCC No.3909的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，可以是固态菌制剂，或是液态菌制剂或者含活菌的发酵培养液的形式。

本发明还提供了一种利用本发明所述基因工程菌GJ或基因工程菌制剂生产胞外水不溶性多糖的方法，该方法包括：将本发明所述的基因工程菌或基因工程菌制剂在发酵培养基中培养，产生胞外水不溶性多糖。根据本发明的具体实施方案，所述基因工程菌产糖最优发酵培养基组分为：废糖蜜2％～4％(V/V)，(NH₄)₂PO₄0.05％～0.1％(W/V)，NaCl5000～30000mg/L；产胞外多糖条件为：pH 6～8，温度低于58℃，在温度低至15℃的环境下也能稳定地产胞外水不溶性多糖，优选的产胞外水不溶性多糖的温度为20～56℃，更优选为40～56℃。本发明的基因工程菌GJ具有较高的产胞外水不溶性多糖的能力，且所产胞外水不溶性多糖比野生菌JD所产水不溶性多糖更难以水解，在驱油过程中将更优于野生菌的效果。

本发明还提供了一种水不溶性多糖，其是利用本发明所述基因工程菌GJ或基因工程菌制剂得到的。

本发明还提供了所述的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的基因工程菌制剂，或所述的水不溶性多糖，在微生物采油中的应用。

具体地，本发明提供了所述的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的基因工程菌制剂，或所述的水不溶性多糖，在选择性封堵高温油藏的高渗透层中的应用。

本发明还提供了所述的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的基因工程菌制剂，或所述的水不溶性多糖，在提高原油采收率特别是高温油藏的高渗透层的原油采收率中的应用。

本发明还提供了所述的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，或所述的基因工程菌制剂，在高温调剖中的应用。本发明的基因工程菌具有良好的耐高温特性，可以用作高温油藏调剖菌。

根据本发明的具体实施方案，在具体应用时，以所述基因工程菌GJ的发酵液(培养至对数生长期)的5％的稀释菌液计，是向高渗透层中注入0.5～2PV的稀释菌液，培养24小时以上，达到所述的选择性封堵高温油藏的高渗透层、提高高温油藏的高渗透层的原油采收率的效果。

在本发明的一具体实施方案中，利用本发明的基因工程菌GJ对人造岩芯进行选择性封堵的物理模拟试验，具体操作为：(1)地层水驱人造岩芯，测封堵前岩芯的驱替压力；(2)注入用发酵培养基稀释5％浓度的菌液(培养至对数生长期后稀释)0.5～2PV左右，20～56℃恒温培养至少24小时，通常是培养72h左右；(3)再次以地层水驱岩芯，测封堵后岩芯的驱替压力。通过基因工程菌GJ作用前后岩芯驱替压力的变化得出基因工程菌GJ对高渗透层的封堵效果，试验证明本发明的基因工程菌GJ可选择性封堵高温油藏的高渗透层，具有良好的封堵效果。

在本发明的另一具体实施方案中，利用本发明的基因工程菌GJ进行提高原油采收率的物理模拟试验，具体操作为：(1)岩芯抽真空，饱和地层水；(2)将岩芯饱和油，至岩芯中的束缚水饱和，记录排出的水的体积，置于20～56℃恒温箱中老化24小时；(3)用地层水驱油至含水量达到98％，记录该过程中的压力变化，及排出液体的总液量和其中的含水量；(4)向岩芯中注菌液，活化的GJ菌液(培养至对数生长期)用发酵液体培养基稀释20倍后注入到岩芯中，注入体积约0.5～2PV，20～56℃恒温培养至少24小时，通常培养72h左右；(5)后续水驱至连续含水率98％以上。记录该过程中的压力变化，及排出液体的总液量和其中的含水量，以此计算基因工程菌GJ提高原油采收率的效率。试验证明本发明的基因工程菌GJ可有效提高高温油藏的高渗透层的原油采收率。

综上所述，本发明通过电击转化法将GW菌的基因组DNA转移至JD菌中，得到可在50℃以上高温条件下产生胞外水不溶性多糖的基因工程菌，该基因工程菌可用于高温油藏的调剖，通过对高渗透层进行选择性封堵，达到提高原油采收率的目的，本发明还为微生物采油所用菌株适用范围的扩大提供了有效的方法。

附图说明

图1为JD胞外水不溶性多糖酶解液液相色谱图。

图2为GJ胞外水不溶性多糖酶解液液相色谱。

图3为JD及GJ在不同盐浓度条件下所产胞外水不溶性多糖干重图表。

图4为GJ在不同pH条件下所产胞外水不溶性多糖干重图表。

图5为GJ在不同温度条件下所产胞外水不溶性多糖干重图表。

图6为人造岩芯物理模拟试验装置示意图。

图7为GJ封堵试验驱替过程中压力变化图表。

图8为GJ提高采收率试验过程中采收率和含水率变化图表。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2010年6月4日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏编号：CGMCC No.3909；

分类命名：肠杆菌属(Enterobacter sp.)。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的基因工程菌GJ及特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

实施例1、基因工程菌的构建

第一步：亲本菌株的筛选

受体菌JD的筛选方法为：按照常规的菌株筛选方法，将从吉林油田采集的水样稀释10000倍后，涂布到含4％(v/v)糖蜜的琼脂平板上，30℃培养24h，将分离的各种微生物单菌落接到装有50mL 4％糖蜜液体培养基中，30℃静置厌氧培养1天，判断不溶性聚合物的产生状况，经过多次分离、纯化，获得一株产水不溶性聚合物的JD菌。该菌株可以在温度低于37℃条件下利用单糖合成胞外水不溶性多糖。

供体菌GW的筛选方法为：按照常规的菌株筛选方法，将大庆高温油田采出水稀释10000倍后涂布LB平板，70℃培养24h，平板上获得的单菌落经多次分离纯化后的到一株耐高温的菌株GW，该菌株可在60℃～70℃温度范围内生长。

第二步：GW基因组DNA的提取

以-70℃保存的GW菌株涂布LB平板培养基，70℃培养12h后挑平板上的单菌落接种5mL的LB液体培养基，70℃、150rpm振荡培养12h后取1.5mL的发酵液，12000rpm离心1min。沉淀物加入567μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg·mL^-1的蛋白酶k，混匀后于37℃温育1h。然后加入100μL 5mol·L^-1NaCl充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min。加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，12000rpm离心5min。将上清液转入一个新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)后混匀，12000rpm离心5min。将上清液转入新离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30min。12000rpm离心10min，弃上清，每管加入1mL预冷的70％乙醇洗涤沉淀2次。12000rpm离心5min，弃上清，室温自然干燥5min。每管加入50μL灭菌的TE缓冲夜，溶解DNA。

第三步：JD感受态细胞的制备

以-70℃保存的JD菌株接种完全培养基平板，37℃静止培养24h后挑单菌落接种LB液体培养基，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6。将10％的甘油、菌液置于冰上冰浴30min。取1mL菌液于13000rpm离心30s，弃上清，加入1mL 10％的甘油混匀，冰浴5min。13000rpm离心30s，弃上清，加入1mL10％的甘油混匀，冰浴5min。13000rpm离心30s，弃上清，加入1mL10％的甘油混匀，冰浴5min。13000rpm离心30s，弃上清，加入300μL10％的甘油，冰浴备用。

第四步：基因工程菌的获得

60μL新鲜制备(或冻融)的JD感受态细胞中加入1μL GW染色体DNA(浓度150ng·μL^-1～200ng·μL^-1)，吹打悬浮，冰上放置备用。取出浸泡在70％乙醇中的电转杯，紫外线照射2h，冰上预冷10min。将细菌与DNA混合物转移至预冷的电转化杯中，擦干电转杯外的冷凝水和雾气。2mm电转杯采用2.8kV～3.0kV，4.0ms～5.9ms电击一次。立即向杯中加入600μL LB+1％葡萄糖培养液，吹吸数次，转移至无菌的1.5mL离心管，37℃100rpm预培养2h后转至在含Amp的LB平板上，50℃正置2h后倒置培养。挑选单菌落接种含有1％葡萄糖的LB液体培养基，50℃静置培养，以液体培养基中是否产生胞外水不溶性多糖为评价条件，筛选获得一株耐高温产胞外水不溶性多糖的基因工程菌，本发明中命名为GJ。该基因工程菌菌株GJ已于2010年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.3909。

实施例2、JD菌与基因工程菌胞外水不溶性多糖水解产物比较

将JD菌与基因工程菌GJ接种含有1％(M/V)葡萄糖的LB培养基培养至产胞外水不溶性多糖结束时，将发酵液在以3000rpm速度离心20min后去上清，取离心沉淀物加入2mL 4％NaOH溶液，吹打悬浮，100℃沸水浴30min去除菌体蛋白，再离心取沉淀，加入适量中性洗涤液在100℃的水浴中加热1h以除去沉淀物质中的杂糖和脂类等杂质，用去离子水反复冲洗，干燥后加入三分之一胞外水不溶性多糖重量的纤维素酶，加入10mL柠檬酸缓冲液悬浮，置于50℃水浴中水解48h。取水解液以10000rpm离心5min，取1mL上清液作液相色谱，分析二者的胞外水不溶性多糖组成差异。

JD菌胞外水不溶性多糖水解产物液相色谱结果见图1；实施例1获得的基因工程菌GJ所产的胞外水不溶性多糖水解产物液相色谱结果见图2。从结果的对比可知，二者胞外水不溶性多糖组成成分大致相同，且基因工程菌GJ的胞外水不溶性多糖比JD菌更难以水解，在驱油过程中将更优于野生菌的效果。

实施例3、盐浓度对基因工程菌GJ产胞外水不溶性多糖的影响

培养基为：糖蜜4％(V/V)，(NH₄)₂HPO₄ 0.1％(W/V)，NaCl浓度梯度分别为15000mg/L、20000mg/L、25000mg/L、30000mg/L，接种已活化的JD、GJ，接种量为4％，基因工程菌GJ的培养温度为50℃，JD的培养温度为37℃，静止培养5天。

培养结束后，滤纸过滤获得胞外水不溶性多糖，干燥后称重。盐浓度对基因工程菌GJ产胞外水不溶性多糖的影响结果见图3，基因工程菌GJ在30000mg/L高盐浓度下仍可以产多糖，且产糖量较高，平均胞外水不溶性多糖产量是37℃培养JD菌的三倍。

实施例4、pH对基因工程菌GJ产胞外水不溶性多糖的影响

发酵培养基为：糖蜜4％(V/V)，(NH₄)₂HPO₄ 0.1％(W/V)，NaCl 15000mg/L。以20g/L的NaOH溶液和5mol/L的盐酸调pH值分别为3.96、5.00、6.06、7.07、7.98、8.96、9.76，每个梯度设两个平行样，30mL发酵液体系，培养温度为50℃，接种已活化的GJ，接种量为2.5％(V/V)，静止培养3天。

培养结束后，滤纸过滤获得胞外水不溶性多糖，干燥后称重。pH对基因工程菌GJ产胞外水不溶性多糖的影响结果见图4，GJ对酸碱的耐受范围较大，pH5.00和9.76时胞外水不溶性多糖量均可达到最适条件的一半，其最适产胞外水不溶性多糖的酸碱条件为pH7.0～8.0。

实施例5、温度对基因工程菌GJ产胞外水不溶性多糖的影响

发酵培养基组分：糖蜜4％(V/V)，(NH₄)₂HPO₄ 0.1％(W/V)，NaCl 15000mg/L。接种已活化的GJ，每个梯度分别有两个平行样，40mL发酵液体系，接种量为2.5％(V/V)，静止培养4天，培养温度分别为47℃、50℃、51℃、54℃、56℃、59℃。

培养结束后，滤纸过滤获得胞外水不溶性多糖，干燥后称重。温度对基因工程菌GJ产胞外水不溶性多糖的影响结果见图5，基因工程菌GJ最大产胞外水不溶性多糖的温度为54℃，当培养温度达到56℃时胞外水不溶性多糖的产量仍较高。

实施例6、基因工程菌GJ对高温油藏高渗透岩芯的选择性封堵

基因工程菌GJ对人造岩芯选择性封堵的物理模拟试验，试验装置见图6图中，1为恒温箱，2为液体收集器，3为岩心夹持器，4、5为压力表，6、7、8为中间容器，9、10为六通阀，11为平流泵。具体操作为：人造岩芯(尺寸为Φ25mm×71.2mm，气测渗透率为910.559×10^-3μm²，孔隙体积为13.0mL，孔隙度为38.69％)抽真空，饱和地层水(模拟地层水水型为CaCl₂水型)，将人造岩芯放入岩芯夹持器3后，再通过平流泵11将中间容器6中的地层水驱人造岩芯(驱替速度为1mL/min)，通过压力表4、5测封堵前岩芯驱替过程中压力的变化，至压力恒定不变时停止水驱。注入中间容器8中的发酵培养基(糖蜜4％(V/V)，(NH4)₂HPO₄ 0.1％(W/V)，NaCl 15000mg/L)稀释5％浓度的菌液1.82PV，于恒温箱1中50℃恒温培养72h。再次以地层水驱岩芯，至压力恒定不变时停止水驱，记录整个驱替过程中压力的变化，利用液体收集器2计量驱出液体的体积。通过工程菌作用前后驱替压力的变化得出其对高渗透层的封堵效果。

GJ封堵试验驱替过程中压力变化见图7，调剖前水驱稳定压力为0.0019MPa，经GJ作用后水驱稳定压力增加至0.11MPa，增加了478.95％。岩芯水驱稳定压力的增加证明基因工程菌GJ对高温油藏高渗透层具有高效的选择性封堵作用。

实施例7、基因工程菌GJ提高原油采收率的物理模拟试验

基因工程菌提高原油采收率的物理模拟试验，试验装置同实施例6，见图6，具体操作为：人造岩芯(尺寸为Φ25mm×73.5mm，气测渗透率为858.073×10^-3μm²，孔隙体积为14.6mL，孔隙度为40.53％)抽真空，饱和地层水(模拟地层水水型为CaCl₂水型)。将人造岩芯放入岩芯夹持器3后，再通过平流泵11将中间容器7中的原油注入至人造岩芯中使其饱和油，直至人造岩芯中的束缚水饱和，利用液体收集器2记录排出的水的体积，置于50℃恒温箱1中老化24小时。用地层水驱油至含水量达到98％(驱替速度为1mL/min)，通过压力表4、5记录该过程中的压力变化，以及液体收集器2测量的排出液体总液量和其中的含水量。向岩芯中注菌液，活化的GJ菌液用发酵液体培养基(糖蜜4％(V/V)，(NH₄)₂HPO₄ 0.1％(W/V)，NaCl 15000mg/L)稀释20倍后注入到岩芯中，注入体积1.78PV，于恒温箱1中50℃恒温培养72h。后续水驱至连续含水率98％以上。记录该过程中的压力变化，及排出液体的总液量和其中的含水量，以此计算基因工程菌GJ提高原油采收率的效率。

GJ提高采收率试验过程中采收率和含水率变化见图8，GJ采收率由作用前的67.49％上升到75.53％，采收率分别提高了8.04％，含水率的从作用前的96％降低到75％。

耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。