专利摘要

本专利公开了一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用，其中，所述产黄青霉基因工程菌中Pc‑somA基因的序列被Bleo抗性基因替代；所述产黄青霉为ATCC48271；其构建方法为：(1)提取产黄青霉的基因组DNA；(2)构建基因敲除的片段；(3)制备产黄青霉的原生质体；(4)将基因敲除的片段导入制备的原生质体中进行同源重组，得到重组产黄青霉基因工程菌。有益效果：本发明所提供的基因工程菌使产黄青霉在固定化发酵产青霉素过程中生物膜量OD570增多了接近2倍，使菌丝可以和塑料介质更好的吸附结合，提高了青霉素的效价达到1963.25U/mL，同时缩短了整个发酵周期，缩短24h，减少生产成本。

权利要求

1.一株重组产黄青霉基因工程菌，其特征在于，所述产黄青霉基因工程菌中Pc-somA基因的序列被Bleo抗性基因替代；其中，所述产黄青霉（Penicillium chrysogenum）为ATCC48271；

其中，所述Pc-somA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Pc-somA基因的序列被bleo抗性基因替代后的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

其中，所述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法包括如下步骤：

（1）提取产黄青霉ATCC48271的基因组DNA；

（2）构建基因敲除的片段；

（3）制备产黄青霉的原生质体；

（4）将步骤（2）构建的基因敲除的片段导入步骤（3）制备的原生质体中进行同源重组，得到重组产黄青霉基因工程菌；

步骤（2）中，所述基因敲除的片段按照如下步骤构建而成：

（2a）以步骤（1）得到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为引物，扩增出Pc-somA基因的上同源臂；

（2b）以步骤（1）得到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为引物，扩增出Pc-somA基因的下游同源臂；

（2c）以质粒pan8-1为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列为引物，扩增出Bleo抗性元件；

（2d）通过重叠延伸PCR的技术，以步骤（2a）所得Pc-somA基因的上游同源臂、步骤（2b）所得Pc-somA基因的下游同源臂和步骤（2c）所得Bleo抗性元件为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增得到基因敲除片段；其中基因敲除片段的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。

2.权利要求1所述重组产黄青霉基因工程菌在产青霉素中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以重组产黄青霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备青霉素。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的固定化发酵是以塑料作为固定化介质，发酵制备青霉素；其中，所述的塑料为聚甲基丙烯酸甲酯。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的固定化发酵的发酵培养基各组分的质量百分比为：黄豆饼粉 4.65%、碳酸钙1%、乳糖3%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸铵0.4%、硫酸钠0.15%、色拉油0.03%、苯乙酸2.5%，溶剂为水，pH=5.8。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的固定化培养的条件为：培养温度为25℃~30℃，培养时间为72~108 h，转速为180~220 rpm。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的塑料材料先用以下方式进行预处理：

（i）将塑料在去离子水中清洗，再于丙酮中抽提，然后干燥；

（ii）将步骤（i）得到的塑料进行电晕处理，保存备用；

步骤（ii）中，电晕的电流强度为6~14 A；电晕的时间为10~30 min。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

目前为止，青霉素因其具有良好的治疗效果和抗菌能力，仍然是我国临床上使用最多的抗生素之一。从1942年弗莱明发现青霉素到青霉素的提纯以及大批量生产，经历了很多年的努力，它的研制成功使人们对细菌的抵抗能力大大增强，带动抗生素家族的发展。青霉素类抗生物是一种β-内酰胺衍生物的总称，可以分为青霉素G、青霉素V、耐酶青霉素、氨苄西林等；青霉素也可分为天然青霉素和半合成青霉素。天然青霉素主要以发酵法为主，但是成本问题就是人们关注的重点。

以前发酵生产青霉素使用的是点青霉，随着人们后来的研究，绿孢子丝状真菌产黄青霉成为青霉素的主要生产菌。发酵法生产青霉素，是获得天然青霉素的主要生产途径。目前，细胞固定化的方法主要有：包埋法、吸附法、交联法等。对于丝状真菌的固定化细胞发酵，我们所采用的是吸附法，此方法只要在选择合适的吸附介质情况下，操作简单，而且菌株的形态也不会发生改变，只要形态合适更有利于在工业上的大量应用。吸附法主要是依靠一些比较弱的相互作用力比如静电作用力、疏水作用力等与细胞相互作用，从而使细胞吸附在介质表面生长，死细胞的脱落和活细胞的再吸附在这过程中达到一个平衡的动态过程，发酵效率较游离有所提高。

在固定化发酵过程中，人们发现微生物会产生，而且生物膜的多少对固定化发酵的性能产生较大的差异，因此，对生物膜成膜机制的研究，将有助于我们进一步了解生物膜形成的机制，让生物膜成为一种固定化的介质成为可能。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中产黄青霉发酵生产青霉素种子培养时间长，动能消耗多而成本高的问题，提供一株重组产黄青霉基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述重组产黄青霉基因工程菌的应用。

发明思路：Pc-somA参与气生菌丝的分化，粘附的过程、产孢子相关基因的表达以及半乳糖氨基半乳糖(GAG)的合成。研究已证明粘附和GAG的合成都影响生物膜的形成。我们通过实验发现Pc-somA基因能够调控生物膜的生成，进而对固定化发酵产生一定的影响，所以固定化发酵青霉素也受到影响。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株重组产黄青霉基因工程菌，其中，所述产黄青霉基因工程菌中Pc-somA基因的序列被Bleo抗性基因替代；其中，所述产黄青霉(Penicillium chrysogenum)为ATCC48271。

其中，所述Pc-somA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Pc-somA基因的序列被bleo抗性基因替代后重组菌株ΔPc-somA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取产黄青霉ATCC48271的基因组DNA；

(2)构建基因敲除的片段；

(3)制备产黄青霉的原生质体；

(4)将步骤(2)构建的基因敲除的片段导入步骤(3)制备的原生质体中进行同源重组，得到生物膜粘附所必需重组产黄青霉基因工程菌。

步骤(2)中，所述基因敲除的片段按照如下步骤构建而成：

(2a)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为引物，扩增出Pc-somA基因的上同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

(2b)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为引物，扩增出Pc-somA基因的下游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(2c)以质粒pan8-1为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列为引物，扩增出Bleo抗性元件；其中，质粒pan8-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；扩增得到的Bleo抗性表达元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

(2d)通过重叠延伸(overlap)PCR的技术，以Pc-somA基因的上游同源臂、Pc-somA基因的下游同源臂、Bleo抗性元件为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增得到基因敲除片段；其中基因敲除片段的核苷酸序列见SEQ ID NO.2(即Pc-somA基因的序列被bleo抗性基因替代后，设计引物以后做转化导入菌当中的核苷酸序列)；

其中，SEQ ID NO.2中包括了上、下游同源臂的部分序列。

步骤(3)中，所述产黄青霉的原生质体的制备方法为：

(3a)将产黄青霉接种到IPM平板(马铃薯综合培养基)，待长满孢子，加2mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，再用1mL刮孢子缓冲液清洗，然后转移至灭菌的2mL离心管中。

(3b)接种0.4mL孢子液到100mL YPD培养基，25℃，220rpm培养12h。

(3c)孢子萌发完毕后，用滤布过滤菌丝。配制酶解液(裂解酶，Lysing enzyme，蜗牛酶，各0.05g/10mL，葡聚糖酶80μL/10mL)，充分溶解过滤除菌。

(3d)取1g菌丝于除菌酶液中，25℃，220rpm酶解30min；将转速降低至180rpm培养2.5～3h。

(3e)酶解完成后4℃，5000rpm离心10min，去上清，加入1mL 1M山梨醇(冰水浴)，用枪吹吸混匀，再加入15mL山梨醇，离心，去上清。然后再重复一次。去掉上清，加入1mLSolution5，用枪吹吸混匀。

步骤(4)中，所述将步骤(2)构建的基因敲除的片段导入步骤(3)制备的原生质体中进行同源重组的具体步骤为：

(4a)吸150μL的原生质体到1.5mL灭菌离心管中，加入10μL步骤(2)中构建的基因敲除片段与之混匀。再加入50μL的Solution 4(PEG2000 0.2％，CaCl₂ 0.05％，KCl0.04％)，混匀，置于冰上并计时25min。

(4b)25min后，加入900uLSolution4，上下颠倒几次，放置在室温并计时25min。25min后，5000rpm离心5min，弃400uL上清液，剩余菌体涂布于蔗糖浓度为1mol/L，腐草霉素浓度为35mmol/L的PDA培养基中，正置培养，得到转化子。

(4c)挑取转化子进行菌落PCR验证。其具体方法如下：取适量转化子加入到50uL的菌落PCR缓冲液(100mM/L Tris-Hcl、10mM/L EDTA、1M/L KCl)中，95℃水浴10min，取0.5uL加入PCR反应体系。PCR引物为Bleo-F和Bleo-R(如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示)，琼脂糖电泳显示扩增条带，表示转化成功。

上述重组产黄青霉基因工程菌在产青霉素中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的应用是以重组产黄青霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵制备青霉素。

其中，所述的固定化发酵是以塑料作为固定化介质，发酵制备青霉素；其中，所述的塑料为聚甲基丙烯酸甲酯15g/L。

其中，所述的固定化发酵的发酵培养基各组分的质量百分比为：黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

其中，所述的固定化培养的条件为：培养温度为25℃～30℃，培养时间为72～108h，转速为180～220rpm。

其中，所述的塑料材料先用以下方式进行预处理：

(i)将塑料在去离子水中清洗3次左右，再于丙酮中循环抽提24h，去除表面油污和杂质，然后干燥(优选于45℃烘箱中烘30min)；

(ii)将步骤(i)得到的塑料置于SDCD16-3-20型电晕处理设备进行电晕处理，保存4℃冰箱备用；

步骤(ii)中，电晕的电流强度为6～14A(优选8A)；电晕的时间为10～30min(优选15min)。

其中，菌的活化为：将在IPM平板上活化的产黄青霉工程菌用刮孢子的缓冲液轻轻刮下，制成孢子液(血球计数板计数10⁸/mL)。接种的400uL的新鲜孢子于发酵培养基(体积为100mL)中，其中含有15g/1L的塑料介质。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明所提供的基因工程菌使产黄青霉在固定化发酵产青霉素过程中生物膜量OD570增多了接近2倍(原始菌成膜能力较弱)，使菌丝可以和塑料介质更好的吸附结合，提高了青霉素的效价达到1963.25U/mL，同时缩短了整个发酵周期，缩短24h，减少生产成本。

附图说明

图1为产黄青霉Penicillium chrysogenum:ATCC48271基因组的电泳图。

图2为pan8-1质粒图谱。

图3为Pc-somA基因上游同源臂、下游同源臂的PCR电泳图，其中，Marker为DL5000的DNA Marker，泳道1-2为Pc-somA的上同源臂，泳道3-4为Bleo抗性筛选标记Pc-somA的下同源臂，泳道5-6为Pc-somA的下同源臂。

图4为基因敲除片段(长度为6375bp)的电泳图，其中Marker为DL5000。

图5为结晶紫染色图。

图6为结晶紫染色OD值差异图。

图7敲除菌在各种介质下的发酵数据图。

图8为原始产黄青霉和敲除产黄青霉基因工程菌的发酵结果。

图9为产黄青霉菌株的生物膜电镜图(TM3000)。

图10为ΔPc-somA的生物膜电镜图(TM3000)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本实施例中质粒(pan8-1)购买于厂家：淼灵质粒平台(货号：P0990)。

基因序列比对均来自：Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255。

实施例1：产黄青霉Pc-somA基因敲除菌的构建。

(一)提取原始产黄青霉基因组

使用Vazyme公司提取植物基因组的试剂盒(FastPure plant DNA IsolationMini kit)，具体方法如下：

菌的活化为：将在IPM平板上活化的产黄青霉工程菌用刮孢子的缓冲液轻轻刮下，制成孢子液(血球计数板计数10⁸/mL)。

1、将刮取的产黄青霉孢子液取400uL接种于100mLYPD培养基中，于25℃，220r/min培养10.5h；

2、用滤布过滤收集菌丝球5000r/min离心5min，用PBS洗涤两次后，将收集的菌丝球用液氮充分研磨，至少3次，称取0.1g研磨好的粉末加入1.5mL离心管中。向研磨好的样品粉末中立即加入400uL的Buffer A1和4uL的RNase A(10ug/mL)，涡旋振荡，充分混匀，帮助裂解。

3、65℃水浴10min。水浴过程中颠倒2～3次，混匀样品。

4、加入130uL的Buffer A2至混合液中，充分混匀，冰上放置5min，14000rmp离心5min，小心吸取上清至另外一个1.5mL的离心管中，注意，不要吸到介质表面。

5、计算上清量，加入1.5倍上清体积的Buffer A3(使用前确定加入无水乙醇)，如500uL的上清加入750uL的Buffer A3，立即吹打混匀。

6、将第5步所得的混合物转移至FastPure gDNACloumns IV(吸附柱已放入收集管)，12000rmp离心1min，弃滤液，分多次离心。

7、加入650uL的Buffer AW(使用前确定加入乙醇)，12000rmp离心1min，弃滤液。

8、重复步骤7.

9、将吸附柱放入收集管中，12000rmp离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中的乙醇抑制下游的反应，空离以后室温放置5min。

10、将吸附柱放入新的1.5mL离心管。加入35uL提前预热至65℃的ddH₂O，室温放置5min，12000rmp离心2min。

11、弃去吸附柱，DNA于-20℃保存待用。通过琼脂糖凝胶电泳测定产黄青霉基因组浓度如图1所示。图1显示，Marker为DL15000的DNAmarker，1-10号为提取的产黄青霉霉基因组。

(二)运用PCR技术扩增Pc-somA基因上下同源臂。

表1PCR反应体系

以原始产黄青霉基因组为模板，以Pc-somA-up-F为上同源臂正向引物，以Pc-somA-up-R为上同源臂反向引物(如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)扩增上同源臂；以SEQID NO.3为下同源臂正向引物，以SEQ ID NO.4为下同源臂反向引物(如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示)扩增下同源臂。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，55～65℃退火30s，68℃延伸2min，上述步骤重复35次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图3。

(三)扩增Bleo抗性表达元件

以pan8-1质粒(pan8-1质粒图谱见图2，核苷酸序列见SEQ ID NO.17)为模板，以Pc-somA-Bleo-F为正向引物，以Pc-somA-Bleo-R为反向引物(如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示)扩增Bleo抗性表达元件。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，55～65℃退火30s，68℃延伸3min，上述步骤重复35次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图3。其中Bleo抗性表达元件的核苷酸序列见SEQ ID NO.13。

图3表示，Marker为DL5000的DNA Marker，Pc-somA的上同源臂，Pc-somA的下同源臂，为Bleo抗性表达元件位置均如图所示。

(四)扩增基因敲除片段

以Pc-somA上下游同源臂及Bleo抗性表达元件为模板，以Pc-somA-F为正向引物，以Pc-somA-R为反向引物(如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示)，利用Overlap PCR技术扩增Pc-somA基因敲除片段。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，55-65℃退火30s，68℃延伸7min，上述步骤重复35次。反应完成后PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，见图4。其中敲除片段的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。

图4表示，基因敲除片段，Marker为DL5000。

(五)产黄青霉原生质体的制备及转化

1.将产黄青霉接种到IPM平板(马铃薯综合培养基)，待长满孢子，加2mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，再用1mL刮孢子缓冲液清洗，然后转移至灭菌的2mL离心管中。

2.接种0.4mL孢子液到100mL YPD培养基，25℃，220rpm培养12h。

3.孢子萌发完毕后，用滤布过滤菌丝。配制酶解液(裂解酶，Lysing enzyme，蜗牛酶，各0.05g/10mL，葡聚糖酶80μL/10mL)，充分溶解过滤除菌。

4.取1g菌丝于除菌酶液中，25℃，220rpm酶解30min；将转速降低至180rpm培养2.5～3h。

5.酶解完成后4℃，5000rpm离心10min，去上清，加入1mL 1M山梨醇(冰水浴)，用枪吹吸混匀，再加入15mL山梨醇，离心，去上清。然后再重复一次。去掉上清，加入1mLSolution5，用枪吹吸混匀。

6.吸150μL的原生质体到1.5mL灭菌离心管中，加入10μL步骤(四)中构建的基因敲除片段与之混匀。再加入50μL的Solution 4，混匀，置于冰上并计时25min。

7.25min后，加入900uLSolution4，上下颠倒几次，放置在室温并计时25min。25min后，5000rpm离心5min，弃400uL上清液，剩余菌体涂布于蔗糖浓度为1mol/L，腐草霉素浓度为35mmol/L的IPM培养基中，正置培养，得到转化子。

8.挑取转化子进行菌落PCR验证。其具体方法如下：取适量转化子加入到50uL的菌落PCR缓冲液(100mM/LTris-Hcl、10mM/L EDTA、1M/L Kcl)中，95℃水浴10min，取0.5uL加入PCR反应体系。PCR引物为Bleo-F和Bleo-R(如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示)，琼脂糖电泳显示扩增条带，表示转化成功。

实施例2：结晶紫染色实验

将原始产黄青霉和基因工程菌分别接种到IPM平板，待长满孢子，加2mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，再用1mL刮孢子液清洗转移至灭菌的5mL离心管中，用刮孢缓冲液定容到2mL，得到孢子液。用血球计数板定量并稀释至10⁶个/mL，随后继续稀释至10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²。

在24孔板中预先加入1mL的合成培养基，然后将不同浓度的孢子液取4uL接种到培养基中。35℃下静置培养72h，使产黄青霉在孔板底部成膜；之后倒掉培养基，用PBS冲洗2遍后，加入0.1％的结晶紫染色15min；之后倒掉结晶紫，用PBS冲洗2遍后，加入冰醋酸在震荡仪中放置30min，使结晶紫脱色；然后进行观察以及酶标仪检测OD570。结晶紫染色图和OD值差异图见图5和图6(图6说明：系列1为敲除菌，系列2为原始菌，从左到右孢子数分别为10⁶-10²)。

表2生物膜结晶紫染色实验在不同孢子浓度下的OD值

图5和图6结果显示，ΔPc-somA菌株在脱色后，紫色颜色明显比原始菌深，在浓度为10²个/mL时ΔPc-somA菌株的颜色已经逐渐加深，用酶标仪检测的OD值，数据结果与颜色相符。表明Pc-somA基因敲除后，生物膜是增多的。

实施例3：基因工程菌固定化发酵实验。

1、塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚甲基丙烯酸甲酯在去离子水中清洗4min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于SDCD16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为8A的电晕处理，处理时间为15min，4℃冰箱备用。

2.发酵培养基的配置

固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.65％、碳酸钙1％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.4％、硫酸钠0.15％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤如下：

(1)于-80℃冰箱取出冷冻保藏的产黄青霉甘油菌在IPM平板上划线活化，在25℃培养3天。

(2)3天后待孢子成熟，用刮孢子液(0.9％NaCl+吐温80)将孢子收集，接种于500mL摇瓶中，其中装液量为100mL，与25℃，220rmp摇床培养72～108h，测定发酵液中的苯乙酸浓度低于0.01％，结束一批发酵，然后移出发酵液。反复进行批次发酵三次。

对比例1：

1、聚丙烯-塑料介质作为固定化介质的制备：介质的处理同实施例3中塑料介质作为固定化介质的制备过程。

2、固定化发酵培养基的配置同实施例3。

3、发酵步骤同实施例3。

对比例2：

1、聚乙烯-塑料介质作为固定化介质的制备：介质的处理同实施例3中塑料介质作为固定化介质的制备过程。

2、固定化发酵培养基的配置同实施例3。

3、发酵步骤同实施例3。

对比例3：聚甲基丙烯酸甲酯-塑料介质未经电晕处理，用于固定化发酵。

1、固定化发酵培养基的配置同实施例3。

2、发酵步骤同实施例3。

对比例4，原始菌固定化发酵实验。

1、塑料介质作为固定化介质的制备：介质的处理同实施例3中塑料介质作为固定化介质的制备过程。

2、固定化发酵培养基的配置同实施例3。

3、发酵步骤同实施例3。

从图7我们可以看出，不管是经过处理的聚丙烯，聚乙烯还是未经处理的聚甲基丙烯酸甲酯，相对于游离发酵，其产黄青霉的固定化都没有起到提高效价，缩短周期的目的，反而是周期增长，故以下实施敲除菌和原始菌固定化时，我们选择经处理的聚甲基丙烯酸甲酯为固定化的介质。

如图8所示，ΔPc-somA菌株和原始菌株在发酵条件下的差异，结果显示发酵108h时，ΔPc-somA菌株发酵产青霉素的效价最高为1963.25U/mL，原始菌发酵产青霉素的效价为1672.65U/mL，ΔPc-somA菌株青霉素效价与原始菌相比提高17.37％，周期相对于游离发酵也是缩短24h。该产黄青霉菌株是一株高产青霉素的菌株，在此基础上效价能有所提高，可以说是在产黄青霉固定化发酵成产青霉素的基础上取得了很大的进步，适宜于工业生产。

实施例4：SEM观察生物膜

将固定化发酵72h后的载体取出，用PBS冲洗3遍洗掉吸附的菌丝。在-80℃冰箱放置过夜后置于冻干机中冻干。再将载体通过导电胶粘在点镜台上，20mA30s进行喷金。然后拿到TM3000中进行观察，生物膜电镜图见图9和图10。图9表示产黄青霉原始菌株的生物膜形成情况，图10表示ΔPc-somA菌株的生物膜情况；SEM电镜图与孔板实验相对应。可以发现，产黄青霉原始菌在载体上几乎没有生物膜形成。而ΔPc-somA菌株，在载体的拐角处和表面形成了较多的生物膜，现在研究发现生物膜可以作为一种固定化的催化剂，有利于固定化发酵，此处我们发酵也发现，青霉素的效价也有所提高，同时减少发酵周期。

本发明提供了一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2559

<212> DNA

<213> 1(Pc-somA)

<400> 1

atgaaccaaa tgaatgtcgg gatgaacccc ggggctggag gccccgtggg tggagttcct 60

atgatcaaca acggatccac ggcttctcgt aacgacggta ctatgaacaa ccccgacgtc 120

atgatcaaca acctcaacac gtatatctat gattactttt tgaagcgtgg gtaccatgac 180

tgcgcccgcg ctctcttgca agatgaatcc atcaaactca ataccgacaa caaccccaag 240

acgagtcccg gaaatcggcg tgatggggac gtcaatggca tggaccctga tgctatgatg 300

accgatggga aggatggtga gaagatcaag attccagatg atctccctcg tccaaatctt 360

cccagcgaga gcgcctcctc attcctcctc gattggttca gccttttctg ggagttcttc 420

tgggctcaac gcaagaaggg aaacagcaat gatatcaggc agtaccttca gcacaaccag 480

gtgtgtgaat aatcgtctgt atcgaggatg tcgatcatgg actaatcctg aactttagaa 540

cttcatgcgt ctgcgagaac aacagcacaa tcaattcatg aggcagcagc ccatgatgcc 600

aggccagatg aaccagctcc ggagacagaa tggcatggtg cctcctaacc tgcagaaaac 660

agtgctgcag aacaacacca ctggactgta tgctctatct ggatatattc ttccccatgc 720

ggagtgttga gttgggggtg gacgtgctga tcggattttt ttctagctca caacaacaac 780

aattggcgca ataccaaaag aaccagcaac tgcagatgat gcagcaaatg cagcgggacc 840

cggatatgga aatggctgga catcggccac agtcaccagc gtcggccgac aacgctccct 900

cgccgtcgaa acgcccacgt cttgaaggcg ctgtcaacgg acagcagctg gcaccgaatg 960

gtcgcggaca gggacaagga atgcctggac agcccaaccc gcaggctata atgatgcaga 1020

atggaatgca gaggggaatg actccggcgc aattccagca gttccaggga caagctgcgc 1080

aacagaagaa tatgcaggta tatgctcaaa acttggccct tcatcactct cgctcagcat 1140

cgaattccca gggtatcccg aatggtggca tgatgaatcc cggtgttatg gcaaatcagg 1200

cggatctggt accgatgccg gatggccaag gaatgtatcc tatggccggt ggtcctgagt 1260

actacggtgc aaacggtcaa ctcgcccagg tccgacccgg taatttgcag acacctggca 1320

gtcagcatgg taaccatgct cttcaagatt atcagatgca gcttatgctg cttgaacagc 1380

agaataagcg gcgcttgatg atggctcgtc aagagcagga tagcatggcc cgcgctgacg 1440

gccagccccc gatgcccggc cagggagttt tgccgccagg cacttccccg ggtagcaggg 1500

cgggaacgtc ccccaatcct agcgaccaaa tgaaacgagg cacgcctaag atgcctccga 1560

ctggacttcc cgggtcgcca agcgccggcg acatgtccca gcgtggatca cctgggtcca 1620

tgaacctcaa cggtgctccg atgcccccag acatggcggc tcagttcttc ccaggatcga 1680

atatgcgacc tcctagttct aaccctgcct tcactggagc tcaaatgggg cagccgattc 1740

cagccaatgc cggccagcgt atgcctagtg gacaatggca gccagggcaa ccccagatgc 1800

ctccgcagca ttcacctgcg aaccagcccc aggctggaac cccgcaggaa cgaagcgcga 1860

tgcctccgcc ttcggcgcca cctatcacgg gtcctaacgc tggtcgtggc caaccggcgt 1920

cacctcagac tgctggtaac gcgccaccaa cgccccaaca ggctaccaag gctgcaccaa 1980

agggcaagaa ggaaactaag gacacccgca aggttcgtat acccccaaat ggtgttgtga 2040

tctttgtatc cgctaacttg aattcaagcg acccaacaag aagcaagctg ccgctgctgc 2100

tgccagtgcg gccgcaggcg cgactccatc cacggaagcc gcagagccac cgaccccatc 2160

gactcctgtc acgccgcagc accctaactc gttcaatcct aagaatgggg cgaatggggt 2220

gaacgggcca gctcaaccgg cacaacctac ctcggcacct gctccccaga ccatggtgca 2280

gccgccccct gaccaacagc aatccttcac tgacctcagc attcctgatg tatgttcttt 2340

ccacctctat gtctcctact agtatgcatt tactgactct tatcaaaggc ttccgcattc 2400

aaccttgact tcagcgcact ggaaaatcca gacattctgg agaactttga ctttgacaca 2460

ttcctcaaca cggatgccga tgccactgga tttgggtttg atcccagcat atcctattcg 2520

ggtgatggtg ttgagacagg tgccggtgac agcctgtga 2559

<210> 2

<211> 6758

<212> DNA

<213> 基因敲除片段(gene knockout fragment)

<400> 2

cgaggatgaa atgccaccgg aggaagagta atgaccctgc gatatcttgt gcatttacac 60

tatttgaaga atgggcgttt tggggttcct cattggttac atttttaggg ggatggggtc 120

tttttgccct tactggtcat tattgcttcc gataatcact ctatttgtac acctgtcttt 180

taaccaatta ggctttgtga tgtatccttg cgctaaacca cgcgatttat cactggcata 240

ggtcgataca ttataagaat tgattttaac ttcagatcta gagactggag aaactgggga 300

tagggcaagg tgtgtggtgg ttgtgaagtc ggttgaagtc gtgatccata gaaaatcgca 360

tgatctccct tttttccctt tttatatgtg tagatccctc ggcgaatctg ccgctcagga 420

gcttgatctg tatggtcatg accagacatg tattgtaggg tgaacctgca gttcggtcaa 480

gtacatataa ttacccgggg gcacctaaat agcggtcaac ggaacatccg agttaatgta 540

tttgtcaagt actgtatgtc ataaacacaa cgccataccg gttctgtacc actatctccg 600

cccctcaact ctttacagat cgaatttccc tcctttccat cttttctcaa ctacctaggc 660

aggatttttc cactttgatt cttctctcaa tttgttcaaa tcccctagat cgcttgatct 720

ttggtatatt caaccttcgt ggtggtcgtg aaatagtggc ttaccctact tttagactcc 780

cgctgggatc catcgcaggg cccatcaggt atcatatcac ccttctgact ttacctcttt 840

tccttctctc aatctgttca aaccaccata tttccactta tatatcttct atttcttttt 900

cgctaagtcg ctaactcctt tttctttttc gtcgcagacc gcaaattcaa tggttatcag 960

atcggtgcat tcccagaaat acgcttgaca gcgccatccc cagccccgac ctccgactag 1020

gttgatccgc tccgaacaag cgattctccc gcagagcgca gcgcctgtca atgtacgtcc 1080

cccccggctc tctctcactg aatccgtcct tctcttccca ctgtgagatc cacatctctt 1140

agactcccct tttatattct taatttgttc cctttttccc gggttcttgt tctttggttt 1200

tctctttctt tgtacacggg cttggtgttc tcctgtccgc gattctgccc gatcgggtgt 1260

ctggcgccgc cccccatacc aaccacctca cttgtgcgct ttttccgcct ccttgtacct 1320

ccgtcgtcgc ccacccccat atagattacg cacttgctcc tacacttggt catctgaagc 1380

gtttcatcct ctggcaagcg ctcaccaatc agaccagtca gagacaccta gcatacttcg 1440

tctgcgcctc ccgagcctcc atcctctcgt ttctaccccg tcgcgtggtt tctccggaag 1500

aaggcgcctc tggttatcct gaacgccctc gtattttgcg atcatataat cgtttgattc 1560

gcgctgttac tacacgcttt gatcggcctt gcgagccttc gatattcctt gtatctctac 1620

acacaggctc aaatcaataa gaagaacggt tcgtcttttt cgtttatatc ttgcatcgtc 1680

ccaaagctat tggcgggata ttctgtttgc agttggctga cttgaagtaa tctctgcaga 1740

tctttcgaca ctgaaatacg tcgagcctgc tccgcttgga agcggcgagg agcctcgtcc 1800

tgtcacaact accaacatgg agtacgataa gggccagttc cgccagctca ttaagagcca 1860

gttcatgggc gttggcatga tggccgtcat gcatctgtac ttcaagtaca ccaaccctct 1920

tctgatccag tcgatcatcc cgctgaaggg cgctttcgaa tcgaatctgg ttaagatcca 1980

cgtcttcggg aagccagcga ctggtgacct ccagcgtccc tttaaggctg ccaacagctt 2040

tctcagccag ggccagccca agaccgacaa ggcctccctc cagaacgccg agaagaactg 2100

gaggggtggt gtcaaggagg agtaagctcc ttattgaagt cggaggacgg agcggtgtca 2160

agaggatatt cttcgctctg tattatagat aagatgatga ggaattggag gtagcatagc 2220

ttcatttgga tttgctttcc aggctgagac tctagcttgg agcatagagg gtccctttgg 2280

ctttcaatat tctcaagtat ctcgagtttg aacttattcc cgtgaacctt ttattcacca 2340

atgagcattg gaatgaacat gaatctgagg actgcaatcg ccatgaggtt ttcgaaatac 2400

atccggatgt cgaaggcttg gggcacctgc gttggttgaa tttagaacgt ggcactattg 2460

atcatccgat agctctgcaa agggcgttgc acaatgcaag tcaaacgttg ctagcagttc 2520

caggtggaat gttatgatga gcattgtatt aaatcaggag atatagcatg atctctagtt 2580

agctcaccac aaaagtcaga cggcgtaacc aaaagtcaca caacacaagc tgtaaggatt 2640

tcggcacggc tacggaagac ggagaagccc accttcagtg gactcgagta ccatttaatt 2700

ctatttgtgt ttgatcgaga cctaatacag cccctacaac gaccatcaaa gtcgtatagc 2760

taccagtgag gaagtggact caaatcgact tcagcaacat ctcctggata aactttaagc 2820

ctaaactata cagaataaga tggtggagag cttataccga gctcccaaat ctgtccagat 2880

catggttgac cggtgcctgg atcttcctat agaatcatcc ttattcgttg acctagctga 2940

ttctggagtg acccagaggg tcatgacttg agcctaaaat ccgccgcctc caccatttgt 3000

agaaaaatgt gacgaactcg tgagctctgt acagtgaccg gtgactcttt ctggcatgcg 3060

gagagacgga cggacgcaga gagaagggct gagtaataag cgccactgcg ccagacagct 3120

ctggcggctc tgaggtgcag tggatgatta ttaatccggg accggccgcc cctccgcccc 3180

gaagtggaaa ggctggtgtg cccctcgttg accaagaatc tattgcatca tcggagaata 3240

tggagcttca tcgaatcacc ggcagtaagc gaaggagaat gtgaagccag gggtgtatag 3300

ccgtcggcga aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag tccaattgct tccgatctgg 3360

taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag agcgagtacc cggcgcgtaa 3420

gctccctaat tggcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa atatcgtgcc tctcctgctt 3480

tgcccggtgt atgaaaccgg aaaggccgct caggagctgg ccagcggcgc agaccgggaa 3540

cacaagctgg cagtcgaccc atccggtgct ctgcactcga cctgctgagg tccctcagtc 3600

cctggtaggc agctttgccc cgtctgtccg cccggtgtgt cggcggggtt gacaaggtcg 3660

ttgcgtcagt ccaacatttg ttgccatatt ttcctgctct ccccaccagc tgctcttttc 3720

ttttctcttt cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc catccaagaa cctttatttc 3780

ccctaagtaa gtactttgct acatccatac tccatccttc ccatccctta ttccttggaa 3840

cctttcagtt cgagctttcc cacttcatcg cagcttgact aacagctacc ccgcttgagc 3900

agacatcacc atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc 3960

cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga 4020

cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt 4080

ggtgccggac aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga 4140

gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat 4200

cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca 4260

cttcgtggcc gaggagcagg actgattccg gatccactta acgttactga aatcatcaaa 4320

cagcttgacg aatctggata taagatcgtt ggtgtcgatg tcagctccgg agttgagaca 4380

aatggtgttc aggatctcga taagatacgt tcatttgtcc aagcagcaaa gagtgccttc 4440

tagtgattta atagctccat gtcaacaaga ataaaacgcg tttcgggttt acctcttcca 4500

gatacagctc atctgcaatg cattaatgca ttggacctcg caaccctagt acgcccttca 4560

ggctccggcg aagcagaaga atagcttagc agagtctatt ttcattttcg ggagacgaga 4620

tcaagcagat caacggtcgt caagagacct acgagactga ggaatccgct cttggctcca 4680

cgcgactata tatttgtctc taattgtact ttgacatgct cctcttcttt actctgatag 4740

cttgactatg aaaattccgt caccagcccc tgggttcgca aagataattg cactgtttct 4800

tccttgaact ctcaagccta caggacacac attcatcgta ggtataaacc tcgaaaatca 4860

ttcctactaa gatgggtata caatagtaac catgcatggt tgcctagtga atgctccgta 4920

acacccaata cgccggccga aactttttta caactctcct atgagtcgtt tacccagaat 4980

gcacaggtac acttgtttag aggtaatcct tctttctaga gtcttgacgg tccttcaggt 5040

gcttcacctc cgatataccc ttgtttgtac atttgataat tgctctagtg cgttttcgcg 5100

gatactcgac ctgttctgtt ttcttctctc ccaatttatc tggatatgtg tgtttctgcg 5160

catgtgctgt tgtgagattg gcgttgggtg taccttgttc atcgcatcct ctcctgtccc 5220

ctccccttgc tcgtcctagg aagccagcat cctccaaccg ataccaaggg actgcttgga 5280

cggggctctt ctgtattcga gattagtgca ctgtgaccta cgagttttct tggcttctct 5340

tcctttcttt ctattattac tattattact tgtggatgtg gttacttaat tccttgcttt 5400

gccttgcctg tatgggcgac gttgatacct ctcagtatga agtccagttg cctatggctg 5460

atccagtgca ctcttatcct ttcatttcca acgatttgct gttcttttct ttttcttttc 5520

ttttcttttc tttgtcactc atcttcttcc ctcttttgat ctatctcgaa caatcttcca 5580

acgaatgccg gccgtttttt ttcatttcat tttgtctttc actaccagtg tcgctggtag 5640

tggactcttt ccacccctct acttctccgc caggcataga gcctgtggtt tcctcctctt 5700

tcttttctct ttttcttctc tctacacttt gcctgtactc tcggatcaga cccggatatc 5760

cccccaacca gcccgtgtca tcactgcaac cggacacagg agtgactaca aggggaaatg 5820

ggacatcaaa aaggaatcaa ctcaaaagaa tcaggaatct cgcgactcta cttgtttggt 5880

gactgttgga gttggtgtat tgatgggatg tgaccgggtt gatattggat ttggatattc 5940

ccctagcaga ttccaggagt tacgatgtcg ttatggttat gcgcttcatg ttattttctg 6000

gtctcaaaat atggatctga attcatctat ggacaggttc ctccattatt aaatctctct 6060

ctagtctgta gtctctacta gtagacagtc tctagggctg atggtgacag agtaagtcaa 6120

ttcagtggcc gtatcccaat tcggagtcgg attcacagcc tgtcccacga gtttacctct 6180

attaagtctt ttcacgcaaa cacatgcaaa tcacctaaga cacctaagac acgtatgtca 6240

tgttgatact ggccctgcta ctttccctaa ttgggaagtc ccaggcttca catataaatt 6300

cctctctttt tctttcttct cttccttttc atcttccctc ttcatcctct cttcatcctc 6360

tcttcatcct ctcttcatcc tctcttcatc ctctcttcat cctctcttca tcctctcttc 6420

ttcctctcct tccatcccac gtccccccat cctcttctgt accctgcatt ctgtatgccc 6480

tcctccttct tccatccatc catccatcca tccccagtcc ccagtcccca gtccccagcc 6540

ctctatcctc tatcctctat ccttcatcct cccatccatt tccatcccca tctctcatct 6600

ctcatcccct gtcccatcct ctgtccccgt cccatcctct gtccccgtcc catcctctgt 6660

ccccgtccca tcctctgtcc ccgtcccatc ctctgtcccc gtcccatcct ctgtccctgt 6720

ccctatcccc gtctccgtcc atctttccat ctagcccg 6758

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 上同源臂的正向引物(Pc-somA-UP-F)

<400> 3

cgaggatgaa atgccaccgg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 上同源臂的反向引物(Pc-somA-UP-R)

<400> 4

aatatcgaag gctcgcaagg c 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 下同源臂的正向引物(Pc-somA-DOWN-F)

<400> 5

tgacggtcct tcaggtgc 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 下同源臂的反向引物(Pc-somA-DOWN-R)

<400> 6

cgggctagat ggaaagatgg acg 23

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。