专利摘要

本发明公开了一种核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用。其中所述突变体的氨基酸序列相对于SEQIDNo.3所示序列存在下述突变：第26位氨基酸替换为H。对枯草芽孢杆菌染色体上的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子基因中编码的第26位氨基酸替换为H的核苷酸定点突变，而获得的基因工程菌，其生产维生素B2的能力得到了较大幅度的提升，具有较大的应用推广价值。

权利要求

1.一种核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第26位氨基酸替换为H。

2.如权利要求1所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.如权利要求1所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.含有权利要求3所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的重组载体。

6.含有权利要求3所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。

7.如权利要求1或2所述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体、或其编码基因在制备维生素B2中的应用。

8.一种增强枯草芽孢杆菌产维生素B2的方法，其特征在于，将染色体上的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因进行定点突变，获得产维生素B2的能力增强的枯草芽孢杆菌，其中所述定点突变是将所述编码基因的第26位氨基酸的编码核苷酸进行定点突变为编码氨基酸H。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BS168ribCm菌株作为出发菌株。

10.一种利用权利要求8或9所述的方法获得的枯草芽孢杆菌制备维生素B2的方法，其特征在于，包括培养所述枯草芽孢杆菌，以及收集维生素B2的步骤。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其基因工程菌以及在维生素B2中的应用。

背景技术

核黄素又名维生素B2，是一种水溶性B族维生素，大多数微生物和植物可自主合成，而人和动物只能从食物中摄取。核黄素在生物体内主要以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在，它作为黄素蛋白的辅酶或辅基参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，是维持机体正常代谢和生理功能所必需的营养素。核黄素被广泛应用于医药、食品和饲料等领域，由于核黄素的广泛用途，国内外对核黄素的需求量仍呈现日益增加的趋势。

微生物发酵是工业化生产核黄素的主要方法，具有成本低、环境污染小、生产周期短、产品纯度较高等优点。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有可靠的生物安全性，这对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。传统诱变育种发现，枯草芽孢杆菌突变株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力。枯草芽孢杆菌作为重要的模式菌，相关的基因工程技术和遗传转化方法都比较成熟，有利于通过理性代谢工程及系统生物学手段选育核黄素高产菌株。

在枯草芽孢杆菌中，需要经过由磷酸戊糖途径、嘌呤合成途径、核黄素合成途径催化的二十多步反应才能将葡萄糖转化为核黄素。合成核黄素的两个直接前体5-磷酸核酮糖和GTP分别由磷酸戊糖途径和嘌呤合成途径产生，最终5-磷酸核酮糖和GTP在核黄素操纵子编码的酶的催化下经过7歩反应生成核黄素。

核糖核苷酸还原酶（ribonucleoside reductase, RNR ）是微生物合成脱氧核糖核苷酸的关键酶。在枯草芽孢杆菌中，nrdE、nrdF基因编码的核糖核苷酸还原酶的表达受到转录调控因子NrdR的调控。除枯草芽孢杆菌外的多种微生物中，NrdR的同源蛋白都调控着RNR的表达，因而NrdR在微生物的生长中起着重要的作用（Case EDR, Akers JC, Tan M.CT406 Encodes a Chlamydial Ortholog of NrdR, a Repressor of RibonucleotideReductase[J]. Journal of Bacteriology, 2011, 193(17)：4396-4404）。近年来研究者们发现，NrdR的作用不仅是调控着RNR的表达，它也在微生物的致病性、移动性、耐药性中发挥作用（Dreux N, Cendra MDM, Massier, Sébastien, et al. RibonucleotideReductase NrdR as a Novel Regulator for Motility and Chemotaxis duringAdherent-Invasive Escherichia coli Infection[J]. Infection and Immunity,2015, 83(4)：1305-1317）。此外在菌株中敲除和过表达nrdR基因后均引起组学水平上的基因表达变化（Naveen V, Hsiao CD. NrdR Transcription Regulation：Global ProteomeAnalysis and Its Role in Escherichia coli Viability and Virulence[J]. PLOSONE, 2016, 11(6)：e0157165），因而认为NrdR也是一种全局性的转录调控因子。缺失nrdR（ytcG）基因的菌株中嘌呤合成途径的若干基因与野生型相比转录水平发生了明显的变化（Viridiana, Castro-Cerritos, Karla, et al. LC-MS/MS proteomic analysis ofstarved Bacillus subtilis cells overexpressing ribonucleotide reductase(nrdEF)：implications in stress-associated mutagenesis[J]. Current GeneticsEukaryotes with Emphasis on Yeasts Fungi Mitochondria Plastids, 2018. 64：215-222)，而嘌呤合成途径是合成核黄素的重要前体物质GTP的合成途径，因此，nrdR的表达水平与核黄素的合成量具有一定的潜在联系。目前，尚未有核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变基因nrdR（ytcG）用于维生素B2合成的报道。

发明内容

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B2的枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 16132菌株（见中国专利申请201910604170.3），可发酵生产维生素B2。本发明人对其作了进一步研究以发现对产维生素B2能力有影响的基因。经过研究发现一种突变的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因，通过验证在枯草芽孢杆菌中将核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因定点突变为所述突变基因则能提高所述菌生产维生素B2的能力。

因此，本发明首先提供一种核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体，其多肽氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列存在下述突变：第26位氨基酸替换为H。

优选地，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

其次，本发明提供上述的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

相应地，本发明第三方面还提供含有所述核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。

更优选地是重组表达载体，更优选原核重表达载体。最优选是适合于在枯草芽孢杆菌中进行表达的表达载体。

第四方面，本发明提供含有所述核糖核苷酸还原酶转录抑制因子的突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本发明的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为枯草芽孢杆菌。

第五方面，本发明提供核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、或其编码基因在制备维生素B2中的应用。

第六方面，本发明提供一种增强枯草芽孢杆菌产维生素B2的方法，其是将染色体上的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因进行定点突变，获得产维生素B2的能力增强的枯草芽孢杆菌，其中所述定点突变是将所述编码基因的第26位氨基酸的编码核苷酸定点突变以编码H，更具体的，所述编码基因的第77位核苷酸由A置换了G。其中的定点突变可以采用本领域已知的各种方法来实现。

优选地，所述枯草芽孢杆菌的原始出发菌株是枯草芽孢杆菌BS168 ribCm的菌株。

本发明第六方面，提供一种利用上述第五方面的方法获得的枯草芽孢杆菌制备维生素B2的方法，其包括培养所述枯草芽孢杆菌，以及收集维生素B2的步骤，更优选还包括纯化维生素B2的步骤。

其中枯草芽孢杆菌的培养可以根据本领域的常规方法进行，例如摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况选择合适的培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。此外，可以从细胞或培养基中回收或纯化维生素B2的方法可采取本领域常规的方法，例如过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC等方法。

本发明的有益效果在于，经研究证实，本发明中含有核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变基因的基因工程菌生物安全（染色体上基因突变未对菌体的生长造成影响），可以有效的提高枯草芽孢杆菌生产维生素B2的能力。实验数据表明，将枯草芽孢杆菌BS168ribCm中核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因nrdR变为突变基因nrdR（G77A）可以提高产维生素B2的能力达36.5%，因而在生产和制备维生素B2中具有较大的应用价值。

附图说明

图1：不同枯草芽孢杆菌菌株发酵41h后的VB2产量。

图2：不同枯草芽孢杆菌菌株发酵41h后的生物量。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

培养基配方：

LB 培养基（g/L）：氯化钠 10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉18。

发酵培养基（g/L）：玉米浆干粉10、蔗糖30、硫酸镁2、硫酸铵7、磷酸氢二钾3、磷酸二氢钾1，用NaOH调节pH至7.2～7.4。

维生素B2的检测方法

发酵液混匀，用0.01mol/L NaOH将其稀释到适当的倍数后，混匀，避光碱溶20min，12000rpm离心2min，取上清液以0.01mol/L NaOH做空白在444nm下测定吸光度（显示值控制在0.2-0.8之间），按以下公式计算核黄素的含量：FB（mg/L）=（稀释倍数*吸光度）/0.0321。

实施例1：菌株CGMCC NO. 16132与BS168 ribCm进行比较基因组分析

以菌株BS168 ribCm（其具体构建过程参见中国专利申请201910604170.3）的基因组为参考基因组，将菌株CGMCC NO. 16132送到金唯智生物科技有限公司进行全基因组重测序及差异性分析，以发现对产维生素B2能力有影响的基因。通过序列比对分析，发现菌株CGMCC NO. 16132发生了大量的突变，共包含338个突变位点：经过突变数据统计，突变共涉及72个基因。编码区域内的突变共涉及59个基因，其中同义突变8个、非同义突变41个、无义突变2个、移码突变5个、非移码突变3个；非编码区内的突变共涉及13个基因。

去除同义突变以及未知基因功能的基因突变，检索由葡萄糖到维生素B2生物合成涉及到的代谢途径，侧重考察途径富集分析相关代谢途径中参与酶催化、外排以及代谢调控的基因突变，初步筛选到一些可能对产维生素B2能力有影响的基因，包括维生素B2合成途径直接相关的突变基因、嘌呤外排泵突变基因、嘌呤合成途径调控突变基因、嘌呤降解途径突变基因等。其中，经分析发现嘌呤合成途径相关的核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因nrdR发生了点突变，其第77位核苷酸由A置换了G。为了验证突变位点对维生素B2产量的影响，对出发菌株枯草芽孢杆菌BS168 ribCm中的nrdR基因进行了点突变，即将其编码基因突变为与CGMCC NO. 16132菌株上述突变位点一致的序列。

实施例2：构建含nrdR突变体的菌株

以Bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物UPnrdR-F、UPnrdR-R（含DR）扩增带接头的UPnrdR（含DR）片段，用引物araR-F、araR-R（含DR）扩增带接头的araR（含DR）片段；以pC194质粒为模板，用引物cat-F、cat-R扩增带接头的cat片段；以菌株CGMCC NO. 16132的染色体为模板，用引物nrdRm-F、nrdRm-R扩增带有点突变的nrdRm片段，其中所述突变的nrdR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

以UPnrdR片段、cat片段、araR片段和nrdRm片段为模板，用引物UPnrdR-F、nrdRm-R进行融合PCR，得到组装片段UCR-nrdRm，经核酸电泳检测正确，胶回收后得到纯化的UCR-nrdRm片段。

将UCR-nrdRm片段Spizizen转化BS168 ribCm，涂布于含有8mg/L氯霉素的LB固体平板上，培养24h后进行菌落PCR验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得nrdR基因带有点突变的中间菌株BS168 UCR-nrdRm，其中所述突变的nrdR的核苷酸序列如SEQID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

挑取中间菌株BS168 UCR-nrdRm的单菌落于含有5mL LB的试管中，37℃振荡培养8h后，取200uL菌液涂布于含有40mg/L新霉素的LB固体平板上，培养24h后进行菌落PCR验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且nrdR基因带有点突变的菌株BS168 nrdRm，其中所述突变的nrdR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

所用引物如下：

表1 构建含nrdR突变体的菌株所用到的引物

所用到的菌株及质粒如下：

表2 构建含nrdR突变体的菌株所用到的菌株和质粒

菌株与质粒相关性质菌株B. subtilis 168]]>trpC2]]>m]]>trpC2，质粒pGMBsub04过表达了rib operon，△araR：：Para-neo，Em^r，Nm^r，ribC^m]]>m]]>m衍生菌株，trpC2，Em^r，Nm^s，Cm^r，ribC^m]]>m]]>m衍生菌株，trpC2，Em^r，Nm^r，Cm^s，ribC^m，nrdR^m]]>质粒pC194r，Staphylococcus aureus plasmid]]>

实施例3：评价不同菌株的维生素B2生产能力

1、菌株培养条件：

将出发菌株BS168 ribCm、和工程菌株BS168 nrdRm在无菌条件下用接种针划线含有25mg/L红霉素的LB固体平板，在37℃培养箱中倒置培养24h，以获得新鲜活化的单菌落。用接种针挑取单菌落划线含有25mg/L红霉素的LB固体斜面，在37℃培养箱中培养48h。刮取斜面上1/3的菌苔接种含有70mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中（每株菌3个平行），37℃、200rpm振荡培养41h后取发酵液测定OD600和维生素B2产量。

、不同菌株OD600和维生素B2产量的比较

与出发菌株BS168 ribCm相比，含有核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变基因nrdR（G77A）的工程菌株BS168 nrdRm的维生素B2产量提高了36.5%（参见下表3和图1）。

表3不同菌株OD600和维生素B2产量的比较

菌株600]]>2产量（g/L）]]>m]]>15.82±0.3571.04±0.043m]]>15.35±0.3961.42±0.038

由此可知，实验结果能够表明，本发明中将核糖核苷酸还原酶转录抑制因子编码基因nrdR变为突变基因nrdR（G77A）的这种遗传修饰能提高菌株生产维生素B2的能力（提高了36.5%）。同时，两个菌株生物量变化不大，OD600相差不到为0.5，说明nrdR基因的点突变未对菌体的生长造成影响（见表3和图2）。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

ttgaaatgtc cttcatgcca gcataacgga acacgagtcc ttgattcacg gcctgtggat 60

gacggaaagt cgattcgccg aagacgcgag tgcgaatcct gccactaccg gtttacgacc 120

tttgagaaag tggaggaaac cccgctcatc gttgtgaaaa aagaaggtgt gcgtgaggaa 180

ttcagcagag aaaaaatgct gcgcggcctc ataaaagcat gtgaaaaaag gcctgtttca 240

ctcaaaacgc ttgaagacat gtgctttgat attgaaaaag aacttcgcaa tcaaggctgc 300

tccgaggtga agagtgagct cgtcggagaa atggtcatgg accggctggc taagattgac 360

gaagtcgcat atgtgcggtt cgcgtccgtc tatcggcagt ttaaagatat aaacgtcttt 420

atcgatgaat taaaagactt aataaagaaa gagcgttaa 459

<210> 2

<211> 459

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

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gaagtcgcat atgtgcggtt cgcgtccgtc tatcggcagt ttaaagatat aaacgtcttt 420

atcgatgaat taaaagactt aataaagaaa gagcgttaa 459

<210> 3

<211> 152

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

Leu Lys Cys Pro Ser Cys Gln His Asn Gly Thr Arg Val Leu Asp Ser

1 5 1015

Arg Pro Val Asp Asp Gly Lys Ser Ile Arg Arg Arg Arg Glu Cys Glu

202530

Ser Cys His Tyr Arg Phe Thr Thr Phe Glu Lys Val Glu Glu Thr Pro

354045

Leu Ile Val Val Lys Lys Glu Gly Val Arg Glu Glu Phe Ser Arg Glu

505560

Lys Met Leu Arg Gly Leu Ile Lys Ala Cys Glu Lys Arg Pro Val Ser

65707580

Leu Lys Thr Leu Glu Asp Met Cys Phe Asp Ile Glu Lys Glu Leu Arg

859095

Asn Gln Gly Cys Ser Glu Val Lys Ser Glu Leu Val Gly Glu Met Val

100 105 110

Met Asp Arg Leu Ala Lys Ile Asp Glu Val Ala Tyr Val Arg Phe Ala

115 120 125

Ser Val Tyr Arg Gln Phe Lys Asp Ile Asn Val Phe Ile Asp Glu Leu

130 135 140

Lys Asp Leu Ile Lys Lys Glu Arg

145 150

<210> 4

<211> 152

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 4

Leu Lys Cys Pro Ser Cys Gln His Asn Gly Thr Arg Val Leu Asp Ser

1 5 1015

Arg Pro Val Asp Asp Gly Lys Ser Ile His Arg Arg Arg Glu Cys Glu

202530

Ser Cys His Tyr Arg Phe Thr Thr Phe Glu Lys Val Glu Glu Thr Pro

354045

Leu Ile Val Val Lys Lys Glu Gly Val Arg Glu Glu Phe Ser Arg Glu

505560

Lys Met Leu Arg Gly Leu Ile Lys Ala Cys Glu Lys Arg Pro Val Ser

65707580

Leu Lys Thr Leu Glu Asp Met Cys Phe Asp Ile Glu Lys Glu Leu Arg

859095

Asn Gln Gly Cys Ser Glu Val Lys Ser Glu Leu Val Gly Glu Met Val

100 105 110

Met Asp Arg Leu Ala Lys Ile Asp Glu Val Ala Tyr Val Arg Phe Ala

115 120 125

Ser Val Tyr Arg Gln Phe Lys Asp Ile Asn Val Phe Ile Asp Glu Leu

130 135 140

Lys Asp Leu Ile Lys Lys Glu Arg

145 150

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ttttcgtgaa cttcttgct 19

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgaactaatg ggtgctttag ttgaagaagg tcgtaaaccg gtagtgg 47

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

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<210> 8

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gggtttcctc cactttctca aaggtcgtaa accggtagtg gcaggattcg cactcgcgtc 60

tttattcatt cagttttcgt gcg 83

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tcttcaacta aagcacccat t 21

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gtaagaaaac attgacagaa aatgccttca actaacgggg caggttagt 49

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ttgagaaagt ggaggaaacc c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gcatcttctg aaatggccg 19

核糖核苷酸还原酶转录抑制因子突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。