专利摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及以来源于藜芦属植物的介芬胺(jervine)为原料制备环杷明(cyclopamine)的方法及环杷明在医药领域的用途。介芬胺与水合肼反应成腙后于高沸点溶剂中，在氢氧化钾、叔丁醇钾等强碱作用下脱氮形成环杷明，反应中使用聚乙二醇400、TEBA等相转移催化剂。环杷明通过与肿瘤细胞Hh通路中的Smo蛋白直接连接，非基因毒性地引起癌细胞凋亡，而对正常细胞没有影响。

权利要求

1.一种环杷明的制备方法，其特征是包括如下步骤：

由介芬胺、水合肼、强碱在相转移催化剂的催化下，在高沸点溶剂中反应，反应中介芬胺和水合肼的摩尔比为1.1∶1-3∶1，反应温度为160-200℃，反应时间为2-7小时，高沸点溶剂的用量为每g介芬胺用0.2-0.6L溶剂，反应结束后，加入水，并以中等极性的有机溶剂萃取，收集有机溶剂层，除去水分后浓缩，析出结晶即为环杷明，其中：

所述强碱为氢氧化钾或叔丁醇钾，所述相转移催化剂采用分子量为400的聚乙二醇，用量为反应溶剂体积的2～8％，或采用苄基三乙基氯化铵，用量为介芬胺重量的1-3％；所述高沸点溶剂为一缩二乙二醇、二甲基亚砜、1，3-丙二醇或乙二醇。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于反应结束后萃取用的中等极性的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或多种。

3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于对析出环杷明结晶后的固滋进行粒层析纯化，得到环杷明，其中柱层析纯化所用的吸附剂为硅胶、氧化铝或聚酰胺；洗脱用的溶剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中的一种或多种。

4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所用的介芬胺原料从藜芦属植物中提取获得，具体步骤如下：将药材藜芦植物的干燥根茎粉碎后用乙醇热提或冷浸，将提取液或冷浸液浓缩；对浓缩的粗提物经酸化和碱沉处理，再用硅胶柱层析法，分离得到介芬胺；所用的洗脱剂是二氯甲烷和甲醇体系或石油醚和乙酸乙酯体系。

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述热提采用75％的乙醇，热提2-4次，每次乙醇用量为药材体积的3-5倍；冷浸用75％-95％的乙醇，冷浸2-4次，每次乙醇用量为药材体积的4-10倍。

6、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述酸化用的酸为质量浓度0.5-5％的硫酸或盐酸，碱沉用的碱为浓氨水或碳酸的饱和液，调节酸化处理的溶液的pH值为7-10。

7、由权利要求1或4制备的环杷明在制备治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其中所述肿瘤为由Hn信号通路表达的肿瘤；所述药物组合物由所述活性成分环杷明与一种或多种药学上可接受的载体组成，其中，活性成分含量的重量比为0.1％-99.5％。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述肿瘤为胰腺癌，髓母细胞瘤或小细胞肺癌。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种环杷明的制备方法，具体地涉及一种以来源于藜芦属植物的介芬胺为原料制备环杷明的方法，以及该环杷明在治疗胰腺癌、髓母细胞瘤、小细胞肺癌等Hh信号通路表达的肿瘤方面的应用。

背景技术

Hedgehog(Hh)信号通路最早发现于果蝇，是引发果蝇幼虫发育的信号通路。进一步的研究表明，Hh信号通路包括Patched(Ptc)蛋白和Smoothened(Smo)蛋白及Ci(Gli)蛋白、Cos2蛋白、Fused激酶、蛋白SuFu的复合体，目的基因。Hh蛋白是一种分泌蛋白，经过自身的修饰获得活性；Patched蛋白是Hh信号蛋白的受体；Smo蛋白是Hh信号的转换器。当Hh蛋白存在时，Ptch失去对Smo的抑制作用，Smo蛋白活化，为复合体提供磷酸，促使Ci(Gli)转变为催化剂形式(155kDa)，进入细胞核启动下游基因转录；相反，当Hh蛋白缺失时，Smo受到Ptch抑制，Ci(Gli)被蛋白酶水解，其抑制剂形式(75kDa)在细胞核中阻止基因的转录。

Hh信号通路是众多动物胚胎发育及脏器、组织发育的信号通路。胚胎中Hh信号通路的缺失会引起发育缺陷或畸形。在越来越多的肿瘤中发现异常的Hh信号通路激活，因此，国内外学者逐步认识到Hh信号通路与肿瘤的发生有着密切的联系。并且随着在此领域研究的深入和范围的扩展，发现Hh信号通路的异常表达是引起基底细胞瘤、髓母细胞瘤、胰腺细胞癌、小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤疾病的原因。因此，抑制Hh信号通路的异常表达是治疗肿瘤的有效方法之一。

环杷明(cyclopamine)是存在于藜芦和贝母属植物中的一种异胆甾烷类生物碱，最初在1964年发现于毛叶藜芦(Veratrum grandiflorum(Maxim.)Loes.f.)(Masamune，T.，et al.，Bull.Chem.Soc.Jpn.38(8)：1374-1378(1965))。20世纪60年代到80年代对于环杷明的研究仅限于其致畸作用，直到20世纪90年代中期才发现环杷明是Hh信号通路的抑制剂，与多种肿瘤的发生发展有关(Cooper，M.K.，et al.，Science 280，1603-1607(1998))。

Johns Hopkings大学的Berman研究组将髓母细胞瘤细胞移植至大鼠，经过环杷明处理，发现环杷明能够抑制细胞生长，并且使大鼠体内的肿瘤缩小。Hutchinson癌症研究中心的Olson对髓母细胞瘤样品进行体外实验，发现环杷明能杀灭99.9％的肿瘤细胞(Bermn，D.M.，etal.，Science 297，1559-1561(2002))。在研究环杷明对胰腺癌细胞株的作用时发现，对Smo基因高表达的细胞株经环杷明处理后与对照组相比增殖率下降75％-80％，凋亡增加2.5-3.5倍。并且用环杷明治疗接种对环杷明敏感的细胞株的裸鼠时发现，治疗组50％-60％的肿瘤体积缩小。表明环杷明在体内和体外都可以通过Hh途径诱导细胞凋亡和阻断增值(Thayer，S.p.，etal.，Nature 425，851-855(2003))。

以上结果可以看出，环杷明只对Hh信号通路表达的肿瘤细胞具有抑制作用，表现出极强的专一性。而且早期的毒理研究表明，环杷明对正常细胞没有毒性，对实验动物的毒副作用也很小。许多专家认为这开启了治疗肿瘤的一个极具前景的新途径。该领域的权威，美国JohnsHopkings大学P.A.，Beachy称：目前的实验表明，环杷明杀死肿瘤细胞的速度快于以往的任何药物，而且对实验动物看不出任何副作用(Beachy，P.A.，et al.，Nature，411，349-354(2001))。但是，环杷明在植物中的含量很低，仅有万分之一，并且化学全合成极为困难。曾有过报道用介芬胺为原料采用Wolff-Kishner法还原得到环杷明，但在该方法中采用易燃高危险的肼，反应条件要求苛刻，产率低，仅有20％左右(Masamune，T.，et al.，Bull.Chem.Soc.Jpn.38(8)：1374-1378(1965))。后又有人采用改进的Wolff-Kishner-黄鸣龙法还原制备环杷明，但仍存在产物收率低的问题(约50％)，且有异构体3-表环杷明存在(周剑侠，等.中国药物化学杂志，16(5)：303-305(2006))。环杷明的来源问题成为其被开发成药品的一大障碍。

本课题组在研究中发现了环杷明的前驱物--介芬胺，其在该种藜芦中的含量较高，并且该种藜芦的资源丰富。发明人进行了40余次用介芬胺制备环杷明的反复实验，优化了反应条件，可以方便地高收率地制备得到环杷明，并且所需的反应条件容易达到，适于工业生产。通过介芬胺制备环杷明成为一条切实可行的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种反应快速方便、产率高的以介芬胺为原料制备环杷明的方法。

本发明提出的由介芬胺制备环杷明的方法，其步骤如下：将介芬胺原料和水合肼、强碱在相转移催化剂的催化下，在高沸点溶剂中反应，介芬胺和水合肼的摩尔比为1.1∶1-3∶1，反应温度为160-200℃，反应时间为2-7小时。反应用高沸点溶剂的用量为每g介芬胺用0.2-0.6L溶剂。反应结束后，加入水，并以中等极性的有机溶剂萃取，收集有机溶剂层，除去水分后浓缩，析出结晶即为环杷明。

反应中强碱为氢氧化钾或叔丁醇钾。高沸点溶剂为一缩二乙二醇、二甲基亚砜、1，3-丙二醇或乙二醇。

相转移催化剂可以用分子量为400的聚乙二醇，用量为反应溶剂体积的2～8％(ml/ml)，优选为5％。相转移催化剂也可以为苄基三乙基氯化铵(TEBA)，用量为介芬胺重量的1～3％(g/g)。

反应结束后萃取的中等极性的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或多种。

析出结晶后的母液中含有部分环杷明，用柱层析法进一步纯化，得到环杷明。柱层析所用的吸附剂为硅胶、氧化铝或聚酰胺。洗脱用的溶剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中的一种或多种。

从介芬胺合成环杷明的反应过程如下：

本发明中制备的环杷明的熔点及核磁数据与文献(Gaffield，W.，et al.，J.Nat.Prod.49(2)：286-292(1986))一致。

本发明中，所述原料介芬胺可从藜芦植物中提取获得，具体提取步骤如下：

将药材藜芦植物的干燥根茎粉碎后用乙醇热提或冷浸，将提取液或冷浸液浓缩；对浓缩的粗提物经酸化和碱沉处理，再用硅胶柱层析法，分离得到介芬胺；所用的洗脱剂是二氯甲烷和甲醇体系或石油醚和乙酸乙酯体系。

其中热提时采用75％的乙醇，热提2-4次，每次乙醇用量为药材(藜芦根茎)体积的3-5倍。冷浸用75％-95％的乙醇，优选95％的乙醇，冷浸2-4次，每次乙醇的用量为药材体积的4-10倍，优选5-7倍体积。酸化处理的酸为质量浓度为0.5％-5％的硫酸或盐酸，优选1％-2％的质量浓度。碱沉处理用的碱为浓氨水或碳酸钠的饱和液，调节酸化处理的溶液pH值为7-10，优选8-9。

介芬胺的结构式如下：

环杷明的结构式如下：

本发明还提出含有上述环杷明及一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过透皮吸收、口服、静脉注射给药的方式用于需要这种治疗的患者。用于透皮吸收时，可将其制成乳膏、软膏或凝胶贴片制剂；用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于静脉注射给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是乳膏贴片、片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂和注射剂。

环杷明对有Hh信号通路表达的胰腺癌、髓母细胞瘤、小细胞肺癌的细胞株的增殖表现出特异性抑制作用。因此，本发明制备的环杷明及上述药物组合物可用于这些肿瘤的治疗。

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

附图说明

图1为环杷明对胰腺癌肿瘤细胞株的抑制活性。

图2为环杷明对小细胞肺癌细胞株的抑制活性

图3为环杷明对结肠癌细胞株的抑制活性

具体实施方式

实施例1

取5kg藜芦根茎的粗粉，用95％的乙醇冷浸两次，每次的用量为30L的乙醇。冷浸液浓缩至流浸膏状，拌入0.5kg的硅藻土，晾至近干后装柱，用质量浓度2％的硫酸洗脱。洗脱下来的酸水用浓氨水调pH＝9，静置2h后过滤，得到的40g总生物碱。拌入100g 200-300目的硅胶中，另用1kg 200-300目硅胶装。用石油醚∶乙酸乙酯体系(5∶1-2∶1-1∶1-0∶1)洗脱，收集11-16馏分，各180mL。各馏分浓缩至60mL后于冰箱内静置过夜，析出淡黄色针状介芬胺，总重325mg。经HPLC检测含量达99.1％。

实施例2

取5kg藜芦根茎的粗粉，用75％的乙醇热提3次，每次的用量为15L的乙醇。提取液浓缩至无醇味，剩余物用2％的硫酸酸化至pH＝1。离心，取上清液，用浓氨水调pH＝9，用氯仿萃取3次，每次2L。氯仿层浓缩至0.5L，拌入200g 200-300目的硅胶中蒸干，另用2kg200-300目硅胶装。用二氯甲烷∶甲醇体系(20∶1-10∶1-5∶1-2∶1)洗脱，收集8-12馏分，各180mL，浓缩后上Sephadex-LH20，用甲醇洗脱，除去少量的黄酮和色素。馏分浓缩至60mL后于冰箱内静置过夜，析出淡黄色针状介芬胺，总重289mg。经HPLC检测含量达98％以上。

实施例3

将50mg介芬胺溶于30mL二缩乙二醇，加入10μL水合肼，5％体积比的聚乙二醇400和0.2g的氢氧化钾，在160℃下搅拌，2h后降温至120℃，除去水份，再升温至190±5℃，反应2.5h左右。反应液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩至5mL，于冰箱内静置过夜，析出无色针状结晶28mg，母液上硅胶柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脱，得到白色粉末6mg，共计34mg，收率70.3％。TLC展开后喷KBiI4显色，只有一个斑点。熔点125-128℃，¹H-NMR，¹³C-NMR数据如表1，与文献(Gaffield，W.，et al.，J.Nat.Prod.49(2)：286-292(1986))基本一致。

实施例4

将50mg介芬胺溶于15mL二缩乙二醇，加入7μL水合肼，2％体积比的聚乙二醇400，在160℃下搅拌，2h后降温至120℃，除去水份，加入0.2g的氢氧化钾，再升温至190±5℃，反应4h左右。反应液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩至5mL，于冰箱内静置过夜，析出无色针状结晶36mg，母液上硅胶柱，用梯度的二氯甲烷∶甲醇混合液洗脱，得到白色粉末5mg，共计41mg，收率82％。TLC展开后喷KBiI₄显色，只有一个斑点。熔点125-128℃，与实施例3中的晶体混合后熔点不下降。ESI：[M+H]412。

实施例5

将50mg介芬胺溶于15mL二缩乙二醇，加入10μL水合肼，1mg的TEBA和0.3g的氢氧化钾，在160℃下搅拌，2h后降温至120℃，除去水份，再升温至190±5℃，反应2.5h左右。反应液加入50mL水中，用100mL×2氯仿萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩至6mL，于冰箱内静置过夜，析出无色针状结晶28mg，母液上硅胶柱，用梯度的二氯甲烷∶甲醇混合液洗脱，得到白色粉末5mg，共计33mg，收率66％。TLC展开后喷KBiI₄显色，只有一个斑点。熔点125-128℃，与实施例3中的晶体混合后熔点不下降。ESI：[M+H]412。

实施例6

将50mg介芬胺溶于25mL乙二醇，加入20μL水合肼，5％体积比的聚乙二醇400和0.2g的氢氧化钾，在反应瓶上加上除水装置，在160℃，0.06MPa真空度下回流2h，恢复至常压后升温至195-200℃，反应4h左右。反应液加入40mL水中，用40mL×2二氯甲烷萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩至5mL，于冰箱内静置过夜，析出无色针状结晶33mg，母液上氧化铝柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脱，得到白色粉末5mg，共计38mg，收率76％。TLC展开后喷KBiI₄显色，只有一个斑点。熔点125-128℃，与实施例3中的晶体混合后熔点不下降。ESI：[M+H]412。

实施例7

将50mg介芬胺溶于15mL DMSO中，加入10μL水合肼，8％体积比的聚乙二醇400和0.1g的氢氧化钾，在160℃下搅拌，2h后降温至120℃，除去水份，再升温至190±5℃，反应4h左右。反应液加入100mL水中，用100mL×2丙酮萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩至5mL，于冰箱内静置过夜，析出无色针状结晶26mg，母液上硅胶柱，用梯度的石油醚∶乙酸乙酯混合液洗脱，得到白色粉末10mg，共计36mg，收率72％。TLC展开后喷KBiI₄显色，只有一个斑点。熔点125-128℃，与实施例3中的晶体混合后熔点不下降。ESI：[M+H]412。

实施例8

将50mg介芬胺溶于15mL二缩乙二醇，加入10μL水合肼，5％体积比的聚乙二醇400，在160℃，0.06MPa真空度条件下回流2.5h，降温至30℃，加入0.4g的叔丁醇钾，反应6h左右。反应液加入60mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩至6mL，于冰箱内静置过夜，析出无色针状结晶29mg，母液上硅胶柱，用梯度的乙酸乙酯∶丙酮混合液洗脱，得到白色粉末8mg，共计37mg，收率74％。TLC展开后喷KBiI₄显色，只有一个斑点。熔点125-128℃，与实施例3中的晶体混合后熔点不下降。ESI：[M+H]412。

实施例9

将50mg介芬胺溶于20mL乙醇，加入10μL水合肼，5％体积比的聚乙二醇400和0.2mL37％的盐酸，回流12h，浓缩至5mL，冷却析出46mg的淡黄色针状结晶，收率89.1％。将其溶于15mL DMSO中，加入0.4g叔丁醇钾，于30℃搅拌6h，反应液加入50mL水中，用100mL×2乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。浓缩至5mL，于冰箱内静置过夜，析出无色针状结晶32mg，母液上硅胶柱，用梯度的石油醚∶氯仿混合液洗脱，得到白色粉末5mg，共计37mg，收率74％。TLC展开后喷KBiI₄显色，只有一个斑点。熔点125-128℃，与实施例3中的晶体混合后熔点不下降。ESI：[M+H]412。

实施例10

环杷明抑制胰腺癌细胞株的增殖。

采用噻唑蓝还原法(MTT法)测定环杷明对人胰腺癌细胞株BXPC3，CEPAC，SW1990增殖抑制活性。

方法：取对数生长期的人癌细胞株分装于96孔培养板中，0.25mL/孔。实验设DMSO对照组，3个不同浓度环杷明组。药物与细胞培养96h，第48h换液，在实验结束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h后去处培养液，加入100μL DMSO/孔，待结晶溶解后置酶联检测仪，用540nm波长测各孔的吸光度值(A)。

结果见图1。可以看出，胰腺癌细胞株CEPAC和SW1990对环杷明具有明显的量效关系。这表明环杷明在体外具有抗肿瘤作用，同时也表明胰腺癌细胞株CEPAC和SW199是有效的Hh通路转导抑制剂。

实施例11

环杷明抑制小细胞肺癌细胞株的增殖。

采用噻唑蓝还原法(MTT法)测定环杷明对人小细胞肺癌细胞株LTEP-Sm1和NCI-H446增殖抑制活性。

方法：取对数生长期的人小细胞肺癌细胞株分装于96孔培养板中，0.25mL/孔。实验设DMSO对照组，3个不同浓度环杷明组。药物与细胞培养96h，第48h换液，在实验结束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h后去处培养液，加入100μL DMSO/孔，待结晶溶解后置酶联检测仪，用540nm波长测各孔的吸光度值(A)。

结果见图2。可以看出，人小细胞肺癌细胞株LTEP-Sm1和NCI-H446对环杷明具有明显的量效关系。这表明环杷明在体外具有抗肿瘤作用，同时也表明人小细胞肺癌细胞株LTEP-Sm1和NCI-H446是有效的Hh通路转导抑制剂。

实施例12

环杷明抑制结肠癌细胞株的增殖。

采用噻唑蓝还原法(MTT法)测定环杷明对人结肠癌细胞株LOVO和HCT-8增殖抑制活性。

方法：取对数生长期的人结肠癌细胞株分装于96孔培养板中，0.25mL/孔。实验设DMSO对照组，3个不同浓度环杷明组。药物与细胞培养96h，第48h换液，在实验结束前4h每孔加入20μL MTT液(5μg/mL)，4h后去处培养液，加入100μL DMSO/孔，待结晶溶解后置酶联检测仪，用540nm波长测各孔的吸光度值(A)。

结果见图3。可以看出，人结肠癌细胞株LOVO和HCT-8对环杷明具有明显的量效关系。这表明环杷明在体外具有抗肿瘤作用，同时也表明胰腺癌细胞株LOVO和HCT-8是有效的Hh通路转导抑制剂。

表1.环杷明的1H-NMR和13C-NMR数据

以介芬胺为原料制备环杷明的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。