专利摘要

本发明属于医药技术领域，涉及愈创木烷型倍半萜及其制备和应用。具体涉及从中药芫花根中分离的5个愈创木烷类倍半萜化合物及其在神经保护生物活性方面的用途。所述的愈创木烷型倍半萜化合物及其药学上可接受的盐、异构体结构如下。本发明的化合物通过如下方法制备：芫花根用乙醇提取，提取液减压浓缩，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将乙酸乙酯萃取物继而硅胶柱色谱、大孔树脂、ODS、HPLC等手段可以分离得到5个化合物。

权利要求

1.如下结构的愈创木烷型倍半萜化合物及其药学上可接受的盐：

。

2.如权利要求1所述的愈创木烷型倍半萜化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取干燥的芫花根以70-80%乙醇回流提取3次,合并提取液浓缩得到浸膏，所得浸膏先后采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集到4个馏分A-D；

（2）馏分A经HP20柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到2个馏分A1- A2；

（3）馏分A1，A2经ODS柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到3个馏分A1-1，A2-1，A3-1；

（4）馏分A1-1，A2-1和A3-1分别经硅胶柱色谱，收集馏分得到A-1-1-1至A-1-1-3, A-2-1-1至A-2-1-16 以及 A-3-1-1至A-3-1-14；

（5）馏分A-2-1-4，A-2-1-8，A-3-1-9，A-3-1-12分别经反相HPLC，以CH3CN-H2O洗脱，得到化合物1 、 3-5 。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中乙醇水的浓度为：50%-90%。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中乙醇水的浓度为：30-90%。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中硅胶柱色谱的条件为：石油醚-乙酸乙酯50:1-1:1梯度洗脱。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，馏分A-2-1-4，A-2-1-8，A-3-1-9，A-3-1-12经反相HPLC，流动相为：40%-50%的CH3CN -H2O。

7.药物组合物，包含权利要求1所述的愈创木烷型倍半萜化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。

8.权利要求1所述的愈创木烷型倍半化合物及其药学上可接受的盐在制备神经保护药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的愈创木烷型倍半萜化合物及其药学上可接受的盐通过逆转细胞凋亡来保护SH-SY5Y细胞。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及愈创木烷型倍半萜及其制备和应用。具体涉及从中药芫花根中分离的5个愈创木烷类倍半萜化合物及其在神经保护生物活性方面的用途。

背景技术

芫花根为瑞香科瑞香属植物芫花的根部，味苦、辛，性温，有毒，具有逐水，解毒，散结之功效，用于水肿，瘰疬，乳痈，痔瘘，疥疮，风湿痹痛。目前对其抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫功能调节等方面研究较多。芫花根中化学成分丰富，包括倍半萜类、二萜原酸酯类、黄酮类、香豆素类、木脂素类、绿原酸类及酚苷类，其中二萜类、黄酮类化合物为主要的生物活性成分，而最近的研究表明芫花根中的倍半萜类化合物同样具有较好的生物活性。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一系列愈创木烷型倍半萜类化合物，并提供了它们在制备神经保护生物药物中的应用。

本发明涉及如下结构的愈创木烷型倍半萜化合物及其药学上可接受的盐、异构体：

本发明的化合物制备方法经过以下步骤：

芫花根用乙醇提取，提取液减压浓缩，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将乙酸乙酯萃取物继而硅胶柱色谱、大孔树脂、ODS、HPLC等手段可以分离得到以上5个化合物。

具体地，本发明包括如下步骤：

(1)取干燥的芫花根以70％-80％工业乙醇回流提取3次,合并提取液浓缩得到浸膏。所得浸膏先后采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集到4个馏分(A-D)。

(2)馏分A经HP20柱色谱，以乙醇水梯度洗脱洗脱，共收集到2个馏分(A1–A2)。

(3)馏分A1，A2经ODS柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到3个馏分(A1-1，A2-1，A3-1)。

(4)馏分A1-1，A2-1和A3-1分别经硅胶柱色谱，收集馏分得到A-1-1-1—A-1-1-3,A-2-1-1—A-2-1-16以及A-3-1-1—A-3-1-14。

(5)馏分A-2-1-8经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物1；馏分A-2-1-4经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物2和4；馏分A-3-1-9经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物3；馏分A-3-1-12经反相HPLC，以CH₃CN-H₂O洗脱，得到化合物5。

其中：

步骤(1)中二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇的梯度为：100:1-1:1，具体为100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1。

步骤(2)中乙醇水的浓度为：50％-90％。

步骤(3)中乙醇水的浓度为：30-90％，具体为30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％。

步骤(4)中硅胶柱色谱的条件为：石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱50:1-1:1，具体为50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1)。

步骤(5)中色谱条件为：40％-50％的CH₃CN-H₂O。

本发明所述的新的愈创木烷型倍半萜化合物(Genkwanoid G、Genkwanoid H、Genkwanoid I、Genkwanoid J、Genkwanoid K)的结构解析。

化合物1：黄色油状物(二氯甲烷)， HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 273.1463(calcd for C₁₅H₂₂O₃Na,273.1461)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₂O₃，计算不饱和度为5。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.70(3H,s),δ_H0.81(3H,d,J＝7.1Hz)为两个甲基氢信号，δ_H 3.58(1H,dd,J＝12.3,3.1Hz),4.02(1H,dd,J＝12.3,3.5Hz),3.63(1H,o)3.63(1H,o)为两组连氧磁不等同的CH₂上的偕偶氢信号，δ_H4.34(1H,o)为连氧叔碳且无偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物1为倍半萜。δ_C 210.6为孤立的羰基碳信号，δ_C 122.3,149.3为双键碳信号，δ_C58.7,63.5,87.0为连氧碳信号。推测化合物1不存在末端双键，增加了一个羟甲基，通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。在HMBC谱中，H₃-15(δ_H 0.81)与C-3(δ_C31.9),C-4(δ_C 38.3),C-5(δ_C 43.2)相关，H₃-14(δ_H 1.70)与C-1(δ_C 149.3),C-9(δ_C 87.0),C-10(δ_C 122.3)相关，从而确定了甲基的位置。H-7(δ_H 2.05),H-9(δ_H 4.25)与C-8(δ_C210.6)存在相关，证实了羰基的位置。H₂-12(δ_H 3.63)与C-11(δ_C 47.6),C-13(δ_C 58.7)存在相关，证实了羟甲基的位置。根据以上相关信息建立了化合物1平面结构，化合物1为愈创木烷型倍半萜。通过NOESY谱确定了化合物1的相对构型，如图5所示，H₃-15(δ_H 0.81)与H-3β(δ_H 1.41)相关，H-3α(δ_H 1.60)与H-5(δ_H 2.26)相关，H-5(δ_H 2.26)与H-7(δ_H 2.05)相关，H-7(δ_H 2.05)与H-12(δ_H 3.63)相关。因此确定化合物1的相对构型为4S*,5S*,7R*,8R*,11S*。化合物1的绝对构型是通过计算比旋光度与实测比旋光度进行比对确定的，采用密度泛函理论(DFT)，在B3LYP/6-311++G(2d,p)水平下分别对(4S,5S,7R,8R,11S)-1构型和其对映异构体进行计算。化合物1的实测旋光为+22.0，(4S,5S,7R,8R,11S)-1的计算旋光值为+24.5，其对应异构体为-24.5。因此，化合物1的绝对构型进一步确定为4S,5S,7R,8R,11S。

经scifinder数据库检索，化合物1为未报道的新化合物，命名为Genkwanoid G。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表，相关图谱见附图1-图5。

Genkwanoid G的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

化合物2：黄色油状物(二氯甲烷)， HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 289.1411(calcd for C₁₅H₂₂O₄Na,289.1410)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₂O₄，计算不饱和度为5。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.70(3H,s),δ_H0.82(3H,d,J＝7.0Hz)为两个甲基氢信号，δ_H 3.48(1H,dd,J＝12.4,1.8Hz),3.87(1H,m),3.53(1H,o)3.53(1H,o)为两组连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 4.34(1H,s)为连氧叔碳且无偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物2为倍半萜。δ_C 208.8为孤立的羰基碳信号，δ_C 122.0,149.5为双键碳信号，δ_C 61.9,63.9,78.8,86.3为连氧碳信号。以上碳氢信号与化合物1极为相近，推测二者差异在于化合物2增加了一个连氧碳信号，减少了一个脂肪碳信号，分子量相对于化合物1增加了16个质量单位，推测化合物1的7位被羟基取代，通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。在HMBC谱中，H₃-15(δ_H 0.82)与C-3(δ_C 32.0),C-4(δ_C 38.3),C-5(δ_C 42.7)相关，H₃-14(δ_H 1.70)与C-1(δ_C 149.5),C-9(δ_C 86.3),C-10(δ_C 122.0)相关，从而确定了甲基的位置。H-7(δ_H 2.82),H-9(δ_H 4.34)与C-8(δ_C 208.8)存在相关，证实了羰基的位置。H₂-13(δ_H 3.48,3.87)与C-11(δ_C 78.8),C-12(δ_C 63.9)存在相关，证实了羟基及羟甲基的位置。根据以上相关信息建立了化合物2平面结构，化合物2为愈创木烷型倍半萜。通过NOESY谱确定了化合物2的相对构型，如图10所示，H₃-15(δ_H 0.82)与H-3β(δ_H 1.39)相关，H-3α(δ_H 1.61)与H-5(δ_H 2.29)相关，H-5(δ_H 2.29)与H-7(δ_H 2.82)相关，H-7(δ_H 2.82)与H-12(δ_H 3.53)相关。因此确定化合物2的相对构型为4S*,5S*,7R*,8R*,11R*。化合物2的绝对构型是通过计算比旋光度与实测比旋光度进行比对确定的，化合物2的实测旋光为+25.0，(4S,5S,7R,8R,11R)-2构型的计算旋光值为+6.0，其对应异构体为-6.0。因此，化合物2的绝对构型进一步确定为4S,5S,7R,8R,11R。

经scifinder数据库检索，化合物2为未报道的新化合物，命名为Genkwanoid H。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表。

Genkwanoid H的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

化合物3:黄色油状物(二氯甲烷)， HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 289.1413(calcd for C₁₅H₂₂O₄Na,289.1410)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₂O₄，计算不饱和度为5。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.69(3H,s),δ_H0.88(3H,d,J＝7.1Hz)为两个甲基氢信号，δ_H 3.47(1H,o),3.71(1H,o),3.49(1H,o),3.71(1H,o)为两组连氧磁不等同的CH₂上偕偶氢信号，δ_H 4.24(1H,s)为连氧叔碳且无偶合的氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物3为倍半萜。δ_C 207.9为孤立的羰基碳信号，δ_C 121.3,150.2为双键碳信号，δ_C 60.9,66.6,75.0,85.7为连氧碳信号。以上碳氢信号与化合物2极为相近，羟甲基的碳氢信号相别较明显，分子量与化合物2相同。因此，推测3为化合物2的差向异构体。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。在HMBC谱中，H₃-15(δ_H 0.88)与C-3(δ_C 32.1),C-4(δ_C 38.5),C-5(δ_C 42.3)相关，H₃-14(δ_H1.69)与C-1(δ_C 150.2),C-9(δ_C 85.7),C-10(δ_C 121.3)相关，从而确定了甲基的位置，H-7(δ_H 2.87),H-9(δ_H 4.24)与C-8(δ_C 207.9)存在相关，证实了羰基的位置。H₂-13(δ_H 3.49,3.71)与C-11(δ_C 75.0),C-12(δ_C 66.6)存在相关证实了羟基及羟甲基的位置。根据以上相关信息建立了化合物3平面结构，化合物3为愈创木烷型倍半萜。通过NOESY谱确定了化合物3的相对构型，如图15所示，H₃-15(δ_H 0.88)与H-3β(δ_H 1.42)相关，H-3α(δ_H 1.64)与H-5(δ_H2.33)相关，H-5(δ_H 2.33)与H-7(δ_H 2.87)相关，H-7(δ_H 2.87)与H-6α(δ_H 1.82)相关，H₂-12(δ_H 3.47,3.71)与H-6β(δ_H 1.47)相关。因此确定化合物3的相对构型为4S*,5S*,7R*,8R*,11S*。化合物3的绝对构型是通过计算比旋光度与实测比旋光度进行比对确定的，化合物3的实测旋光为+22.0，(4S,5S,7R,8R,11S)-3构型的计算旋光值为+22.3，其对应异构体为-22.3。因此，化合物3的绝对构型进一步确定为4S,5S,7R,8R,11S。

经scifinder数据库检索，化合物3为未报道的新化合物，命名为Genkwanoid I。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表。

Genkwanoid I的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

化合物4：黄色油状物(二氯甲烷)， HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 273.1462(calcd for C₁₅H₂₂O₃Na,273.1461)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₂O₃，计算不饱和度为5。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 1.06(3H,d,J＝6.8Hz)，δ_H 1.59(3H,s),δ_H 1.87(3H,s)为三个甲基氢信号，δ_H 3.65(1H,d,J＝11.1Hz),3.90(1H,d,J＝11.1Hz)，4.57(1H,d,J＝16.8Hz)，4.63(1H,d,J＝16.8Hz)为两组连氧氢信号，在δ_H 1.5-2.9范围内显示出一系列脂氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物4为倍半萜。δ_C 125.9,158.4,175.6为α,β-不饱和酮的碳信号，δ_C126.5,142.4为双键碳信号，δ_C 64.8,72.9为连氧碳信号。通过HSQC谱将全部碳氢直接相关信号进行了全归属。同时在HMBC谱中，H₃-14(δ_H 1.59)与C-1(δ_C 142.4),C-9(δ_C 64.8),C-10(δ_C126.5)相关,H₃-12(δ_H 1.87)与C-7(δ_C 125.9),C-11(δ_C 158.4),C-13(δ_C 72.9)相关，H₃-15(δ_H 1.59)与C-3(δ_C 30.1),C-4(δ_C 38.6),C-5(δ_C 43.8)相关，H-6(1.92,2.36)与C-5(δ_C43.8),C-7(δ_C 125.9),C-8(δ_C175.6)相关，以上相关建立了化合物4的平面结构，化合物4为愈创木内酯。通过NOESY谱确定了化合物4的C-4,C-5和C-1,C-10的相对构型。H₃-15(δ_H1.06)与H-6α(δ_H 2.36)存在相关，H₃-15(δ_H 1.06)与H-5(δ_H 2.86)未观测到相关，表明H-5和H₃-15处于相反的方向。因此，C-4,C-5的相对构型定为4S*,5S*。H₃-14(δ_H 1.59)与H-2(δ_H2.26.2.33)的相关确定了Δ^1,10.为Z构型。化合物4的绝对构型是通过计算比旋光度与实测比旋光度进行比对确定的，化合物4的实测旋光为+9.0，(4S,5S)-4构型的计算旋光值为+80.9,其对映异构体为-80.9。因此，化合物4的绝对构型进一步确定为4S,5S。

经scifinder数据库检索，化合物4为未报道的新化合物，命名为Genkwanoid J。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表。

Genkwanoid J的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

化合物5：黄色油状物(二氯甲烷)， HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺峰m/z 289.1404(calcd for C₁₅H₂₂O₄Na,289.1410)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₅H₂₂O₄，计算不饱和度为4。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H 0.95(3H,s),δ_H1.06(3H,d,J＝6.1Hz),δ_H 1.47(3H,s)为三个甲基氢信号，δ_H 3.61(1H,dd,J＝11.5,7.0Hz),3.67(1H,d,J＝11.5Hz)为一组连氧氢信号，δ_H 2.15(1H,d,J＝19.3Hz),2.51(1H,d,J＝19.3Hz)显示出一组偕偶CH₂氢信号。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)显示出15个碳信号，提示化合物5为倍半萜。δ_C 217.2,218.6为两个羰基碳信号，δ_C 61.4,83.5为连氧碳信号。同时在HMBC谱中，H-1(δ_H 2.02),H-3(δ_H 2.27,2.37)与C-2(δ_C 217.2)相关，证实了2位是双键，H₃-14(δ_H 1.59)与C-1(δ_C 142.4),C-9(δ_C 64.8),C-10(δ_C 126.5)相关，H₃-15(δ_H 1.59)与C-3(δ_C 30.1),C-4(δ_C 38.6),C-5(δ_C 43.8)相关，证实两个甲基的位置，H-6(δ_H 2.43,1.47)与H-5(δ_H 2.27),H-7(δ_H 1.91)相关证实7位为连氧碳，H₂-13(δ_H 3.61,3.67)与C-10(δ_C43.3),C-11(δ_C 49.5)相关证实了羟甲基的位置，以上HMBC相关建立了化合物5的平面。化合物5的相对构型，由NOESY谱确定了化合物5的相对构型，H₃-15(δ_H 1.06)与H-6β(δ_H 1.91)相关,H-9β(δ_H 2.51)与H-13α(δ_H 3.67)相关，H-1(δ_H 2.02)与H-5(δ_H 2.43)和H-9α(δ_H2.15)相关，H-5(δ_H 2.43)与H-9α(δ_H 2.15)相关，并未观测到H-5(δ_H 2.43)与H₃-15(δ_H1.06)的相关。因此，化合物5的相对构型定为1S*,4S*,5S*,7S*,10S*,11R*。化合物5的绝对构型是通过计算比旋光度与实测比旋光度进行比对确定的，(1S,4S,5S,7S,10S,11R)-5的计算旋光值为+113.2，实测旋光值为+68.0。因此，化合物5的绝对构形定为1S,4S,5S,7S,10S,11R，将其命名为genkwanoid K。

经scifinder数据库检索，化合物5为未报道的新化合物，命名为Genkwanoid K。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表。

Genkwanoid K的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

对本发明涉及的5个愈创木烷型倍半萜进行神经保护活性评价。其步骤如下：

将细胞以DMEM完全培养液静置4h，并使用不同浓度的化合物1-5(25,50,100μM)预处理SH-SY5Y神经细胞1h，后加入终浓度为200μM的H₂O₂培养36h。随后加入0.5mg/mL MTT的磷酸盐缓冲溶液20μL/孔，并在37℃下放置4h。除去上清液并加入DMSO(150mL/孔)，恒温振荡器上振荡10min，以H₂O₂(200μM)单独处理的细胞为对照组，以trolox为阳性药。检测不同浓度处理的细胞在490nm利用紫外分光光度计进行检测(Thermo Scientific MultiskanMK3,上海,中国)。细胞的存活程度以存活百分比表示。结果表示化合物1-5显示出与阳性药Trolox相当的对H₂O₂诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤保护作用活性。

其神经保护作用的数据如下表：

附图说明

图1为Genkwanoid G的HSQC谱

图2为Genkwanoid G的HMBC谱

图3为Genkwanoid G的NOESY谱

图4为Genkwanoid H的HSQC谱

图5为Genkwanoid H的HMBC谱

图6为Genkwanoid H的NOESY谱

图7为Genkwanoid I的HSQC谱

图8为Genkwanoid I的HMBC谱

图9为Genkwanoid I的NOESY谱

图10为Genkwanoid J的HSQC谱

图11为Genkwanoid J的HMBC谱

图12为Genkwanoid J的NOESY谱

图13为Genkwanoid K的HSQC谱

图14为Genkwanoid K的HMBC谱

图15为Genkwanoid K的NOESY谱

图16为化合物在体外对由H₂O2诱导的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用

图17为化合物对H₂O₂诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响。

具体实施方式

实施例1芫花根新倍半萜化合物1-5的制备

将芫花(50kg)的根部研磨成碎片，并在70％乙醇-水(1：8,v/v,400L×2h)条件下在加热回流萃取三次。过滤粗提物并减压浓缩。然后将萃取物悬浮在水中，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。将乙酸乙酯层(1000g)进行硅胶柱色谱分离(200-300目)，用二氯甲烷/甲醇洗脱，得到流分A-D。将流分A在HP20大孔树脂上用乙醇-水(50％，90％)进行分离，得到流分A-1和A-2。通过ODS用递增的乙醇/水梯度洗脱进一步纯化流分A-1和A-2，得到流分A-1-1,A-2-1,A-3-1。A-1-1,A-2-1和A-3-1进一步经过硅胶柱色谱，得到流分A-1-1-1至A-1-1-3、A-2-1-1至A-2-1-16和A-3-1-1至A-3-1-14。其中，通过半制备HPLC用乙腈-水(48:52)洗脱，从流分A-2-1-4分离出化合物Genkwanoid H(24mg,t_R 35.5min)、Genkwanoid J(13mg,t_R 25.0min)；用乙腈-水(40:60)洗脱，从流分A-2-1-8分离化合物Genkwanoid G(55mg,t_R 35.9min)。用乙腈-水(43:57)做流动相，从流分A-3-1-9纯化得到化合物Genkwanoid I(24mg,t_R 24.5min)；用乙腈-水(46:54)做流动相，纯化流分A-3-1-12，得到化合物Genkwanoid K(30mg,t_R 41.2min)。

实验例2本发明中的化合物在体外对由H₂O2诱导的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用测定

(1)细胞培养。

神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系(购自美国模式培养物集存库ATCC,Manassas,USA)以含10％FBS的DMEM培养基(购自美国洛根海克龙Hyclone,Logan,USA)，在37℃,5％CO₂的培养箱中培养，24h后细胞贴壁，弃掉旧培养液。

(2)细胞分组

空白组：不含任何药物，仅用DMEM完全培养液培养。

模型组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入200μM H₂O₂，继续培养36小时。

阳性药组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入50μM Trolox培养1小时，再加入200μM H₂O₂，继续培养36小时。

化合物1组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM)化合物1培养1小时，再加入200μM H₂O₂，继续培养36小时。

化合物2组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM)化合物2培养1小时，再加入200μM H₂O₂，继续培养36小时。

化合物3组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM)化合物3培养1小时，再加入200μM H₂O₂，继续培养36小时。

化合物4组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM)化合物4培养1小时，再加入200μM H₂O₂，继续培养36小时。

化合物5组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM)化合物5培养1小时，再加入200μM H₂O₂，继续培养36小时。

MTT检测

加入MTT溶液(0.5mg/mL)20μL孔，37℃继续孵育4h。后弃掉废液，加入DMSO 150μL/孔，恒温振荡器上振荡10min，并用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan MK3,Shanghai,China)于490nm处检测各孔吸光度值。

细胞存活率/％＝(实验组A值/空白对照组A值)×100％

(3)实验结果

实验结果如图16所示，与空白组相比，H₂O₂处理的细胞存活率降低。与阳性药对照组相比，50μM化合物3和化合物4对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞损伤保护作用均更强。实验例7Annexin V-FITC/PI双染法检测化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5对H₂O₂诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响。

(4)细胞培养

步骤同实验例2

(5)细胞分组

具体步骤同实施例2，其中，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5的浓度均为12.5μM。

应用Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。在室温下先用Annexin V-FITC染色，再用PI染色15分钟。采用流式细胞仪(Becton Dickinson,FranklinLakes,USA)进行凋亡率定量，然后立即通过FACScan流式细胞术(BD Biosciences,NJ,USA)分析染色的细胞。

(6)实验结果

实验结果如图17所示，与对照组相比，单用200μM H₂O₂处理时，细胞凋亡率明显升高。而用12.5μM的化合物3和化合物4预处理后，H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率降低。以上结果表明，化合物3和化合物4对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用。

愈创木烷型倍半萜及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。