吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物及其制备方法和用途

IPC分类号 : C07D209/40,C07D401/06,C07D403/06,A61K31/555,A61P35/00

申请号

CN201610850983.7

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专利摘要

本申请公开了通式(I)所示的吲哚啉‑2‑酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物，其中，各取代基的定义详见说明书。此外，还公开了上述化合物的制备方法、包含其的药用组合物。该通式(I)所示的化合物对人乳腺癌、人结肠癌细胞的增殖具有抑制作用，可用作抗肿瘤药物或作为抗肿瘤活性成分用于制备抗肿瘤药物。

权利要求

1.一种吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物，其选自下列化合物中的一种：

双(((Z)-((E)-(5-氟-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂；

双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂。

2.如权利要求1所述的配合物的制备方法，包括如下步骤：

(Z)-N′-(5-氟-1-(2-吗啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯与1,5-环辛二烯二氯化铂反应，得到双(((Z)-((E)-(5-氟-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂；

或者，(Z)-N′-(5-甲氧基-1-(2-吗啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(配体I′b)与1,5-环辛二烯二氯化铂反应，得到双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂。

3.包含权利要求1所述配合物的药物组合物。

4.权利要求1所述的配合物或权利要求3所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

说明书

技术领域

本申请涉及药物化学领域，更具体地说涉及吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物，及其制备方法和它们在抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

顺铂(cis-diaminedichloroplatinum(II),cDDP)和其他铂类抗肿瘤剂在恶性肿瘤治疗中具有良好的疗效。顺铂作用于含氮碱基与DNA双链形成链内交联进而诱导细胞凋亡(Wong,E.；Giandomenico,C.M.Current status of platinum-based antitumor drugs.Chem.Rev.1999,99,2451-2466)。由于铂类抗癌药物在治疗过程中具有严重的毒副作用和耐药性，使得研究者致力于寻找高效、低毒的金属抗癌药物(Alama,A.；Tasso,B.；Novelli,F.；Sparatore,F.Organometallic compounds in oncology:implications of novel organotins as antitumor agents.Drug Discov.Today 2009,14,500-508)。

肼基二硫代甲酸酯的席夫碱衍生物作为硫-氮螯合剂被广泛应用。这些衍生物能与铜、锌、镍或钯形成稳定的金属配合物，并表现出良好的生物活性。例如，Ali等合成了多种金属离子[M＝Ni²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺]的吲哚啉-2-酮缩氨基硫脲衍生物的配合物(见下式a和b)，但未报道其生物活性(Ali,M.A.；Hj Abu Bakar,H.J.；Mirza,A.H.；Smith,S.J.；Gahan,L.R.；Bernhardt,P.V.Preparation,spectroscopic characterization and X-ray crystal and molecular structures of nickel(II),copper(II)and zinc(II)complexes of the Schiff base formed from isatin and S-methyldithiocarbazate(Hisa-sme).Polyhedron 2008,27,71-79.)。

本课题组曾合成了一系列的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物，其对人结肠癌HCT-116、乳腺癌MCF-7细胞表现出良好的抗增殖活性[曹胜利，许兴智，廖蓟，马丽，丁盼盼，林慧慧，高曼，N-取代的吲哚-2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯及其制备方法和用途，专利号ZL201410459107.2]。

发明内容

本申请的发明人开发了一种吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物，该化合物对人结肠癌HCT-116、乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞具有优异的抗增殖作用。

本申请的目的是提供一种吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物。

本申请的另一个目的是提供上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的制备方法。

本申请的又一个目的是提供包含上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的药用组合物。

本申请的再一个目的是提供上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物或包含其的药用组合物作为抗肿瘤药物的用途或在制备抗肿瘤药物中的用途。

具体地说，本申请提供了一种吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物，如通式(I)所示：

其中，式(I)中R₁为-NR₂(R₃)，这里，R₂和R₃各自独立地选自氢或未取代的C1-C4烷基，或R₂和R₃及其所连接的氮原子一起形成含至少一个氮原子的未取代的四至七元杂环、或取代的四至七元杂环；这里，所述取代的四至七元杂环是指该杂环被任意个未取代的C1-C4烷基、未取代的C1-C4烷氧基、未取代的苯基或未取代的C1-C4烷氧羰酰基所取代；这里，所述的未取代的C1-C4烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；所述未取代的C1-C4烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基；所述未取代的C1-C4烷氧羰酰基选自甲氧羰酰基、乙氧羰酰基、正丙氧羰酰基、异丙氧羰酰基、正丁氧羰酰基、异丁氧羰酰基或叔丁氧羰酰基；

R₄、R₅、R₆和R₇各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基、未取代的C1-C4烷氧基、卤素、硝基、或羟基；这里，所述未取代的C1-C4烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；所述未取代的C1-C4烷氧基选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基；所述卤素选自氟、氯、溴或碘；

优选地，R₄、R₅、R₆和R₇各自独立地选自氢、甲基、甲氧基、氟、氯、溴、碘、硝基、或羟基；更优选地，R₄、R₅和R₆其中一个为甲基、甲氧基、氟、氯、溴、碘、硝基、或羟基，而R₄、R₅和R₆中其余两个以及R₇都为氢；或者，R₅和R₇各自独立地选自甲基、甲氧基、氟、氯、溴、碘、硝基、或羟基，而R₄和R₆都为氢；

优选地，R₁为含至少一个氮原子的未取代的四至七元杂环或者取代的四至七元杂环；这里，所述含至少一个氮原子的未取代的四至七元杂环选自四氢吡咯烷、吗啉、哌啶、或哌嗪；所述取代的四至七元杂环选自2-甲基哌啶、4-甲基哌啶、4-甲基哌嗪、4-苯基哌嗪、或4-叔丁氧羰酰基哌嗪。

作为一种优选的实施方案，本申请提供的式(I)化合物为下列式(II)化合物：

其中，R₁在式(II)化合物中的定义与在式(I)化合物中的定义相同，R₅为氟、甲基或甲氧基。

作为一种优选的实施方案，本申请提供的式(I)化合物为下列式(III)化合物：

其中，R₄、R₅、R₆和R₇在式(III)化合物中的定义与在式(I)化合物中的定义相同。

在本申请的一种实施方案中，本申请提供的一种上述通式(I)化合物，其选自下列化合物：

双(((Z)-((E)-(1-(2-(二乙基氨基)乙基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物1)；

双(((Z)-((E)-(1-(2-(4-(叔丁氧羰酰基)哌嗪-1-基)乙基)-5-甲基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物2)；

双(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物3)；

双(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物4)；

双(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(2-甲基哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物5)；

双(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物6)；

双(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-吗啉乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物7)；

双(((Z)-((E)-(5-甲基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物8)；

双(((Z)-((E)-(1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)甲基)硫基)铂(配合物9)；

双(((Z)-((E)-(4-溴-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物10)；

双(((Z)-((E)-(4-氯-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物11)；

双(((Z)-((E)-(5-溴-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物12)；

双(((Z)-((E)-(5-氯-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物13)；

双(((Z)-((E)-(5-氟-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物14)；

双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物15)；

双(((Z)-((E)-(1-(2-吗啉基乙基)-5-硝基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物16)；

双(((Z)-((E)-(6-溴-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物17)；

双(((Z)-((E)-(6-氯-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物18)；

双(((Z)-((E)-(5,7-二溴-1-(2-吗啉基乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物19)；

双(((Z)-((E)-(1-(2-(二甲基氨基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物20)；

双(((Z)-((E)-(1-(2-(二乙基氨基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物21)；

双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(吡咯烷-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物22)；

双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物23)；

双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(2-甲基哌啶-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物24)；

双(((Z)-((E)-(1-(2-(4-(叔丁氧羰酰基)哌嗪-1-基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物25)；

双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(哌嗪-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物26)；

双(((Z)-((E)-(1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-5-甲氧基-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物27)；或

双(((Z)-((E)-(5-甲氧基-1-(2-(4-苯基哌嗪-1-基)乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)亚肼基)(甲硫基)甲基)硫基)铂(配合物28)。

另一方面，本申请提供了如通式(I)所示的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的制备方法，包括如下步骤：

式(I′)化合物与1,5-环辛二烯二氯化铂(摩尔比：2:1)反应，得到式(I)化合物

这里，取代基R₁、R₄、R₅、R₆和R₇在式(I′)化合物中的定义与在式(I)化合物中的定义相同。

本申请提供的如通式(I)所示的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的制备方法，其中，式(I′)化合物可以采用中国专利ZL201410459107.2描述的方法制备。

在本申请提供的如通式(I)所示吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的制备方法中，优选地，式(I′)化合物与1,5-环辛二烯二氯化铂在乙醇中回流1-10小时反应，得到式(I)化合物。

采用X-射线衍射可以测定吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的晶体结构(见附图1和2)。

第三方面，本申请提供了一种包含上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的药用组合物。该药用组合物包括药理学上有效量的式(I)化合物和药学上可接受的辅料。对于本领域技术人员而言，这些辅料都是已知的，例如，生理盐水，明胶，阿拉伯树胶，乳糖，微晶纤维素，淀粉，改性淀粉，纤维素，改性纤维素，羟乙酸钠，磷酸氢钙，硬脂酸镁，滑石，胶体二氧化硅等。

此外，所述组合物还可进一步地包含：稳定剂，润湿剂，乳化剂，甜味剂，香味剂，缓冲剂等。

本申请提供的包含上述吲哚啉-2-酮-3-肼基二硫代甲酸酯衍生物的铂配合物的药用组合物，根据需要，能够配制成用于口服给药的固体或液体形式，如片剂、丸剂、口服液等；用于非肠道给药的无菌溶液、悬浮液或乳液形式，喷雾剂等，例如，注射剂。

具体地，，注射剂配方可以为：

制备方法：

将40g甘露醇、50g山梨醇加入1600mL注射用水中，搅拌溶解；将10g本申请的配合物加入上述溶液中，搅拌溶解；使用4％的磷酸氢二钠溶液调体系的pH值为4.15；加注射用水至2000mL，加入活性炭，50℃保温搅拌20min，过滤脱炭；用0.22μm的微孔滤膜过滤，灌封。121℃，15min高温湿热灭菌。

第四方面，本申请提供了上述吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物或包含其的药用组合物作为抗肿瘤药物或在制备抗肿瘤药物中的用途。

具体地，本申请的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物或包含其的药用组合物可用于治疗乳腺癌、或结肠癌等。

本申请的发明人测定了本申请的配合物14、15及其配体I′a、I′b对HCT-116、MCF-7和MDA-MB-231细胞的抗增殖活性，结果表明配合物和配体均表现出良好的体外抗肿瘤活性，令人惊奇地是配合物的活性明显优于配体，而且配合物的体外抗肿瘤活性比临床使用的顺铂活性更好。

实验证明，本申请的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物或包含其的药用组合物具有抗肿瘤活性，对人乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)、结肠癌(HCT-116)细胞的增殖具有抑制作用，可作为抗肿瘤药物或作为抗肿瘤活性成分用于抗肿瘤药物组合物。用药的参考剂量为0.1-10mg/kg体重，使用方法为口服或静脉注射。

附图说明

图1表示的是本申请的配合物14的晶体结构。

(A)有原子标示的化合物14的晶体结构图。键长：Pt1-S1 Pt1-S3 Pt1-N2 Pt1-N6 (B)化合物14的晶体结构的侧面图，其中虚线表示两相邻吲哚啉-2-酮环中心间的距离。

图2表示的是本申请的配合物15的晶体结构。

化合物15中含Pt1原子的单核结构(A)及含Pt2原子的单核结构(B)。键长：Pt1-S1 Pt1-S3 Pt1-N2 Pt1-N6 Pt2-S5 Pt2-S7 Pt2-N9 Pt2-N13

具体实施方式

以下通过实施例来示例性说明本申请的实施方案，对于本领域的普通技术人员而言，在本申请的教导下，根据现有技术，对本申请实施方案进行的改进，仍属于本申请的保护范围内。

实施例中使用的化合物原料的来源是：1,5-环辛二烯二氯化铂购买于Sigma公司，其它试剂和原料为国产分析纯或化学纯试剂。

实施例中使用的人乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)、结肠癌(HCT-116)细胞来自首都师范大学DNA损伤应答北京市重点实验室。

熔点用XT5B或X-4型精密显微熔点仪(控温型)测定(北京福凯仪器有限公司)，温度未校正。核磁共振氢谱、碳谱(¹H，¹³C NMR)用Varian NMR system 600MHz超导核磁共振谱仪测定，TMS为内标。紫外-可见光谱用Perkin Elmer Lambda 750紫外可见分光光度计测定。荧光用SpectraMax M5多功能微板读板仪(Molecular Devices,USA)测定。电喷雾高分辨质谱(ESI-HRMS)用Thermo Scientific LTQ Orbitrap Discovery质谱仪测定。

本申请的配合物的晶体X-射线衍射数据是在室温293K环境下，利用Bruker SMART APEXII CCD单晶衍射分析仪，在45KV、35mA的工作条件下收集的。两数据包通过专业SMART和SAINT软件还原，及SADABS软件的经验吸收矫正后，采用直接法进行结构解析，利用SHELXTL软件包的全矩阵最小二乘法精修，并对所有非氢原子做各向异性修正。最终的晶体学数据及所涉及的精修参数列于表1和表2。

主要抗体

实施例1

配合物14的配体I′a和配合物15的配体I′b的合成

参照本课题组已建立的实验方法(中国专利ZL201410459107.2)，合成配体I′a、I′b，并进行了结构表征，数据如下：

(Z)-N′-(5-氟-1-(2-吗啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(配体I′a)

产率:52％,黄色固体,mp 183-185℃.¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:2.52(br s,4H,morpholine-H),2.63(t,J＝6.6Hz,2H,morpholine-CH₂),2.68(s,3H,SCH₃),3.66(t,J＝4.2Hz,4H,morpholine-H),3.87(t,J＝6.6Hz,2H,indolin-2-one-CH₂),6.85(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H,indolin-2-one 7-H),7.10(td,J＝9.0,3.0Hz,1H,indolin-2-one 6-H),7.42(dd,J＝7.2,3.0Hz,1H,indolin-2-one 4-H),13.80(s,1H,NH).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ:17.73,37.33,53.66(2C),55.34,66.85(2C),108.93(d,J＝25.7Hz),110.13(d,J＝8.0Hz),117.78(d,J＝24.3Hz),120.92(d,J＝8.9Hz),132.07,139.31(d,J＝1.4Hz),159.39(d,J＝241.2Hz),160.76,202.47.UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:251,397.ESI-HRMS m/z:C₁₆H₂₀FN₄O₂S₂([M+H]⁺)计算值:383.1012；实测值:383.1007。

(Z)-N′-(5-甲氧基-1-(2-吗啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(配体I′b)

产率:34％,黄色固体,mp 147-149℃.¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ:2.56(br s,4H,morpholine-H),2.65(br s,2H,morpholine-CH₂),2.68(s,3H,SCH₃),3.70(br s,4H,morpholine-H),3.84(s,3H,OCH₃),3.88(br s,2H,indolin-2-one-CH₂),6.85(br s,1H,indolin-2-one 7-H),6.94(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H,indolin-2-one 6-H),7.24(d,J＝2.4Hz,1H,indolin-2-one 4-H),13.86(s,1H,NH).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ:17.66,37.22,53.66(2C),55.37,55.95,66.87(2C),106.76,110.10,117.63,120.38,133.23,137.16,156.33,160.78,202.17.UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:250,398.ESI-HRMS m/z:C₁₇H₂₃N₄O₃S₂([M+H]⁺)计算值:395.1212；实测值:395.1206。

配合物14、15的合成

将化合物I′a或I′b(1.0mmol)溶于热的无水乙醇(20mL)中，分批加入1,5-环辛二烯二氯化铂(0.19g,0.5mmol)，加热回流反应4小时。趁热过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，残余物用乙醇重结晶得配合物14或15。将其分别溶于二氧六环/甲醇(4:1,v/v)的混合液中，室温下缓慢挥发溶剂，得到用于X-射线衍射分析的单晶。配合物14、15的晶体学参数、键长和键角数据见表1和表2。

1)配合物14

收率:64％,棕色固体,mp>300℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:2.84(s,6H,2SCH₃),2.97(m,8H,morpholine-H),3.10(m,4H,morpholine-CH₂),3.58(m,8H,morpholine-H),3.88(m,4H,indolin-2-one-CH₂),7.31(br s,2H,indolin-2-one 4-H),7.55(td,J＝8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 6-H),7.42(dd,J＝8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 7-H).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:18.89(2C),40.36(2C),51.58(4C),56.38(2C),63.62(4C),111.61(d,J＝7.6Hz,2C),116.40(d,J＝27.3Hz,2C),119.96(d,J＝9.8Hz,2C),121.61(d,J＝19.8Hz,2C),139.73(2C),149.49(d,J＝3.2Hz,2C),158.44(d,J＝237.75Hz,2C),162.33(2C),192.15(2C).UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:266,395,508.ESI-HRMS m/z:C₃₂H₃₇F₂N₈O₄S₄Pt([M+H]⁺)计算值:958.1436；实测值:958.1431。

2)配合物15

产率:77％,棕色固体,mp>300℃.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:2.86(s,6H,2SCH₃),2.91(m,8H,morpholine-H),3.01(m,4H,morpholine-CH₂),3.63(m,8H,morpholine-H),3.82(s,6H,2OCH₃),3.90(m,4H,indolin-2-one-CH₂),7.22(d,J＝8.4Hz,2H,indolin-2-one 7-H),7.25(dd,J＝8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 6-H),7.94(d,J＝2.4Hz,2H,indolin-2-one 4-H).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:19.07(2C),40.40(2C),51.52(4C),52.40(2C),56.19(2C),63.56(4C),111.23(2C),114.72(2C),119.93(2C),121.38(2C),137.40(2C),150.32(2C),155.81(2C),162.25(2C),190.83(2C).UV-Vis[DMSOλ_max,nm]:274,392,509.ESI-HRMS m/z:C₃₄H₄₃N₈O₆S₄Pt([M+H]⁺)计算值:982.1836；实测值:982.1831。

表1.配合物14和15的晶体学数据及精修参数

^a R₁＝Σ||Fo|–|Fc||/Σ|Fo|.^bwR₂＝{Σ[w(Fo²–Fc²)²]/Σ[w(Fo²)²]}^1/2.

表2.配合物14和15的键长和键角数据

实施例2

本申请的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的抗肿瘤活性评价

配合物14、15的抗增殖活性

采用MTS比色法，测试了配合物14、15及其相应配体I′a、I′b对人结肠癌HCT-116和人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株的抗增殖活性，实验结果见表3。

由表3可看出，铂配合物14、15、配体I′a、I′b对所测的三种细胞系均表现出一定的抗增殖活性。与配体I′a、I′b相比，配合物14、15具有更强的活性，尤其配合物14的活性是相应配体I′a的的8倍，表明与Pt(II)配位导致抗增殖活性显著增强。此外，配合物14、15对测试的三种肿瘤细胞的抗肿瘤活性明显优于临床抗癌药物顺铂(cDDP)。

表3.化合物I′a、I′b和14、15对HCT-116、MCF-7和MDA-MB-231细胞的抗增殖活性

配合物14、15和配体I′a、I′b对细胞周期的影响

顺铂(cis-diaminedichloroplatinum(II),cDDP)在恶性肿瘤治疗中具有良好的疗效，它主要通过作用于含氮碱基与DNA双链形成链内交联进而诱导细胞凋亡。考虑到HCT-116和MCF-7比MDA-MB-231细胞系对测试化合物更敏感，但MCF-7细胞黏连生长不易吹打成单个细胞，因此，本申请的发明人选用了HCT-116细胞，采用流式细胞术考察了配合物14、15及其配体I′a、I′b对HCT-116细胞周期进程的影响。在IC₅₀的浓度下处理HCT-116细胞24h，与阳性对照顺铂类似，经配合物14、15处理之后也观察了到明显的sub-G1峰，而配体的sub-G1信号非常弱。与另一阳性对照Taxol处理得到的结果类似，经配体I′a、I′b处理24h的HCT-116细胞，其G2/M期的比例有所增加。上述实验结果提示，配合物14、15能够诱导HCT-116细胞发生凋亡，而且与配体对细胞的作用机制有所不同。

配合物15和配体I′b对细胞凋亡的影响

为了进一步验证本申请的配合物是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，本申请的发明人采用蛋白质印迹法(Western blot)分析了不同浓度的配合物15处理HCT-116细胞不同时间后，观察多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]的裂解。发现，HCT-116细胞经配合物15处理后，PARP1裂解片段随着时间的延长、浓度的增加而明显增加，处理10h后裂解的PARP1印迹非常明显。因此，又选择处理HCT-116细胞10h，同时观察配合物和配体对细胞PARP1的裂解情况。发现经配体I′b处理后HCT-116细胞中PARP1蛋白几乎不受影响。PARP1的裂解片段是细胞凋亡的重要标志。因此，实验结果表明，本申请的配合物15能够引起细胞的凋亡，而配体I′b似乎并不能诱导细胞凋亡。

配合物14导致细胞凋亡形态变化

为了能够更加直观的看到细胞凋亡的整个过程，采用活细胞荧光成像技术，通过向活细胞中转入能够表达荧光蛋白的基因，让其在细胞中表达，即可通过荧光显微系统观察到特定的亚细胞结构形态变化。让带荧光标记的微管蛋白(α-tubulin)和组蛋白(H2A)在MCF-7细胞中表达，能够直观的看到微管(红色)和细胞核(绿色)不同时间的变化。从实验结果得知，在IC₅₀的浓度下，经配合物14处理后，随着时间的推移，细胞核出现皱缩，染色质最后凝聚在一起，表明配合物14能诱导细胞凋亡。

配合物14、15和配体I′a、I′b与DNA的相互作用

溴化乙啶(ethidium bromide,EB)常作为探针用于检测DNA的结构，被广泛应用于小分子与DNA的作用研究和抗肿瘤药物的筛选。EB在溶液中的荧光强度较弱，但当它专一性的嵌入DNA的碱基对之间后荧光强度大大增加。当DNA分子的结构发生改变时，结合到碱基对之间的EB又会游离出来，发生荧光淬灭。当药物分子与DNA发生作用时，通过体系中检测荧光强度的变化即可辨别药物与DNA是否发生作用。

为了探讨配合物是否与顺铂一样通过作用于DNA而诱导细胞凋亡，通过EB探针分子竞争性结合来评价配合物14、15及其配体I′a、I′b与DNA结合能力。结果表明增加配合物的浓度，荧光强度明显降低，荧光淬灭，表示配合物的确能够竞争性结合DNA。

配合物的抗肿瘤活性评价中所涉及到的生物学实验

常用试剂的配制、细胞培养、细胞增殖抑制试验(MTS assay)、蛋白质印迹实验(Western blot)方法，参见现有技术的文献(Ding,P.P.；Gao,M.；Mao,B.B.；Cao,S.L.；Liu,C.H.；Yang,C.R.；Li,Z.F.；Liao,J.；Zhao,H.；Li,Z.；Li,J.；Wang,H.；Xu X.Synthesis and biological evaluation of quinazolin-4(3H)-one derivatives bearing dithiocarbamate side chain at C2-position as potential antitumor agents.Eur.J.Med.Chem.2016,108,364-373)。

细胞周期(Cell cycle profiles)

⑴流式分析前的细胞处理与固定：将细胞按合适浓度接种于六孔盘中，待细胞贴壁后给药，根据不同需要及化合物的性质处理不同时间。

⑵加药处理完毕后，将细胞收集于离心管中离心(4℃，1000g，离心1min，翻转EP管再离心一次)，弃上清液，加1mL PBS吹打重悬细胞，按上述方法离心弃上清液。

⑶固定细胞：加300μL置于冷浴中的PBS重悬细胞，再加等量无水乙醇充分混匀，冰浴片刻。重复加入300μL乙醇两次，使乙醇的终浓度为75％。冰浴30min后置于4℃层析柜保存，可保存两周。

⑷将固定好的细胞在4℃,1000g，离心2min，弃上清液，凉置样品，使乙醇尽可能的挥干。

⑸用1mL 0.1％PBST洗两次，用l×的PBS缓冲液稀释RNase A(10mg/mL,l:100)和PI(2mg/mL,1:200)，每个样品加400μL RNase A和PI染色剂染色；

⑹37℃水浴30min，每隔10分钟摇动样品管，使沉淀的细胞悬浮，使其与PI充分接触。

⑺流式检测样品，测样前注意避光保存。上样前用500目的筛过滤到EP管中，过滤时顶住筛一次性吹出去。

细胞转染实验

⑴将待检测的细胞系按合适的浓度(根据转染试剂说明说计数)接种在6孔盘中，培养过夜。

⑵准备混合液：37℃预热三无培养基(无血清和抗生素)，然后取三无培养基97μL，转染试剂FuGENE6 3μL混合均匀，室温静置10min。

⑶将带有荧光蛋白基因的质粒(1μg)加入另一EP管中，10min后，将准备好的混合液加入已放入质粒的新EP管中，混合均匀，室温静置15min。