专利摘要

本发明公开了一种从螺旋藻中制备4‑羟基肉桂酸的方法，包括以下步骤：步骤一、甲醇粗提物浸膏的制备；步骤二、甲醇粗提物浸膏分离出组分T1，步骤三、组分T1分离出组分A和组分B；步骤四、组分A分离纯化出组分A1，组分B分离纯化出组分B11：步骤五、组分A1分离纯化出化合物X，组分B11分离纯化出化合物Y；步骤六、结构鉴定出化合物X为4‑羟基肉桂酸，即制得4‑羟基肉桂酸。本发明通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得4‑羟基肉桂酸，提供了从螺旋藻中分离到了4‑羟基肉桂酸的新方法。

权利要求

1.一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、称取5Kg螺旋藻粉平均分成4份，分别置于4个3L的三角瓶中，分别加入甲醇至2L刻度线摇匀，浸提4小时，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入甲醇至2L刻度线进行第二次浸提4小时，抽滤，收集滤液；如此浸提5次，合并滤液，浓缩得甲醇粗提物浸膏；

步骤二、将甲醇粗提物浸膏用硅胶粉干法拌样，上含180g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为2L；前三个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱35管，共收集56管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，取量较大的第22至第26管，标记为组分T1，取条带清晰的第42至56管，标记为组分T2；将T1和T2交叉使用葡聚糖凝胶柱和硅胶柱分别纯化，其中，从T1中分离得到两个在硅胶层析板上为单个条带的物质，其余部分未得到；选用T1进行下一步分离；

步骤三、组分T1用适量甲醇溶解后，上含170g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为7～9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集133管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，取第79管至第106管，标记为组分A，取第50至58管，标记为组分B；

步骤四、组分A的分离纯化：组分A加适量甲醇溶解后，上含50g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为10％水：90％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为300mL；45mL时收集一管，前两个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱8管，共收集23管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分A1；组分B的分离纯化：组分B分离纯化方法同组分A的分离纯化方法一样，共收集28管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分B1；再取B1用适量甲醇溶解后，上含50g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为11～13s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集22管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，标记为组分B11；

步骤五：组分A1的分离纯化：组分A1加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为200：1、150：1、100：1、75：1、50：1、40：1、30：1、25：1、20：1、15：1、10：1；首先用石油醚：丙酮为200:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为20:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第148至第185管，经过真空减压浓缩，得化合物X；组分B11的分离纯化：组分B11加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为50：1、45：1、40：1、35：1、30：1、20：1、15：1；首先用石油醚：丙酮为50:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为30:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第61至第80管，进行TLC分析，经真空减压浓缩，得化合物Y；

步骤六、将化合物X和化合物Y称重，化合物X为3.3mg，化合物Y为0.4mg，化合物Y重量不符合核磁共振鉴定结构的条件，舍弃；将化合物X装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物A的核磁谱，经过对核磁谱的数据解析，得知化合物X为4-羟基肉桂酸，即制得4-羟基肉桂酸。

2.如权利要求1所述的一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于：所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：

(1)硅胶粉活化

取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；

(2)拌样

按照样品：硅胶粉＝1:1.2向干净的圆底烧瓶中加入硅胶粉，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀松散状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；

(3)装柱

采用湿法装柱，称取1.8g硅胶用石油醚饱和后装柱；

(4)上样

采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液。

3.如权利要求2所述的一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其特征在于：所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装石油醚：丙酮为5:1的展开剂的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪、碘显色剂和5％硫酸乙醇显色剂分别显色。

说明书

技术领域

本发明涉及4-羟基肉桂酸提取的技术领域，尤其涉及一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法。

背景技术

4-羟基肉桂酸(Coumalic acid)，化学名称为对-羟基肉桂酸，又名对4-羟基肉桂酸、4-羟基苯丙烯酸，属于羟基肉桂酸类化合物中最主要的一种，在自然界植物中广泛存在，主要分布在禾本科植物的茎干中，豆科植物含量居多，可从海金沙、白花蛇舌草等植物中提取得到。大量研究表明，4-羟基肉桂酸具有良好的生物活性，具有抗氧化、抑菌和抗病毒作用。此外，毒理学实验表明4-羟基肉桂酸还具有利胆功能，其安全范围广，作用缓和持久，临床适用于胆囊及胆道功能失调，广泛应用于医药、食品、日用品、饲料等领域。

螺旋藻为原核生物，属于蓝藻的一种，其营养成分均衡，具有蛋白含量高、脂肪和胆固醇含量低的特点，其粗提取物还可以用作开发抗癌药物的来源。螺旋藻中含有多种生物活性成分，具有抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫力、抗衰老、降血脂、降血糖等功能，已成为当下研究的热点。目前国内外文献中关于从螺旋藻中提取得到4-羟基肉桂酸的研究仍鲜见报道。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得4-羟基肉桂酸，本发明提供了从螺旋藻中分离到了4-羟基肉桂酸的新方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：

一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其包括以下步骤：

步骤一、称取5Kg螺旋藻粉平均分成4份，分别置于4个3L的三角瓶中，分别加入甲醇至2L刻度线摇匀，浸提4h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入甲醇至2L刻度线进行第二次浸提4h，抽滤，收集滤液；如此浸提5次，合并滤液，浓缩得甲醇粗提物浸膏；

步骤二、将甲醇粗提物浸膏用硅胶粉干法拌样，上含180g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为2L；前三个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱35管，共收集56管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，取量较大的第22至第26管，标记为组分T1，取条带清晰的第42至56管，标记为组分T2；将T1和T2交叉使用葡聚糖凝胶柱和硅胶柱分别纯化，其中，从T1中分离得到两个在硅胶层析板上为单个条带的物质，其余部分未得到；选用T1进行下一步分离；

步骤三、组分T1用适量甲醇溶解后，上含170g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为7～9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集133管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，取第79管至第106管，标记为组分A，取第50至58管，标记为组分B；

步骤四、组分A的分离纯化：组分A加适量甲醇溶解后，上含50g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为10％水：90％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为300mL；45mL时收集一管，前两个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱8管，共收集23管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分A1；组分B的分离纯化：组分B分离纯化方法同组分A的分离纯化方法一样，共收集28管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分B1；再取B1用适量甲醇溶解后，上含50g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为11～13s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集22管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，标记为组分B11；

步骤五：组分A1的分离纯化：组分A1加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为200：1、150：1、100：1、75：1、50：1、40：1、30：1、25：1、20：1、15：1、10：1；首先用石油醚：丙酮为200:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为20:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第148至第185管，经过真空减压浓缩，得化合物X；组分B11的分离纯化：组分B11加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为50：1、45：1、40：1、35：1、30：1、20：1、15：1；首先用石油醚：丙酮为50:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为30:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第61至第80管，进行TLC分析，经真空减压浓缩，得化合物Y；

步骤六、将化合物X和化合物Y称重，化合物X为3.3mg，化合物Y为0.4mg，化合物Y重量不符合核磁共振鉴定结构的条件，舍弃；将化合物X装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物A的核磁谱，经过对核磁谱的数据解析，得知化合物X为4-羟基肉桂酸，即制得4-羟基肉桂酸。

根据本发明的实施例，采用上述技术方案后，通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得4-羟基肉桂酸；相比于现有的4-羟基肉桂酸的提取方法，简化了提取工艺，降低了从螺旋藻中提取4-羟基肉桂酸的难度，为从螺旋藻中提取4-羟基肉桂酸提供了新方法。

作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：

(1)硅胶粉活化

取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；

(2)拌样

按照样品：硅胶粉＝1:1.2向干净的圆底烧瓶中加入硅胶粉，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀松散状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；

(3)装柱

采用湿法装柱，称取1.8g硅胶用石油醚饱和后装柱；

(4)上样

采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液。

作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装石油醚：丙酮为5:1的展开剂的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪、碘显色剂和5％硫酸乙醇显色剂分别显色。

附图说明

图1是本发明化合物X的薄层层析结果；

图2是本发明化合物Y的薄层层析结果；；

图3是本发明化合物X的结构图；

图4是本发明化合物X的¹H-NMR的核磁共振谱图；

图5是本发明化合物X的¹³C-NMR核磁共振谱图。

具体实施方式

本发明所使用的仪器设备如下表1所示：

表1实验用主要仪器和生产厂家

本发明所使用的主要试剂及药品如下表2所示：

表2实验用主要的试剂和药品

本发明所使用的显色试剂的配制：

(1)碘显色试剂：碘粒与硅胶混合比例约1:3，即10g碘粒配30g硅胶粉，配大约500ml的玻璃缸半瓶，充分的摇匀使碘蒸汽充满瓶体。

(2)5％硫酸乙醇溶液：取25ml浓硫酸加入到500ml无水乙醇中，混匀。

(3)碘化铋钾：甲液：8.35g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。乙液：8g碘化钾溶于20ml水中。两者等量混合，可长时间保存。用于生物碱显色剂时，取混合液1ml与冰醋酸2ml、水10ml混合。

实施例

本发明揭示了一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法，其包括以下步骤：

粗提浸膏的制备：

称取5Kg螺旋藻粉平均分成4份，分别置于4个3L的三角瓶中，分别加入甲醇至2L刻度线摇匀，浸提4h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入甲醇至2L刻度线进行第二次浸提4h，抽滤，收集滤液；如此浸提5次，每次先用滤纸抽滤萃取液，旋蒸仪蒸发除去溶剂。甲醇复溶，用0.5微米的膜再次抽滤除去不溶物；合并滤液，浓缩得甲醇粗提物浸膏85g。

甲醇粗提物浸膏的分离纯化：

取12.86g甲醇粗提物浸膏用硅胶粉(200-300目)干法拌样，拌至呈肉松状松散，上预先处理好的含180g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为2L；前三个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱35管，共收集56管；将各个梯度的组分旋蒸浓缩后，分别用薄层层析TLC分析，层析展开(展开剂为石油醚：丙酮＝5:1)，用紫外分析仪、碘显色、5％硫酸乙醇、碘化铋钾分别显色，比较不同显色方法的情况差异；合并相似组分，取量较大的第22至第26管，标记为组分T1，取条带清晰的第42至56管，标记为组分T2；将T1和T2通过交叉使用葡聚糖凝胶柱和硅胶柱(根据样品的量确定所用填料体积层析柱)分别纯化，其中，从T1中分离得到两个在硅胶层析板上为单个条带的物质，其余部分未得到；选用T1进行下一步分离。

组分T1的分离纯化：

将组分T1(3.81g)用适量甲醇溶解后，上预先处理好的含170g填料的SephadexLH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为7～9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集133管；每管组分用薄层层析TLC分析，层析展开(展开剂为石油醚：丙酮＝5:1)，显色，根据紫外、碘、5％硫酸乙醇以及碘化铋钾的显色情况；合并相似的组分，取第79管至第106管，标记为组分A，取第50至58管，标记为组分B。

组分A和组分B的分离纯化：

组分A的分离纯化：将组分A(110mg)加适量甲醇溶解后，上含50g填料的C18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为10％水：90％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；每个梯度洗脱体积为300mL；45mL时收集一管，前两个梯度中，每个梯度洗脱7管，最后一个梯度洗脱8管，共收集23管；每管组分用薄层层析TLC分析，展开(展开剂为石油醚：丙酮＝5:1)，显色，因为前两次过柱子显色时碘化铋钾没有明显差异，故后面的柱子都只使用紫外显色、碘显色、5％硫酸乙醇显色；合并相似组分，标记为组分A1。

组分B的分离纯化：组分B分离纯化方法同组分A的分离纯化方法一样，共收集28管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似组分，标记为组分B1；再取B1用适量甲醇溶解后，上含50g填料的Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为11～13s/drop，使用自动收集器收集各流份，每30min收集1管，共收集22管；每管组分用薄层层析TLC分析，合并相似的组分，标记为组分B11。

组分A1和组分B11的分离纯化：

组分A1的分离纯化：组分A1加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为200：1、150：1、100：1、75：1、50：1、40：1、30：1、25：1、20：1、15：1、10：1；首先用石油醚：丙酮为200:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为20:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第148至第185管，经过真空减压浓缩，得化合物X；

组分B11的分离纯化：组分B11加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置石油醚和丙酮体积比为50：1、45：1、40：1、35：1、30：1、20：1、15：1；首先用石油醚：丙酮为50:1的洗脱液洗脱，每9mL收集一管，同时用TLC追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为30:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用TLC显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第61至第80管，进行TLC分析，经真空减压浓缩，得化合物Y。

另外，本发明所采用的TLC分析是将GF254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。

化合物的结构鉴定：

首先用重铬酸钾浸泡核磁管，浸泡12h后，甩出重铬酸钾溶液再用甲醇清洗，若甲醇洗不干净再用三氯甲烷来洗，洗干净后再用色谱级的甲醇润洗几遍，核磁管洗完后吹干称其重量，将样品用氘代甲醇溶解吸入核磁管，然后用滤纸封口放在蒸发瓶真空减压蒸干溶剂，再称其重量，通过差量法可知最后检测的化合物X的重量为3.3mg，最后采用“400MHz-NMR”测定化合物的核磁谱。化合物Y的重量为0.4mg，化合物Y重量不符合核磁共振鉴定结构的条件，舍弃。

将化合物X装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MH核磁共振仪测定化合物X的核磁谱，化合物X核磁谱数据如表1所示。

表1化合物X的核磁谱数据

进行质谱测定后可知化合物X的ESI-MS：m/z＝165.58，综合化合物X的核磁谱数据以及质谱数据并与文献进行比对，推测化合物X为4-羟基肉桂酸(C₉H₈O₃，分子量为164.58))，其结构如图2所示。化合物4-羟基肉桂酸的¹H-NMR、¹³C-NMR核磁共振谱图如图3及图4所示。

本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

一种从螺旋藻中制备4-羟基肉桂酸的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。