专利摘要

本发明公开了一种螺旋藻中的多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的用途，以螺旋藻多酚提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备酪氨酸酶抑制剂；所述螺旋藻多酚提取物的制备方法：采用体积浓度为80%的乙醇提取螺旋藻，得到螺旋藻多酚粗提液，再将螺旋藻多酚粗提液于40℃减压浓缩，冷冻干燥后得到固态的螺旋藻多酚提取物。本发明从螺旋藻首次提取出的多酚对酪氨酸酶活性的抑制，将为其应用于皮肤美白、医疗、果蔬保鲜等领域提供可靠的理论依据，也将为综合利用螺旋藻资源和研究安全、经济的酪氨酸酶抑制剂提供新途径。

权利要求

1.一种螺旋藻中的多酚提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途，其特征在于：以螺旋藻多酚提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备酪氨酸酶抑制剂；所述螺旋藻多酚提取物的制备方法：采用体积浓度为80％的乙醇提取螺旋藻，得到螺旋藻多酚粗提液，再将螺旋藻多酚粗提液于40℃减压浓缩，冷冻干燥后得到固态的螺旋藻多酚提取物。

2.如权利要求1所述的一种螺旋藻中的多酚提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途，其特征在于：以螺旋藻多酚提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于抗老年斑或抑制食品褐变的保鲜剂。

3.如权利要求1所述的一种螺旋藻中的多酚提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途，其特征在于：螺旋藻多酚含量的测定方法：采用分光光度法，用福林酚试剂对提取物中的多酚显色，确定多酚含量：超纯水溶解0.110g没食子酸，采用100mL容量瓶定容，得没食子酸标准储备溶液；再用没食子酸标准储备溶液分别稀释成10、20、30、40和50μg·mL^-1的系列溶液，以超纯水做空白对照，分别取1.0mL稀释液置于比色管中，加入5.0mL福林酚溶液，反应6min，加入4.0mL 7.5％Na₂CO₃溶液，混匀，避光放置1h后，在波长765nm下测定吸光值，制作标准曲线；螺旋藻多酚含量根据标准曲线比色测定。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制剂的技术领域，尤其涉及一种螺旋藻中的多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的用途。

背景技术

海藻多酚是一种主要从蓝藻、绿藻、红藻和褐藻四大海洋藻类中分离提取的具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及降血压等广泛生物活性的多酚类化合物的总称。Iwai研究了褐藻多酚作为一种天然来源的α-葡萄糖酶抑制剂被小鼠摄入后，小鼠体内血糖水平被控制，能有效预防糖尿病的发生；卢虹玉等人通过萃取和超滤技术从全缘马尾藻中提取出4种多酚提取物，并测试了4种提取物的抗氧化能力和对sw579细胞增殖的影响，结果显示褐藻多酚提取物的总抗氧化能力与分子量大小负相关，对肿瘤细胞的抑制作用与浓度正相关；魏玉西等研究发现鼠尾藻多酚能干扰凝血因子的活性和减少血小板内外Ca²⁺的运输，抗凝血效果显著。研究表明，海藻多酚在食品和医药领域存在研究价值。

酪氨酸酶能羟基化单酚底物和氧化二酚底物，是一种活性中心含有双核铜离子的氧化还原酶。黑色素过度积累会导致果蔬褐变、皮肤色斑和黑色素瘤形成，而酪氨酸酶活性大小同生物体中黑色素生成量密切相关。典型的酪氨酸酶抑制剂有曲酸、多酚类化合物、苯甲醛和苯甲酸脂类衍生物等，已被广泛应用于研究果蔬保鲜剂，化妆品美白剂和生物杀虫剂。螺旋藻是一种古老的丝状蓝藻，富含藻蓝蛋白、螺旋藻多酚、小分子多糖等活性成分。我国螺旋藻资源丰富，是螺旋藻原料生产大国，但我国螺旋藻主要进行简单利用，且活性成分开发深度不够。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种螺旋藻中的多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的用途，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种螺旋藻中的多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的用途，从螺旋藻原料中提取出螺旋藻多酚，并对其进行酪氨酸酶活性抑制实验，以期为螺旋藻资源的开发利用提供实验依据，同时研究出一种天然来源的经济、安全的酪氨酸酶抑制剂。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种螺旋藻中的多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的用途，以螺旋藻多酚提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备酪氨酸酶抑制剂。

作为实施例的优选方式，以螺旋藻多酚提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于抗老年斑或抑制食品褐变的保鲜剂。

作为实施例的优选方式，所述螺旋藻多酚提取物的制备方法：采用体积浓度为80％的乙醇提取螺旋藻，得到螺旋藻多酚粗提液，再将螺旋藻多酚粗提液于40℃减压浓缩，冷冻干燥后得到固态的螺旋藻多酚提取物。

作为实施例的优选方式，螺旋藻多酚含量的测定方法：采用分光光度法，用福林酚试剂对提取物中的多酚显色，确定多酚含量：超纯水溶解0.110g没食子酸，采用100mL容量瓶定容，得没食子酸标准储备溶液；再用没食子没食子酸标准储备溶液分别稀释成10、20、30、40和50μg·mL^-1的系列溶液，以超纯水做空白对照，分别取1.0mL稀释液置于比色管中，加入5.0mL福林酚溶液，反应6min，加入4.0mL 7.5％Na₂CO₃溶液，混匀，避光放置1h后，在波长765nm下测定吸光值，制作标准曲线；螺旋藻多酚含量根据标准曲线比色测定。

本发明从螺旋藻首次提取出的多酚对酪氨酸酶活性的抑制，将为其应用于皮肤美白、医疗、果蔬保鲜等领域提供可靠的理论依据，也将为综合利用螺旋藻资源和研究安全、经济的酪氨酸酶抑制剂提供新途径。

附图说明

图1为本发明没食子酸的标准曲线；

图2为本发明螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用；

图3为本发明螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶二酚酶抑制机理的测定；其中，直线1-5所对应的螺旋藻多酚的浓度分别为0，0.67，1.33，2.00和2.67mg·mL^-1；

图4为本发明螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶二酚酶抑制类型及抑制常数的测定；其中，直线1-5所对应的螺旋藻多酚的浓度分别为0，0.67，1.33，2.00和2.67mg·mL^-1。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与药品 螺旋藻粉由福建省六神保健品有限公司提供；福林酚试剂，没食子酸，酪氨酸酶，购自Sigma公司；无水碳酸钠，购自汕头市西陇化工厂；乙醇，左旋多巴等实验材料购自上海国药化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器 紫外分光光度计，澳大利亚GBC仪器公司；恒温水浴锅，江苏省金坛市鸿科仪器厂；FE20K酸度计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；真空冷冻干燥机，郑州明天仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻多酚的提取 以螺旋藻粉为原料，采用80％乙醇提取酚类物质，再将螺旋藻多酚粗提液于40℃减压浓缩，冷冻干燥后得到固态的螺旋藻多酚提取物。

1.2.2 螺旋藻多酚含量的测定 采用分光光度法，用福林酚试剂对提取物中的多酚显色，确定多酚含量。超纯水溶解0.110g没食子酸，100mL容量瓶定容，得没食子酸标准储备溶液。再用没食子没食子酸标准储备溶液分别稀释成10、20、30、40和50μg·mL^-1的系列溶液，以超纯水做空白对照，分别取1.0mL稀释液置于比色管中，加入5.0mL福林酚溶液，反应6min，加入4.0mL 7.5％Na₂CO₃溶液，混匀，避光放置1h后，在波长765nm下测定吸光值，制作标准曲线。螺旋藻多酚含量根据标准曲线比色测定。1.2.3螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用提取物对酶的抑制效果：通过固定底物浓度和酶浓度，测定不同效应物浓度下的相对剩余酶活。螺旋藻多酚提取物溶解于二甲基亚砜(DMSO)，制成不同浓度的效应物溶液。0.5mmol·L^-1L-DOPA底物溶液和2.89μg·mL^-1酶液均用50mmol·L^-1pH 6.8磷酸缓冲液配制。在3mL反应体系中，先加入0.1mL效应物溶液，再加入2.8mL预先在30℃恒温水浴10min的底物溶液，最后加入0.1mL酶液，快速混匀。设定测定波长为475nm，测定反应体系的光密度值随反应时间的增长直线，消光系数ε＝3700L·mol^-1·cm^-1，通过酶活力，计算半抑制率IC₅₀值。

提取物对酶的抑制机理：通过固定底物浓度，改变酶量，测定不同效应物浓度下的酶活力。在含2.8mL 0.5mmol·L^-1L-DOPA底物的测活体系中，测定酶量为1.15，1.73，2.31，2.89和3.46μg·mL^-1时，不同浓度螺旋藻多酚提取物作用下酶的反应速率，判断提取物对酶的作用机理。

提取物对酶的抑制类型、抑制常数：通过固定酶浓度，改变底物的量，测定不同效应物浓度下的酶活力。固定酶量为2.89μg·mL^-1，在螺旋藻多酚提取物浓度分别为0，0.67，1.33，2.00和2.67mg·mL^-1的测活体系中，测定L-DOPA浓度为0.3，0.4，0.5，0.6和0.7mmol·L^-1时的酶反应速率。通过Lineweave-Burk双倒数作图，计算并比较动力学参数K_m和V_m，判断抑制类型。

2 结果与分析

2.1 螺旋藻多酚提取物中总酚含量

没食子酸的Folin-Ciocalteus反应标准曲线如图1。没食子酸质量浓度在0～50μg·mL^-1时，吸光值A₇₆₅与标准液浓度有良好的线性关系。没食子酸标准工作曲线的线性回归方程为Y＝0.00123X-0.0086，相关系数R²＝0.9996(Y为吸光值，X为没食子酸浓度)。根据没食子酸的标准工作曲线公式和螺旋藻溶液在765nm波长下的吸光值，得出螺旋藻提取物中的多酚含量为35.05mg·g^-1。

2.2 螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶活力的影响

固定L-DOPA浓度和酶浓度，测定不同浓度螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶影响。由图2可知，酪氨酸酶的反应速率随着螺旋藻多酚浓度的增大而下降，说明螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶活力有抑制作用，半抑制率IC₅₀为6.23mg·mL^-1。

2.3 螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶的抑制机理

固定底物L-DOPA浓度，改变测活体系中酶量，测定酶量与酶活力的关系。由图3可知，随着螺旋藻多酚提取物浓度的增大，直线斜率依次降低，且直线交点为原点，说明螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶的抑制过程可逆，螺旋藻多酚提取物的加入没有减少体系中有效酶量，但酪氨酸酶的酶活力被抑制，其催化效率降低。

2.4 螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶的抑制类型与抑制常数

固定酶浓度，改变底物的量，测定不同浓度螺旋藻多酚提取物对酶活力的影响。如图4(a)所示，以提取物作用于酪氨酸酶时，酶的反应速率与多巴浓度作Lineweaver-Burk双倒数图，得到交点位于第二象限的一组直线。这表明，随着螺旋藻多酚提取物浓度的升高，K_m值变大，V_m值变小，其抑制类型为混合竞争型。以图4(a)中直线的斜率和纵轴截距对螺旋藻多酚提取物作图4(b)，图4(c)，得抑制常数K_I和K_IS分别为1.94mg·mL^-1和6.83mg·mL^-1。

2.5 海藻提取物及中药美白成分对酪氨酸酶抑制作用的比较

蓝藻(螺旋藻)、绿藻(缘管浒苔)、红藻(真江蓠)和褐藻(铁钉菜)及中药(银杏叶、甘草)提取物对酪氨酸酶的酶动力学参数见表1。由表1可知，六种不同来源的提取物对酪氨酸酶的抑制过程都可逆。通过比较半抑制率IC₅₀值，可得六种提取物对酪氨酸酶的抑制效果依次为：铁钉菜提取物>缘管浒苔提取物>甘草提取物>螺旋藻多酚提取物>银杏叶提取物>真江蓠提取物。

表1 天然提取物对酪氨酸酶二酚酶抑制效果比较

Table 1Comparison of inhitory effect of natural extracts on diphenolase of tyrosinase

3 讨论

黑色素沉积会导致皮肤色斑和果蔬褐变，其生成量同酪氨酸酶的活性有关。从天然植物中分离提取出安全、高效的酪氨酸酶抑制剂并应用于开发果蔬保鲜、化妆品美白等产品一直是研究热点，但关于海藻活性成分对酪氨酸酶抑制的研究报道较少。

螺旋藻中富含多种营养成分和生物活性物质，因具有解毒、增强免疫、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等功效而备受青睐。研究螺旋藻活性成分用于开发功能食品、化妆品和药物成为新热点。我国经过近几十年的发展已成为世界螺旋藻原料生产大国，但我国的螺旋藻原材料以简单利用为主，产品精加工程度不够。

本文以螺旋藻粉为原料，利用乙醇从螺旋藻粉中萃取出多酚类物质，研究其对酪氨酸酶活力的抑制效应，并比较了海藻活性成分和中药美白成分的抑制效果。从研究结果可知，80％乙醇提取的螺旋藻多酚提取物中，螺旋藻多酚含量较低，多酚含量为35.05mg·g^-1；螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶有抑制作用，对二酚酶的半抑制率(IC₅₀)为6.29mg·mL^-1。提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制可逆，表明螺旋藻多酚提取物会降低酶催化效率，而不减少有效酶量。螺旋藻多酚提取物对酶抑制类型为混合型，抑制常数K_I＝1.94mg·mL^-1、K_IS＝6.83mg·mL^-1，表明螺旋藻多酚提取物可同时与游离酶和酶-底物复合物结合，且与游离酶的结合能力更强；比较四种海藻提取物和中药美白成分的动力学参数可知，海藻提取物抑制酪氨酸酶活性，且部分提取物的抑制效果优于市场上的中药提取物美白剂(甘草、银杏叶提取物)，这为继续研究螺旋藻中其它活性成分对酪氨酸酶的抑制作用提供了可能。

螺旋藻多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制，将为其应用于皮肤美白、医疗、果蔬保鲜等领域提供可靠的理论依据，也将为综合利用螺旋藻资源和研究安全、经济的酪氨酸酶抑制剂提供新途径。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

一种螺旋藻中的多酚提取物作为酪氨酸酶抑制剂的用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。