专利摘要

本发明公开了一种桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括：步骤一发酵，将桑叶加入纤维素酶产生菌种子液中，恒温振荡培养得到发酵液；提取：步骤二离心发酵液，下层沉淀与盐酸水溶液恒温浸提后离心，取上层提取液；下层沉淀重复上述操作；合并提取液；步骤三纯化，用大孔树脂除杂质，用无水乙醇洗脱1脱氧野尻霉素，减压蒸馏除去无水乙醇，冷冻干燥得到成品1脱氧野尻霉素。本发明提供的一种桑叶中1脱氧野尻霉素的提取方法提取效率高、成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取方法，特别涉及一种纤维素酶产生菌辅助提取桑叶中1-脱氧野尻霉素的方法。

背景技术

现代药理研究表明桑叶有效成分之一多羟基生物碱具有显著的降血糖作用，而1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)为桑叶中主要的生物碱(一种糖苷酶抑制剂)，是降血糖的主要活性成分。此外，1-脱氧野尻霉素还具有抗病毒、抑制肿瘤等功能。目前，1-脱氧野尻霉素的市场价格昂贵（98％纯度1-脱氧野尻霉素约20万元/克），如果其生产成本降低，其应用领域还将进一步扩大。微生物发酵可以产生1-脱氧野尻霉素。目前已经发现枯草杆菌、放线菌等微生物可以发酵产1-脱氧野尻霉素。但是它们的产量较低，一般为0.01g/L左右。由于产量极低，目前仅仅局限于菌株初步筛选和改造，没有开展大规模发酵制备1-脱氧野尻霉素的尝试。利用桑树废弃物为原料生产1-脱氧野尻霉素具有巨大的潜力。其优点在于原料来源丰富，价格低廉，是生产1-脱氧野尻霉素等活性物质的理想原料。因此很有必要建立一种高效的1-脱氧野尻霉素提取方法。

目前桑叶中1-脱氧野尻霉素提取工艺的报道较少，而且提取效率低、成本高。目前1-脱氧野尻霉素的提取多采用溶剂提取法和酸提取法。溶剂提取主要采用乙酸乙酯、乙醇和石油醚等溶剂分部提取；而酸提取法主要采用稀盐酸和稀硫酸提取桑叶中的1-脱氧野尻霉素。乙醇提取率（1-脱氧野尻霉素的提取量×100％/所用桑组织的质量）为0.00139％，蒸馏水提取法提取率为0.00121％，稀酸提取效率为0.00147％。因此，桑树中1-脱氧野尻霉素提取效率较低成为1-脱氧野尻霉素制备的瓶颈问题。

发明内容：

发明目的：本发明的目的是提供了一种提取效率高、成本低的桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取方法。

技术方案：本发明所述的桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括以下步骤：

（1）发酵：将桑叶加入纤维素酶产生菌种子液中，恒温振荡培养得到发酵液；

（2）提取及纯化：采用酸提取法或醇提取法提取发酵液，将所得提取液纯化，得到1-脱氧野尻霉素。

其中，步骤（1）中，所述纤维素酶产生菌种子液由纤维素酶产生菌于产酶培养基中恒温振荡培养制得。为了获得更好的培养效果，采用的培养条件为：培养温度为26～35℃，振荡速度为150～180r/min，培养时间为3～5天。为了使纤维素酶产生菌对桑叶的纤维素充分降解，本发明优化了发酵条件：所述纤维素酶产生菌为里氏木霉(Trichoderma reseei ATCC 26921)、康宁木霉（Trichoderma koningii CICC 13012）、绿色木霉（Trichoderma viride CICC 40502）或黑曲霉(Aspergillus niger DSMZ 821)；所述产酶培养基的配方为：葡萄糖1～3g/L，微晶纤维素2～3g/L，蛋白胨1～2gL，（NH₄）₂SO₄2～3gL，KH₂PO₄3～4gL，尿素0.4～0.6g/L，CaCl₂·2H₂O 0.6～1.0gL,MgSO₄·7H₂O 0.4～0.8gL，FeSO₄·7H₂O 0.7～1.1×10^-2g/L,MnSO₄·H₂O 2.6～4.8×10^-3gL,ZnSO₄·H₂O 2.6～4.0×10^-3gL,CoCl2·6H₂O 5.0～8.0×10^-3g/L，吐温800.3～0.5g/L，其余为水，pH 5.0。每100mL种子液中加入桑叶0.2-1.0g。所述种子液的pH为5.0～7.0，培养温度为28～35℃，振荡速度为150～180r/min，培养时间为6～24h。

步骤（2）中，所述酸提取法包括以下步骤：离心发酵液，下层沉淀与酸水溶液恒温浸提后离心，取上层提取液；下层沉淀重复上述操作；合并提取液。为了提高提取率，本发明优化了提取条件：所述酸水溶液为盐酸水溶液，所述盐酸水溶液的浓度为0.03～0.07mol/L，每100mL盐酸水溶液中加入1-3g沉淀，浸提温度为60-80℃。所述提取液纯化包括以下步骤：提取液加入三氯乙酸水溶液后离心；所得上清液经大孔吸附树脂分离，洗脱剂为无水乙醇；浓缩洗脱液，即得1-脱氧野尻霉素。

有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：本发明提取方法利用纤维素酶产生菌对桑叶进行发酵处理，产生的纤维素酶可以将桑叶中的部分纤维素降解，从而提高了桑叶中1-脱氧野尻霉素提取效率，其提取率达到0.299％，比未经发酵处理的桑叶中的提取率高出27倍。同时，使用纤维素酶产生菌发酵制备1-脱氧野尻霉素，减少了单位产量有机试剂的使用量，是一种绿色环保的提取方法。另外，本发明的提取方法利用纤维素酶产生菌与桑叶为原料，该原料来源丰富，价格低廉。

附图说明

图1为1-脱氧野尻霉素提取液的高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1：用里氏木霉（Trichoderma reseei，ATCC26921，购于中国微生物菌种保藏中心）辅助提取桑叶中1-脱氧野尻霉素，步骤如下：

1、对里氏木霉进行活化

在无菌条件下，将里氏木霉干粉接种至PDA培养基上，28℃恒温静置培养6天。

PDA培养基的配方为：马铃薯200g、蔗糖20g、水1000mL、琼脂20g。

2、对里氏木霉进行扩大培养

在无菌条件下，将里氏木霉从PDA培养基中接种至50mL扩大培养基中，28℃恒温静置培养2天。

扩大培养基的配方为：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，吐温800.5g/L，（NH4）₂SO₄1.4g/L，KH₂PO₄2g/L，尿素0.3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L,MgSO₄·7H2O 0.3g/L,FeSO₄·7H₂O0.005g/L,MnSO₄·H₂O 0.0016g/L,ZnSO₄·H2O 0.0014g/L,CoCl₂·6H₂O 0.0037g/L，pH5.0。

3、种子液的制备

在无菌条件下，从扩大培养基上量取5mL里氏木霉扩大培养液转移至含有50mL的液态产酶培养基中，于转速为180r/min的振荡摇床上30℃恒温培养5天。

产酶培养基的配方为：葡萄糖1.5g/L，微晶纤维素3g/L，蛋白胨2g/L，（NH4）₂SO₄2.8g/L，KH₂PO₄4g/L，尿素0.6g/L，CaCl₂·2H₂O 0.8g/L,MgSO₄·7H2O 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.010g/L,MnSO₄·H₂O 0.0032g/L,ZnSO₄·H₂O 0.0028g/L,CoCl2·6H₂O0.0074g/L，吐温800.5g/L，其余为水，pH 5.0。

4、对桑叶进行发酵处理

将种子液的pH值调至5.0，准确称取0.2g桑叶粉加入种子液中，于转速为180r/min的振荡摇床上30℃恒温培养12h。

5、酸提发酵液

a、将发酵液离心10min，离心机转速为5000r/min,将上清液倾出；

b、下层沉淀加入5mL 0.05mol/L的盐酸溶液涡旋混合1min，70℃恒温水浴浸提20min，离心10min，离心机转速为5000r/min,取上清液即为上层提取液；

c、下层沉淀再加入10mL 0.05mol/L的盐酸溶液同步骤（b）的操作重复提取一次，合并两次提取液并加去离子水定容至50mL。

6、对1-脱氧野尻霉素的提取液进行高效液相层析（HPLC）

取1-脱氧野尻霉素提取液10uL于1.5mL的离心管中加10uL硼酸盐缓冲液（pH8.5），再加入20uL 5mmol/L芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）的乙腈溶液混匀后于20℃水浴反应，以去离子水作为空白对照。20min之后加入10uL 0.1mol/L的甘氨酸溶液,让剩余的衍生化试剂反应，最后加入950uL 0.1％（V/V）的醋酸水溶液混匀后用0.45um的一次性针头过滤器过滤。

色谱条件：色谱柱：HiQSiLC18分析柱（5um,250mm×4.6mm）及ODS3预柱（5um，10mm×4.6mm）；流动相：乙腈-0.1％醋酸（55：45V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm；进样量为10uL。HPLC色谱图见图1。结论：利用菌液辅助提取1-脱氧野尻霉素，提取率可达到0.299％。

7、纯化：

将提取液浓缩离心处理后，加3倍体积的三氯乙酸除去蛋白质；用DH101大孔吸附树脂除杂质，流速为1BV／h过大孔树脂(1BV相当于一个柱床体积)；用10倍体积的无水乙醇洗脱，然后70℃减压蒸馏除去乙醇，得1-脱氧野尻霉素为210mg/L浓缩液；再经过-40℃冷冻干燥,得到成品1-脱氧野尻霉素。

实施例2：用康宁木霉（Trichoderma koningii，CICC 13012）辅助提取桑叶中1-脱氧野尻霉素。

（1）种子液的制备：将康宁木霉于产酶培养基中恒温振荡培养制得康宁木霉种子液，所述产酶培养基的配方为：

葡萄糖13g/L，微晶纤维素3g/L，蛋白胨2g/L，（NH₄）₂SO₄3g/L，KH₂PO₄4g/L，尿素0.6g/L，CaCl₂·2H₂O 1.0g/L,MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，FeSO₄·7H₂O 1.1×10^-2g/L,MnSO₄·H₂O 4.8×10^-3g/L,ZnSO₄·H₂O 4.0×10^-3g/L,CoCl2·6H₂O 8.0×10^-3g/L，吐温800.5g/L，其余为水，pH为7.0；

（2）发酵：将桑叶加入康宁木霉种子液中，每100mL康宁木霉种子液中加入桑叶0.2g，恒温振荡培养得到发酵液，康宁木霉种子液的pH为6.0，培养温度为28～35℃，振荡速度为150～180r/min，培养时间为6h；

（3）提取及纯化：离心发酵液，下层沉淀与盐酸水溶液恒温浸提后离心，所述盐酸水溶液的浓度为0.05mol/L，每100mL盐酸水溶液中加入2g沉淀，浸提温度为70℃，取上层提取液；下层沉淀重复上述操作；合并提取液；提取液加入三氯乙酸水溶液后离心；所得上清液经大孔吸附树脂分离，洗脱剂为无水乙醇；浓缩洗脱液，即得1-脱氧野尻霉素。

实施例3：用绿色木霉辅助提取桑叶中1-脱氧野尻霉素（Trichoderma viride CICC40502）。

（1）种子液的制备：将绿色木霉于产酶培养基中恒温振荡培养制得绿色木霉种子液，所述产酶培养基的配方为：

葡萄糖1g/L，微晶纤维素2g/L，蛋白胨1g/L，（NH₄）₂SO₄2g/L，KH₂PO₄3g/L，尿素0.4g/L，CaCl₂·2H₂O 0.6g/L,MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.7×10^-2g/L,MnSO₄·H₂O2.6×10^-3g/L,ZnSO₄·H₂O 2.6×10^-3g/L,CoCl2·6H₂O 5.0×10^-3g/L，吐温800.3g/L，其余为水，pH为5.0；

（2）发酵：将桑叶加入绿色木霉种子液中，每100mL绿色木霉种子液中加入桑叶1.0g，恒温振荡培养得到发酵液，绿色木霉种子液的pH为7.0，培养温度为28～35℃，振荡速度为150～180r/min，培养时间为24h；

（3）提取及纯化：离心发酵液，下层沉淀与盐酸水溶液恒温浸提后离心，所述盐酸水溶液的浓度为0.03mol/L，每100mL盐酸水溶液中加入1g沉淀，浸提温度为60℃，取上层提取液；下层沉淀重复上述操作；合并提取液；提取液浓缩离心后，加入三氯乙酸水溶液除去蛋白质后再离心；所得上清液经DXA-6大孔吸附树脂分离，洗脱剂为无水乙醇；浓缩洗脱液，即得1-脱氧野尻霉素。

实施例4：用黑曲霉(Aspergillus niger，DSMZ 821)辅助提取桑叶中1-脱氧野尻霉素。

（1）种子液的制备：将黑曲霉于产酶培养基中恒温振荡培养制得黑曲霉种子液，所述产酶培养基的配方为：

葡萄糖1.5g/L，微晶纤维素3g/L，蛋白胨2g/L，（NH4）₂SO₄2.8g/L，KH₂PO₄4g/L，尿素0.6g/L，CaCl₂·2H₂O 0.8g/L,MgSO₄·7H2O 0.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.010g/L,MnSO₄·H₂O 0.0032g/L,ZnSO₄·H₂O 0.0028g/L,CoCl2·6H₂O 0.0074g/L，吐温800.5g/L，其余为水，pH为5.0。

（2）发酵：将桑叶加入黑曲霉种子液中，每100mL黑曲霉种子液中加入桑叶0.6g，恒温振荡培养得到发酵液，黑曲霉种子液的pH为5.0，培养温度为28～35℃，振荡速度为150～180r/min，培养时间为12h；

（3）提取及纯化：离心发酵液，下层沉淀与盐酸水溶液恒温浸提后离心，所述盐酸水溶液的浓度为0.07mol/L，每100mL盐酸水溶液中加入3g沉淀，浸提温度为80℃，取上层提取液；提取液浓缩离心后，加入三氯乙酸水溶液除去蛋白质后再离心；所得上清液经DXA-6大孔吸附树脂分离，洗脱剂为无水乙醇；浓缩洗脱液，即得1-脱氧野尻霉素。

实施例5直接利用盐酸水溶液提取1-脱氧野尻霉素

提取步骤：桑叶→盐酸浸提20min→HPLC分析。本实施例的提取过程和相应参数与实施例1中5-7步骤相同。结论：1-脱氧野尻霉素的提取率为0.010％。

实施例6仅使用纤维素酶辅助提取桑叶中1-脱氧野尻霉素

提取步骤为：桑叶→纤维素酶处理→盐酸浸提20min→HPLC分析。本实施例的提取过程和相应参数与实施例5基本相同，所不同的是桑叶要经过纤维素酶处理，然后再进行盐酸浸提。在纤维素酶处理体系中，纤维素酶的浓度为0.5g/L,pH为0.5，处理时间为12h，体系体积为40mL。结论：1-脱氧野尻霉素的提取率为0.016％。

桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。