专利摘要

本发明公开了一种牡丹籽降血糖肽，其制备方法如下：(1)牡丹籽脱脂粉与水混合均匀，超声搅拌提取蛋白，离心，所得沉淀重复提取两次，合并上层液体并使用1mol/LHCl调节pH至4～4.5，离心，取沉淀进行冷冻干燥，得牡丹籽蛋白；(2)配制1～3％牡丹籽蛋白溶液，使用胰蛋白酶超声辅助酶解，反应结束，沸水浴10～15min进行灭酶，即可得到牡丹籽降血糖肽。本发明进一步提出了上述牡丹籽降血糖肽的纯化方法和应用。本发明利用超声波辅助生物酶法降解牡丹籽蛋白，将其切成多种不同分子量多肽，然后使用超滤、离子交换、葡聚糖凝胶和高效液相色谱进行分离纯化，不仅可以高效的进行酶切反应，获得大量的牡丹籽降血糖肽，并且在纯化过程能够保持多肽活性不丧失，便于生产利用。

权利要求

1.一种牡丹籽降血糖肽，其特征在于，其通过如下方法制备得到：

（1）将牡丹籽榨油之后得到的牡丹籽脱脂粉与水按照料液比1:8~12混合均匀，调节pH至9~9.5，40~60℃下超声搅拌提取蛋白，然后3500~3800 r/min离心10~15min，取上层液体，所得的沉淀按上述方法重复提取两次，合并所得的上层液体，使用1mol/L HCl调节pH至4~4.5，3500~3800r/min离心10~15min，取沉淀进行冷冻干燥，即得牡丹籽蛋白；

（2）配制1~3%牡丹籽蛋白溶液，使用胰蛋白酶酶解，按照加胰蛋白酶5000~125000U/g，pH7.5~8.5，温度35~40℃，超声辅助酶解的时间15~25min，超声波频率22~40kHz，功率50~200W/L，反应结束，沸水浴10~15min进行灭酶，即可得到牡丹籽降血糖肽。

2.权利要求1所述的牡丹籽降血糖肽的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将牡丹籽降血糖肽于8000~10000r/min下离心15~20min，取中层澄清液体，先使用0.46μm或0.22μm滤膜过滤，过滤后进行超滤，先使用10000Da的超滤膜进行初滤，获得分子量在10000Da以下的初滤液，再将初滤溶液使用5000Da的滤膜进行二次超滤，最终获得分子量在5000Da以下的滤液；

（2）采用树脂进行离子交换吸附，静态吸附1h以上，收集洗脱物进行冷冻干燥，得到一级冷冻干燥多肽；

（3）将步骤（2）得到的冷冻干燥多肽配制成水溶液，采用SephadexG-15进行柱层析，收集得到的样品并冷冻干燥，得到二级冷冻干燥多肽；

（4）将得到的二级冷冻干燥多肽使用C-18反相色谱柱分离，得到纯化后的牡丹籽降血糖肽。

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的树脂为732型阳离子树脂、D151大孔阳离子交换树脂、717型阴离子交换树脂中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，采用Sephadex G-15进行柱层析的步骤为：将处理好的Sephadex G-15装入层析柱，径高比1:30~1:45，使用蒸馏水按照2%CV/min流速进行平衡，在下游使用紫外检测器在220nm进行检测；将配好的多肽溶液上样，体积为柱体积的5~10%，待样品完全进入凝胶柱床，使用蒸馏水按照2%CV/min冲洗，220nm检测并收集第二个洗脱峰，其中，CV表示实际的柱容体积。

5.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤（4）中的C-18反相色谱柱分离的步骤为：配制流动相，其中，流动相A为按照体积比超纯水：TFA=99.95: 0.05，流动相B为按照体积比乙腈：TFA=99.95: 0.05，流动相A、B均使用0.22μm滤膜过滤，按照体积比流动相A：流动相B=85:15，流速12%CV/min，检测波长220nm进行检测并收集，其中，CV表示实际的柱容体积。

6.权利要求1所述的牡丹籽降血糖肽或权利要求2所述的纯化方法得到的纯化后的牡丹籽降血糖肽在制备用于降血糖的药品或保健品中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种牡丹籽降血糖肽及其纯化方法和应用。

背景技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病。随着经济水平的飞速发展，人们的饮食越来越好，运动量日趋减少，导致糖尿病的发病率逐年增加。传统的降血糖药包括葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂、胰岛素促分泌剂、中成药、胰岛素、双胍类药物、磺酞脲类药物等，由于药物治疗存在副作用，长期使用患者难以接受。近年来，通过食疗达到控制血糖的方法越来越受到人们的青睐，其中开发新的α-葡萄糖苷酶抑制剂是众多学者的努力方向。

最近有学者以杂色蛤、蚕丝、蛋清和乳清等蛋白为原料，酶解制备具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽。但这些多肽的活性不高，如蚕丝源降血糖多肽中分离出的两个三肽，半抑制剂量分别为2.7mg/mL和1.5mg/mL。因此，研发新型高活性的降血糖肽是本行业重点要解决的难题。

自牡丹籽油被卫生部正式批准成为新型食用油以来，我国油用牡丹的种植面积逐年递增，榨油后的牡丹籽粕产量也不断增加，其中粗蛋白约占牡丹籽粕的28.34％(W/W)。牡丹籽蛋白含有18种天然氨基酸，其中8种人体必须氨基酸占30.44％，营养比例合理，具有极大的开发前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种牡丹籽降血糖肽及其纯化方法，采用超声波辅助酶解牡丹籽蛋白，通过超滤、离子交换树脂、葡聚糖凝胶进行分离纯化，得到高活性的降血糖肽。不仅为牡丹籽的综合利用提供新方法，更为重要是获得一种新型、高活性的降血糖肽，为广大糖尿病患者带来福音。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明的牡丹籽降血糖肽通过如下方法制备得到：

(1)将牡丹籽榨油之后得到的牡丹籽脱脂粉与水按照料液比1:8～12混合均匀，调节pH至9～9.5，40～60℃下超声搅拌提取蛋白，然后3500～3800r/min离心10～15min，取上层液体，所得的沉淀按上述方法重复提取两次，合并所得的上层液体，使用1mol/L HCl调节pH至4～4.5，3500～3800r/min离心10～15min，取沉淀进行冷冻干燥，即得牡丹籽蛋白；

(2)配制1～3％牡丹籽蛋白溶液，使用胰蛋白酶酶解，按照加胰蛋白酶5000～125000U/g，pH7.5～8.5，温度35～40℃，超声辅助酶解的时间15～25min，超声波频率22～40kHz，功率50～200W/L，反应结束，沸水浴10～15min进行灭酶，即可得到牡丹籽降血糖肽。

在一个优选的实施例中，通过如下方法制备得到牡丹籽降血糖肽溶液：

a.将原料与蒸馏水混匀，使用1mol/L的NaOH调节溶液pH至9.5，50℃水浴超声间歇搅拌提取蛋白2h，3800r/min离心15min，所得沉淀再次提取两次，所得上层液体使用1mol/LHCl调节pH至4.5，3800r/min离心15min，取沉淀进行冷冻干燥，即可获得牡丹籽蛋白。

b.配制1～3％牡丹籽蛋白溶液，使用胰蛋白酶按照加胰蛋白酶5000～125000U/g，pH7.5～8.5，温度35～40℃，超声辅助酶解的时间15～25min，超声波频率22～40kHz，功率50～200W/L，反应结束，沸水浴10min进行灭酶，即可得到牡丹籽多肽溶液。

本发明进一步提出了上述牡丹籽降血糖肽的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将牡丹籽降血糖肽8000～10000r/min离心15～20min，取中层澄清液体，先使用0.46μm或0.22μm滤膜过滤，过滤后进行超滤，先使用10000Da的超滤膜进行初滤，获得分子量在10000Da以下的初滤液，再将初滤溶液使用5000Da的滤膜进行二次超滤，最终获得抑制率最好的分子量在5000Da以下滤液；

(2)采用树脂进行离子交换吸附，静态吸附1h以上，收集洗脱物进行冷冻干燥，得到一级冷冻干燥多肽；

(3)将步骤(2)得到的冷冻干燥多肽配制成水溶液，采用Sephadex G-15进行柱层析，收集得到的样品并冷冻干燥，得到二级冷冻干燥多肽；

(4)将得到的二级冷冻干燥多肽使用C-18反相色谱柱分离，得到纯化后的牡丹籽降血糖肽。

优选地，步骤(2)中，所述的树脂为732型阳离子树脂、D151大孔阳离子交换树脂、717型阴离子交换树脂中的任意一种。更优选地，采用732型吸附率最高，效果最好.

具体地，使用732型吸附的优选步骤为：将处理好的732钠型阳离子树脂装入层析柱，使用蒸馏水以流速2％CV/min进行平衡，在下游使用紫外检测器在220nm进行检测，直至基线平稳，加入5000kD超滤溶液流经树脂床，待到树脂下方也变成红色，使用蒸馏水以流速2％CV/min冲洗树脂，220nm基线平稳即可，换用0.5～2％(v/v)氨水按照2％CV/min进行洗脱，220nm检测，收集第二个洗脱峰进行冷冻干燥，其中，CV表示实际的柱容体积。

优选地，步骤(3)中，采用Sephadex G-15进行柱层析的步骤为：将处理好的Sephadex G-15装入层析柱，径高比1:30～1:45，使用蒸馏水按照2％CV/min流速进行平衡，在下游使用紫外检测器在220nm进行检测；将配好的多肽溶液上样，体积为柱体积的5～10％，待样品完全进入凝胶柱床，使用蒸馏水按照2％CV/min冲洗，220nm检测并收集第二个洗脱峰，CV表示实际的柱容体积。

优选地，步骤(4)中的C-18反相色谱柱分离的步骤为：配制流动相，其中，流动相A为按照体积比超纯水：TFA＝99.95:0.05，流动相B为按照体积比乙腈：TFA＝99.95:0.05，流动相A、B均使用0.22μm滤膜过滤，按照体积比流动相A：流动相B＝85:15，流速12％CV/min，检测波长220nm进行检测并收集，CV表示实际的柱容体积。

更近一步地，本发明提出了上述的牡丹籽降血糖肽或经纯化得到的纯化后的牡丹籽降血糖肽在制备用于降血糖的药品或保健品中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明通过对牡丹籽榨油之后的牡丹籽粕进行超声波复合酶解，并进行分离纯化，制备新型、高活性的牡丹籽降血糖多肽。传统酶解蛋白质需要的反应时间长，且效率低下，费时费力。本发明使用超声波辅助酶解，不仅可以实现缩短反应时间，并且可以增加产物得率。

(2)超滤技术是一种以压力为推动力的膜分离技术，按照物质分子量的大小将大分子与小分子的物质分离，操作简单便捷、成本低廉、不增加任何化学试剂、不引起大分子物质的变性失活，并且具有单位容器内充填密度高，占地面积小等优点。本申请采用超滤技术，最大限度保证多肽初步分离之后的活性。

(3)732型阳离子交换树脂具有处理能力大，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低等优势，适合工业化生产需求，D151大孔阳离子交换树脂具有孔径与比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长等优点，满足工业生产需要。717型阴离子交换树脂具有再生效率高、碱水耗低、交换容量大、抗有机物污染及抗氧化能力强、机械强度好等优点，适合工业生产要求。Sephadex系列是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒，其中G-15分离物质的分子量小于1500Da，在这个分子量范围内适用于脱盐、肽和其他小分子的分离。优点在于Sephadex G-15属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件很温和，对分离成份的理化性质、活性都有很好的保持。在此处主要利用其条件温和按照分子量大小进行分离并且活性保持好的优点。

(4)本发明中使用高效液相分离的方法，可以制备出纯度较高的目标产物多肽，极具应用前景。目前我国正在进入老龄化社会，糖尿病是老年人群的高发病和常发病，并且有着向低龄化迈进的趋势，因此对于降低血糖类食品的研发刻不容缓。生物产业的蓬勃发展，对于牡丹籽降血糖肽的推广有很好的促进作用，后续加工制成胶囊、片剂或者饮料、饮品类等产品。

附图说明

图1为本发明牡丹籽降血糖肽的制备即纯化流程示意图；

图2为经732钠型阳离子树脂柱层析后的多肽溶液的紫外检测示意图；

图3为Sephadex G-15柱层析后得到的多肽溶液的紫外检测示意图；

图4为C-18反相色谱柱分离后得到的多肽溶液的HPLC示意图。

具体实施方式

如图1所示，本发明提供了一种牡丹籽降血糖肽及其纯化方法，包括牡丹籽蛋白的制备、多肽酶解液的制备，并进一步通过超滤收集分子量小于5000的多肽，然后依次用离子交换树脂分离、葡聚糖凝胶分离和液相分离，得到纯化的牡丹籽降血糖肽。

下面通过具体的实施例详细说明本发明。其中，下述实施例中，CV表示实际的柱容体积；氨水浓度为体积分数(V/V)。

实施例1

将原料与蒸馏水按照料液比1:10进行配比，搅拌15min使其充分混匀，用1mol/LNaOH调节溶液pH至9.5，50℃水浴超声2h，3800r/min离心15～20min，所得沉淀再次提取两次，合并所得上层液体使用1mol/L HCl调节pH至4.5，3800r/min离心15～20min，取沉淀进行冷冻干燥，即可获得牡丹籽蛋白。

实施例2～13

酶解反应条件为：配制浓度牡丹籽蛋白溶液1～3％、加酶量5000～12500U/g、pH7.5～8.5、温度35～40℃、时间15～25min，超声波频率28kHz，功率100W/L，酶解反应结束后沸水浴10min，即可得到牡丹籽多肽酶解液。

体外降血糖测定方法：

(1)鼠源性α-葡萄糖苷酶制备

脱臼处死小鼠，用0℃生理盐水洗去杂物，液氮研磨。将PBS与研磨粉混合，按照体积质量比10:1配比，涡旋提取60s，4℃8000r/min离心15min，取上清。

(2)α-葡萄糖苷酶抑制率检测方法

水浴37℃反应15min，405nm处检测吸光值；

抑制率计算方法如下：

(3)所需试剂

PBS：0.05mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液

pNPG溶液：准确称取50mg的pNPG(对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)，溶于10mLPBS。

酶溶液：提取鼠源性酶溶液在1.6mLPBS+0.2mLpNPG+0.2mL酶溶液反应体系中，水浴37℃反应15min，OD405在0.4～0.45之间。

检测结果如表1所示：

表1不同制备条件下的降血糖肽活性

由上表1可知实施例13所得酶解多肽液的抑制效果最好，因此选择实施例13进行进一步分离纯化。

实施例14

将实施例13所得到多肽酶解液8000r/min离心15min，取中层澄清液体，0.46μm滤膜过滤，滤膜过滤之后在使用超滤设备进行超滤，先使用10000Da的超滤膜进行初滤，再将初滤溶液使用5000Da的滤膜进行二次超滤，最终选取抑制率最好的5000Da以下滤液保存待用；

实施例15～17

将处理好的732型阳离子树脂、D151大孔阳离子交换树脂、717型阴离子交换树脂分别进行静态吸附，吸附1h之后分别测定吸附率，如表2所示。

表2不同类型树脂的静态吸附率

实施例18～21

称取1g处理好的732型阳离子树脂装入层析柱，使用蒸馏水平衡冲洗3CV，在下游使用紫外检测器220nm进行检测，再将5000kD超滤溶液按照2％CV/min流经树脂柱，待到树脂柱下方出样口也变成红色，更换成蒸馏水，进行冲洗，按照2％CV/min冲洗树脂，220nm紫外检测数值不再波动为止，换用0.5、1.0、1.5、2.0％浓度氨水作为洗脱液进行洗脱，结果如表3所示：

表3不同浓度氨水的洗脱率

实施例22

处理好的732型阳离子树脂装入层析柱，使用蒸馏水按照流速2％CV/min流速冲洗，下游使用紫外检测器在220nm进行检测，将实施例14中制备的分子量小于5000kD超滤液按照流速0.2％CV/min流经树脂柱，随着多肽被吸附，树脂柱变为红色，待到柱下方出样口树脂也变红，使用蒸馏水按照流速0.2％CV/min冲洗树脂，冲洗1CV之后220nm紫外检测数值不再波动；使用2％浓度氨水按照流速0.2％CV/min洗脱被吸附多肽，220nm检测，收集所出现如图2中的第二个洗脱峰，冷冻干燥，得到冻干产物。

实施例23

将实施例22中冷冻干燥得到的多肽样品配制成50mg/mL溶液；将处理好的SephadexG-15装入层析柱，径高比为1:40，使用蒸馏水按照0.2％CV/min流速进行平衡，在下游使用紫外检测器在220nm进行检测；将配好的多肽溶液上样，体积为柱体积7.5％，使用蒸馏水按照流速0.2CV/min进行冲洗，220nm检测并收集如图3中的第二个洗脱峰，冷冻干燥，得到冻干产物。

实施例24

将实施例23冻干产物配置成25mg/mL溶液备用；按照超纯水、TFA(三氟乙酸)、乙腈的体积之比来配置流动相，流动相A超纯水：TFA＝99.95:0.05，流动相B乙腈：TFA＝99.95:0.05，流动相A、B均使用0.22μm滤膜过滤，按照体积之比流动相A：流动相B＝85:15，流速12％CV/min，检测波长220nm，柱温30℃，C-18反相色谱柱进行分离；分离结果如图4所示，收集2号峰的物质，冷冻干燥即获得我们所需要的降血糖多肽，IC50为47.256μg/mL。

本发明利用超声波辅助生物酶法降解牡丹籽蛋白，将其切成多种不同分子量多肽，然后使用超滤、离子交换、葡聚糖凝胶和高效液相色谱进行分离纯化。不仅可以高效的进行酶切反应，获得大量的牡丹籽降血糖肽，并且在纯化过程能够保持多肽活性不丧失，可以很好的生产利用。同时，本发明通过超声波辅助牡丹籽蛋白酶解制备牡丹籽降血糖肽，不仅可以大大提高了牡丹籽的综合利用，增加其经济价值，并且提供了一种具有高度活性的新型降血糖肽。

一种牡丹籽降血糖肽及其纯化方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。